21 Tùy theo phƣơng pháp precolumn hay postcolumn mà ta có thể sử dụng pha động, pha tĩnh, cột cũng nhƣ điều chỉnh bƣớc sóng phát hiện và detector phù hợp. Khi đó thời gian phát hiện cũng khác nhau. Nếu là PTC-aa thƣờng đƣợc phân tách trên cột cilica C18, hoặc Pico -Tag của sắc ký ngƣợc pha; pha động thƣờng là acetonitrile; bƣớc sóng phát hiện ở 254nm và tất cả các aa thƣờng đƣợc phát hiện khoảng 12 phút.không kể thời gian rửa cột hay thời gian thêm để tạo cho đƣờng nền trở lại. 2.5.4. Phân tích và tính toán dữ liệu [10] 2.5.4.1. Định tính Để phát hiện đƣợc các amino acid, phƣơng pháp thông thƣờng là dựa vào thời gian lƣu của chuẩn đã đƣợc thực hiện chạy sắc ký trƣớc. sau đó, thời gian lƣu của mẫu đƣợc so sánh với chuẩn này và từ đo xác định từng amino acid tƣơng ứng với từng diện tích peak để định lƣợng. 2.5.4.2. Định lƣợng Thành phần của từng amino acid đƣợc thể hiện bằng phần trăm về số mol (mol%) so với tất cả những phần khác trong mẫu protein hay peptide. Chẳng hạn nhƣ nếu protein có 5 nmol Ala tổng số tất cả các amino acid trong protein là 200 nmol kể cả Ala thì phần trăm số mol của Ala là 2.5. Kết quả thu đƣợc sẽ tạo nên một profile riêng biệt đối với tất cả các amino acid trong một protein hay peptide cụ thể. 2.6. Phân tích amino acid trên nấm bào ngƣ Thành phần amino acid trên nấm bào ngƣ đã đƣợc tiến hành phân tích từ rất lâu, nhất là khi kỹ thuật sắc ký ra đời. .Năm 1962, Zakia Bano và cộng sự, viện nghiên cứu công nghệ thực phẩm Mysore, Ấn Độ đã tiến hành phân tích trên sắc ký giấy tròn. Và ông đã phát hiện trong nấm này chứa đến 17 amino acid. Trong đó hiện hiện đầy đủ 10 amino acid cần thiết [15]. 22 L: lycine IL:Isoleucine Ph Al: Phenylalanine Glu: Glutamic acid Thr: Threonine Ser: Serine Gly: Glycine Asp: Aspartic acid Arg: Agrinine, Pep: Peptide Lys:Lysine, His: Histidine Cys: Cysteine Hình 2.12. Kết quả phân tích amino acid trên Pleurotus sp bằng sắc ký giấy tròn (Zakia Bano, 1962) 23 PHẦN 3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1.Thời gian, địa điểm thực hiện và vật liệu nghiên cứu 3.1.1. Thời gian thực hiện Khóa luận đƣợc thực hiện từ ngày 14/2/2005 đến ngày18/8/2005. 3.1.2. Địa điểm Trung tâm Công Nghệ Sinh Học, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. Phòng Hóa Lý, Trung tâm Phân Tích Thí nghiệm Hóa Sinh, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh. 3.1.3. Vật liệu nghiên cứu Giống nấm Pleurotus floridanus Pleurotus sajor – caju Pleurtus abalonus Pleurotus pulmonarius Pleurotus flabellatus Nguồn cung cấp Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh Viện hạt nhân Đà Lạt (Lê Viết Ngọc) Viện hạt nhân Đà Lạt (Lê Viết Ngọc) 3.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 3.2.1. Hóa chất HCl 6N Phenol PITC (phenylisothiocyanate). Methanol Ethanol Nƣớc khử ion TEA (Triethylamine) Chuẩn hỗn hợp 17 amino acid ACN (Acetonitril). Glucose Saccharose KH 2 PO 4 MgSO 4 Sodium acetate HNO 3 đậm đặc EDTA 24 3.2.2. Thiết bị và dụng cụ Thiết bị Tủ cấy vô trùng Tủ sấy Tủ mát Nồi hấp khử trùng Máy HPLC Thiết bị thổi khí trơ Cột Pico-Tag Dụng cụ Ống nghiệm Đĩa petri Φ 9 cm Bình tam giác Bình quả lê Pipett 0.1-10 µl Pipett 10-100 µl Filter Φ 0.20 µm 3.3. Phƣơng pháp nhân giống và trồng nấm 3.3.1. Môi trƣờng Môi trƣờng thạch (PGA) Khoai tây Glucose Agar Môi trƣờng hạt Cám gạo CaCO 3 Lúa Môi trƣờng giá môi Khoai mì Cám gạo KH 2 PO 4 MgSO 4 CaCO 3 Môi trƣờng giá thể Mùn cƣa Cám gạo KH 2 PO 4 MgSO 4 25 3.3.2. Phƣơng pháp 3.2.2.1. Chuẩn bị môi trƣờng PGA - Khoai tây bóc vỏ, rửa sạch. Cân 200 g, đun sôi, lọc lấy nuớc. - Thêm 20 g agar, cho thêm nƣớc cất để đủ 1 lít, đun tan agar. - Cho vào ống nghiệm (khoảng 1/5 so với chiều cao ống nghiệm), đậy nút bông. - Hấp khử trùng ở 121 o C, 1.2 atm, trong 20 phút. - Lấy ra, để nghiêng chuẩn bị cho cấy chuyền. - 5 dòng nấm bào ngƣ sau khi đem về phòng thí nghiệm, đƣợc tiến hành cấy chuyền sang môi trƣờng thạch nghiêng PGA 3.2.2.2. Chuẩn bị môi trƣờng hạt - Lúa đƣợc đun sôi, nứt nanh, trộn với CaCO 3 (2%) , cám gạo (10%). - Cho vào bình tam giác, hoăc bình thủy tinh, hấp khử trùng ở 121 o C, 1,2 atm, trong 90 phút. - Khi tơ nấm phát triển đầy ống nghiệm, chúng sẽ đƣợc cấy sang môi trƣờng hạt. đem để trong bóng tối. Tùy theo mỗi loài mà thời gian phát triển đầy bình sẽ khác nhau. Trong quá trình đó, chuẩn bị môi trƣờng giá môi. 3.3.2.3. Chuẩn bị môi trƣờng giá môi - Cọng mì đƣợc cắt khoảng 15 – 20 cm, tùy theo kích thƣớc của túi ny lông, ngâm khoảng 24 giờ, trộn với một số hóa chất khác nhƣ KH 2 PO 4 , MgSO 4 với tỉ lệ nhất định ( 2% đối với MgSO 4 và 1 % đối với KH 2 PO 4 ). - Hấp khử trùng ở 121 o C , 1,2 atm trong 90 phút. - Khi tơ nấm phát triển đầy bình tam giác, tạo ra màu trắng mịn trong bình, cấy sang môi trƣờng giá môi. 3.2.2.4. Chuẩn bị môi trƣờng nuôi trồng - Mùn cƣa đƣợc sàn lọc loại bỏ rác và những mảnh có kích thƣớc lớn. - Ngâm trong nƣớc vôi 5% trong 24 giờ - Bổ sung cám gạo, bột bắp, cho vào túi ny lông hoặc bình thủy tinh. - Hấp khử trùng trong 90 phút, 1atm, 121 o C để 2 ngày sau hấp khử trùng tiếp nhƣ lần thứ nhất. 26 - Cấy giống từ môi trƣờng giá môi sang. - Ủ trong tối, khi nào thấy tơ phát triển đầy trắng , phủ kín bịt phôi, có những giọt nƣớc li ti trên thành túi thì tiến hành cắt túi bằng dụng cụ đã khử trùng. - Đem ra nhà nuôi trồng, tƣới và đón nấm - Nấm sau khi hái, đƣợc cân tính trọng lƣợng tƣơi, sau đó đem sấy khô, bảo quản trong tủ lạnh, để chuẩn bị cho phân tích amino acid. - Tiếp tục tƣới và đón nấm. - Sau khi hái nấm lần hai, nấm lƣợng nấm cũng đƣợc đem cân trọng lƣợng tƣơi, cơ chất đem sấy khô, tính trọng lƣợng của chúng. - Tính năng suất sản phẩm. - Tất cả nấm hái đƣợc đem đo đƣờng kính để tính trung bình. 3.2.2.5. Tóm tắt quy trình [1, 2] Tƣới đón nấm Thu quả thể Môi trƣờng hạt - Lúa nấu (88 %) - CaCO 3 (2%) - Cám gạo (10%) Môi trƣờng giá môi - Cọng mì (87 %) - MgSO 4 ( 2%) - KH 2 PO 4 (1 %) - Cám gạo (10 %) - Mùn cƣa (84 %) - Cám gạo (10 %) - Bột bắp (5,5 %) - KH 2 PO 4 (0,5 %) Giá thể trồng Giống nấm - Khoai tây 200 g / lít - Glucose 20 g / lít - Agar 20 g / lít Cấy sang môi trƣờng giá môi ủ trong tối 27 3.3.3. Phân tích amino acid Mẫu nấm sau khi thu hoạch đƣợc đem phân tích thành phần amino acid. Chúng tôi tiến hành phân tích 2 trên 4 mẫu: Pleurotus pulmonarius, Pleurotus flabellatus. Quá trình phân tích thành phần amino acid trong 2 loại nấm trên đƣợc thực hiện theo quy trình Thomas T. Andersen và cộng sự. 3.3.3.1.Thủy phân mẫu - Cho 2 g mẫu đã đƣợc cắt nhỏ vào tube chịu nhiệt và làm khô. - Thêm vào 10 ml dung dịch HCl 6N. - Loại bỏ không khí bằng cách thổi khí trơ vào khoảng không của tube đựng dung dịch mẫu. - Thủy phân ở 152 o C trong 1h. - Lấy ra, để nguội, lọc qua giấy lọc. - Cho vào lọ, dán nhãn và để trong tủ mát. Với nhiệt độ cao và trong điều kiện acid có nồng độ cao (HCl 6N), các protein sê đƣợc phân cắt thành những amino acid đơn (Hình 2.10). 3.3.3.2. Tạo dẫn xuất Khi phân tích thành phần amino acid trên HPLC, mẫu phải đƣợc tạo dẫn xuất với PITC để có thể phát hiện thông qua detector. Quá trình tạo dẫn xuất đƣợc thực hiện nhƣ sau: - Hút 2µl mẫu cho vào bình quả lê có đáy nhọn. - Làm khô bằng hỗn hợp dung dịch ethanol, nƣớc và TEA với tỷ lệ tƣơng ứng 2:2:1. Quá trình này đƣợc thực hiện trong điều kiện có thổi khí trơ để loại bỏ những acid còn thừa lại trong quá trình thủy phân cũng nhƣ giúp cho PITC có thể bắt với từng amino acid dễ dàng hơn. Bởi vì dƣới tác động của phức hợp này đăc biệt là TEA giúp cho những amino sẽ bị khử 1 proton, khi đó PITC sẽ gắn vào. - Mẫu đƣợc tạo dẫn xuất với dung dịch ethanol: nƣớc: TEA: PITC = 7:1:1:1 khoảng 5 đến 10 phút ở trong tối. Khi đó PITC sẽ gắn vào đầu amin của các amino acid (Hình 2.11), Theo Molnar-Perl, (1994), phản ứng gắn này rất bền, nếu bảo quản trong điều kiện lạnh chúng sẽ ổn định ít nhất 6 tháng). 28 - Mẫu phân tích đƣợc đem đi thổi khô với khí trơ. Bƣớc quan trọng nhất trong quá trình tạo dẫn xuất là loại bỏ những tác nhân sau khi dẫn xuất. Điều này đƣợc thực hiện trong điều kiện chân không thổi khí trơ hoặc trích với heptane (Thomas T. Andersen, 1995). Với điều kiện phòng thí nghiệm chúng tôi tiến hành bằng phƣơng pháp thổi khô với khí trơ. Nếu PITC không đƣợc loại thải tốt thì nó sẽ làm hƣ cũng nhƣ phá hủy cột HPLC. - Mẫu đƣợc pha loãng trong 2 ml dung dịch pha loãng trong mẫu và đƣợc lọc qua bộ phận lọc đƣờng kính 20 µm để chuẩn bị cho phân tích HPLC. 3.3.3.3. Phân tích HPLC Quá trình thực hiện phân tách trên HPLC đƣợc thực hiện với: Buffer A: sodium acetate và TEA, pH 6,8. Buffer B: 60% acetonitile, nƣớc 40% (v/v). Cột: Pico- Tag, 3.9 mm x 15 cm. Detector: Ultra-violet (UV). Tốc độ dòng: 1 ml / phút. Bƣớc sóng: 254 nm. Quá trình thực hiện: - Hút 20 µl dung dịch chuẩn 17 amino acid, bơm và theo dõi. - Lƣu lại các thông số cần thiết để tiến hành định tính cũng nhƣ định lƣợng (thời gian lƣu, diện tích peak,…) - Hút 20 µl mẫu, tiến hành tƣơng tự nhƣ đối với chuẩn. 3.3.3.4. Phân tích và tính toán kết quả Sau khi bơm chuẩn, ta sẽ có những dữ liệu thu từ máy tính nhƣ là thời gian phát hiện peak, diện tích của từng peak thể hiện trên sắc ký đồ. Các thông số này đƣợc lƣu lại để tính hay để định lƣợng cho mẫu phân tích. Có rất nhiều cách để định lƣợng amino acid đơn: Dùng chuẩn với các nồng độ khác nhau, sau đó lập phƣơng trình hồi quy giữa diện tích peak và nồng độ với hệ số tƣơng quan xác định. Từ diện tích peak của mẫu đã biết qua quá trình chạy ta có thể tính nồng độ tƣơng ứng cho từng amino acid. Đây là phƣơng pháp chính xác nhất để tính nồng độ các amino acid. 29 Chỉ bơm chuẩn 1 lần, ghi lại các diện tích peak thu đƣợc trên sắc ký đồ sau khi phân tích kết thúc. Sau đó lặp tỷ lệ giữa diện tích peak và nồng độ của chuẩn và mẫu, từ đó tính đƣợc nồng độ từng amino acid trong mẫu. 30 PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả trồng nấm 4.1.1. Sự tăng trƣởng của hệ sợi trên các môi trƣờng Sau khi chúng tôi thực hiện nuôi trồng theo quy trình ở mục 3.2.2.5, chúng tôi đạt đƣợc một số kết quả trình bày ở bảng 4.1. Nhận xét: Tất cả các loài nấm đều đƣợc thực hiện đều đƣợc tiến hành trên các thiết bị giống nhau tƣơng ứng với từng môi trƣờng (môi trƣờng lúa trong bình tam giác, môi trƣờng cọng mì trên túi ny lông) khi chuyển sang môi trƣờng nuôi trồng, chúng tôi thực hiện Pleurotus floridanus, Pleurotus abalonus trên túi ny lông, đồng thời với hai loại Pleurotus flabellatus, Pleurotus pulmonarius chúng tôi thực hiện trên những lọ bằng thủy tinh. Vì thế, chúng tôi chỉ so sánh trên hai môi trƣờng đầu với 4 dòng nấm còn môi trƣờng nuôi trồng chúng tôi phân ra từng cặp để so sánh. Với kết quả thu đƣợc (Bảng 4.1), chúng tôi nhận thấy rằng: Thời gian tăng trƣởng trên môi trƣờng hạt của Pleurotus abalonus là chậm nhất, kế đến là Pleurotus floridanus; Pleurotus flabellatus và Pleurotus pulmonarius có thời gian tăng trƣởng tƣơng đƣơng nhau. Cả 3 dòng nấm Pleurotus floridanus; Pleurotus flabellatus và Pleurotus pulmonarius đều có hệ sợi tơ trắng nhƣng Pleurotus floridanus thì trắng hơn và hệ sợi không thƣa nhƣ hai dòng còn lại (Hình 4.1) Khi cấy sang môi truờng giá môi, thì kết quả cũng giống nhƣ trên môi trƣờng hạt, thời gian sinh trƣởng của Pleurotus abalonus vẫn là chậm nhất. Và trên môi trƣờng này, thì nấm này vẫn khác so với các nấm còn lại là trên đầu mỗi sợi nấm có màu đen, trong đó chứa các bào tử.( Hình 4.2 và Hình 4.3). Bảng 4.1. Thời gian lan tơ đầy của các dòng nấm Dòng nấm Môi trƣờng lúa Môi trƣờng giá môi Môi trƣờng nuôi trồng Pleurotus pulmonarius Pleurotus flabellatus Pleurotus floridanus Pleurotus abalonus 15 ngày 15 ngày 18 ngày 30 ngày 17 ngày 18 ngày 20 ngày 40 ngày 25 ngày 27 ngày 30 ngày 40 ngày . đón nấm Thu quả thể Môi trƣờng hạt - Lúa nấu (88 %) - CaCO 3 (2 %) - Cám gạo (10 %) Môi trƣờng giá môi - Cọng mì (87 %) - MgSO 4 ( 2 %) - KH 2 PO 4 (1 %) - Cám gạo (10 %) - Mùn. lycine IL:Isoleucine Ph Al: Phenylalanine Glu: Glutamic acid Thr: Threonine Ser: Serine Gly: Glycine Asp: Aspartic acid Arg: Agrinine, Pep: Peptide Lys:Lysine, His: Histidine Cys: Cysteine. lƣu của mẫu đƣợc so sánh với chuẩn này và từ đo xác định từng amino acid tƣơng ứng với từng diện tích peak để định lƣợng. 2.5 .4. 2. Định lƣợng Thành phần của từng amino acid đƣợc thể hiện bằng