30 Máy chụp ảnh (DNA photography equipment) (Biorad). Máy thermal cycle (thực hiện phản ứng PCR). Thành phần hoá chất và chu kỳ phản ứng PCR Thành phần hóa chất của phản ứng PCR: Thành phần hóa chất (bảng 2.2): dNTP, 10X PCR buffer, MgCl 2 , primers, Taq polymerase. Nước cất: thêm vào cho đủ một phản ứng PCR (25 l). Khuôn mẫu DNA: sử dụng 1 l DNA cho phản ứng PCR 25 l. Bảng 3.1: Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR. Thành phần Liều lượng phản ứng ( l) Nồng độ đầu Nồng độ cuối dNTP 0,5 10 mM 0,2 mM 10X PCR buffer 2,5 10 X 1 X MgCl 2 1 25mM 1 mM ITS A 1 25pM/ l 25pM ITS B 1 25 M 0,5 M Taq polymerase 0,1 5U Khuôn mẫu 1 Nước cất vừa đủ phản ứng 25 l Phản ứng PCR được thực hiện theo quy trình của Silva và cộng sự năm 1998. Chu kỳ của phản ứng PCR: tổng cộng có 41 chu kỳ (Siva và cộng sự, 1998) - Chu kỳ 1: Biến tính: 94 C 3phút. Bắt cặp: 51 C 1 phút. Kéo dài: 72 C 1 phút. - 39 chu kỳ tiếp theo. Biến tính: 94 C 3 phút. Bắt cặp: 51 C 1 phút. 31 Kéo dài: 72 C 1 phút - 1 chu kỳ cuối: Biến tính: 94 C 1phút. Bắt cặp: 51 C 1 phút. Kéo dài: 72 C 9 phút. Tùy theo sản phẩm PCR thu đƣợc, các điều kiện của phản ứng PCR sẽ đƣợc điều chỉnh để thu đƣợc sản phẩm PCR tối ƣu nhất dùng trong các phân tích tiếp theo. 94 C 94 C 94 C 72 C 72 C 72 C 54 C 54 C 54 C (1X) (39X) (1X) Hình 3.1: Hình minh họa chu trình nhiệt của phản ứng PCR dùng trong thí nghiệm. 3.2.2.4. Đọc kết quả phản ứng PCR Sản phẩm PCR sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose. - Cho 0,15g agarose vào 15 ml dung dịch TAE 0,5X (nồng độ 1%). - Đun sôi khoảng 1- 2 phút trong lò vi sóng. - Để nguội đến 40 – 50 C ở nhiệt độ phòng. - Đổ gel vào bể điện di (đặt lược vào giếng trước khi đổ gel), chú ý không để bọt khí trên gel. - Để nguội khoảng 30 phút, cho gel đông cứng, rút lược khỏi gel, đặt bản gel vào bể điện di sao cho gel ngập trong dung dịch TAE từ 1 – 1,5 cm. 32 - Trộn 3 l sản phẩm PCR với 1,5 l loading dye 6X trên mặt giấy parafin. Cho hỗn hợp vào giếng của gel, bao gồm giếng thang chuẩn, giếng đối chứng và giếng chứa mẫu. - Vận hành máy điện di ở hiệu điện thế 50V. Sau khi hoàn tất quá trình điện di, bản gel được lấy ra khỏi bồn điện di và nhuộm trong dung dịch ethidium bromide trong khoảng 15 – 20 phút và chụp ảnh gel bằng máy chụp gel (Biorad). 3.2.3. Phân tích sản phẩm PCR bằng các enzyme cắt giới hạn (RE) Sản phẩm PCR thu được sẽ được phân tích bằng các enzyme cắt giới hạn để xem xét có sự khác biệt về di truyền giữa các mẫu phân tích hay không. 3.2.3.1. Hóa chất và dụng cụ dùng trong phân tích RFLP sản phẩm PCR - Các enzyme cắt giới hạn EcoRI, MspI, CfoI, HaeIII, Sau3A, RsaI (Roche, Germany). - Sản phẩm PCR vùng ITS của nấm C. cassiicola. - Bồn ủ nhiệt, gel agarose, máy điện di (Biorad), máy chụp gel (Biorad). - Dung dịch ethidium bromide . - Đầu tip 10 l, 100 l, eppendorf 0,2 ml. 3.2.3.2. Thành phần hóa chất của phản ứng RFLP Sản phẩm PCR sẽ được phân cắt riêng rẽ bằng các enzyme EcoRI, MspI, CfoI, HaeIII, RsaI, Sau3AI (Roche, Germany). Thành phần của một phản ứng RFLP như sau (xem thêm bảng 3.3). - Enzyme : 1 đơn vị enzyme. - Enzyme buffer: 2,5 l. - Sản phẩm PCR: 8 l. - Nước: thêm vào cho đủ một phản ứng (25 l). Bảng 3.2: Thành phần hóa chất của phản ứng RFLP. Thành phần Liều lượng phản ứng ( l) Nồng độ đầu Nồng độ cuối Enzyme Buffer enzyme Sản phẩm PCR Nước 0,1 2,5 8 10 U/ l 10 X 1U 1X 33 vừa đủ phản ứng 25 l Phản ứng cắt của enzyme được thực hiện bằng cách ủ mẫu với các thành phần như trên trong bồn ủ nhiệt, điều kiện nhiệt độ 37 C trong thời gian 3-14 giờ, sau đó tiến hành bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 65 C trong thời gian 15 phút (tùy theo mỗi enzyme mà có hay không có bước này). Sự khác biệt về di truyền giữa các mẫu nghiên cứu được thể hiện khi kích thước của sản phẩm sau phản ứng khác nhau ở các mẫu. Kiểm tra sự khác biệt về kích thước của sản phẩm cắt bằng cách điện di trên gel agarose 2% - 3%(w/v) và quan sát kích thước của các đoạn DNA tạo thành bằng cách nhuộm gel bằng ethidium bromide và chụp ảnh DNA bằng máy chụp gel (Biorad). 34 PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Về tác nhân gây bệnh rụng lá Corynespora Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su do nấm C. cassiicola gây ra là một bệnh mới ở Việt Nam. Đây là một bệnh rất nguy hiểm, một khi xảy ra dịch bệnh sẽ gây ảnh hưởng rất lớn đến năng suất mủ cao su. Bệnh này gây rụng lá toàn bộ đối với cây cao su bị nhiễm bệnh nặng. Bệnh rụng lá Corynespora đã xảy ra ở nhiều nước trên thế giới và gây thiệt hại kinh tế rất đáng kể, nhất là các nước sản xuất cao su thiên nhiên (Jayashinghe, 1997). Những nghiên cứu trước đây trên thế giới cho thấy khả năng gây hại của nấm rất lớn, đã có 6 chủng nấm C. cassiicola (Berk. & Curt.) Wei được ghi nhận là gây hại cho cao su tại Malaysia và 7 chủng tại Ấn Độ (Sabu và cộng sự, 2000). C. cassiicola rất dễ hình thành nòi mới khi có điều kiện thích hợp và độ ẩm lớn hơn 90%, phát tán và lây lan mạnh chủ yếu dựa vào tính mẫn cảm của dvt, điều kiện môi trường và tính độc hại của tác nhân gây bệnh. Đây là ba yếu tố chính dẫn đến sự phát sinh, phát triển bệnh cũng như quyết định mức độ bệnh (Jayashinghe và Silva, 1996; Jayashinghe, 2000). Nói chung, tính đặc thù của nấm là khả năng biến đổi nhanh chóng với ký chủ mới. Về mức độ ảnh hưởng không giống các bệnh về lá khác hiện có tại Việt Nam bởi tác hại của bệnh rất lớn và ảnh hưởng nghiêm trọng đến cây cao su, phạm vi gây hại rộng từ lá non, lá già, cuống lá, chồi và từ vườn ương, vườn kiến thiết cơ bản đến vườn cây khai thác. Ở Việt Nam, bệnh này chưa bùng phát mạnh nhờ hiệu quả của công tác quản lý dịch bệnh. Những dvt mẫn cảm với bệnh này đều bị loại bỏ và được khuyến cáo không trồng. Khi phát hiện vườn cây có bệnh, tiến hành cưa bỏ toàn bộ, đốt cháy để hạn chế sự phát tán mầm bệnh. Những khu vực phát hiện bệnh này là Miền Đông Nam Bộ (Bình Dương, Đồng Nai), miền Bắc (Hà Tây, Nghệ An). Những đợt điều tra bệnh lá trên cây cao su gần đây ở tỉnh Tây Ninh và khu vực Tây Nguyên chưa phát hiện thấy có bệnh này. Về địa điểm lấy mẫu: mẫu bệnh rụng lá Corynespora được thu thập ở hai địa điểm là Vườn Dự Án Giống và Vườn Lưu Trữ Giống thuộc Bộ Môn Giống – VNCCSVN (Bình Dương), và vườn kiểm định bệnh An Lộc (Đồng Nai). Chúng tôi tiến hành thu 35 thập mẫu bệnh trên nhiều dvt khác nhau (bảng 4.1), sau đó tiến hành phân lập nấm C. cassiicola từ các mẫu bệnh. Bảng 4.1: Các dvt cao su đƣợc lấy mẫu và đặc điểm triệu chứng của bệnh (đặc trƣng/ không đặc trƣng). Số thứ tự Dvt cao su được lấy mẫu bệnh Đặc điểm triệu chứng bệnh Nơi lấy mẫu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 RRIV 2 RRIV4 MT/C/5 MT/C/4 AC/B/18 AC/B/17 LH 97/164 LH 96/347 RRIC 121 MTIT 14 MTIT 16 RO/CM/10 FX 2840 AC 88 PB 255 PB 260 MTI2 ROT5 LH 97/167 LH 82/008 LH 83/152 VM 515 VE2 LH 82/104 LH 82/183 RRIC 100 RRIC 102 GU 969 IAN 6323 LH 82/156 LH 83/161 Không đặc trưng Không đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Không đặc trưng Không đặc trưng Không đặc trưng Không đặc trưng Không đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Không đặc trưng Đặc trưng Không đặc trưng Không đặc trưng Không đặc trưng Không đặc trưng Không đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương An Lộc, Đồng Nai An Lộc, Đồng Nai An Lộc, Đồng Nai An Lộc, Đồng Nai An Lộc, Đồng Nai An Lộc, Đồng Nai An Lộc, Đồng Nai An Lộc, Đồng Nai An Lộc, Đồng Nai An Lộc, Đồng Nai An Lộc, Đồng Nai An Lộc, Đồng Nai Trong quá trình thu thập mẫu trên đồng ruộng, chúng tôi nhận thấy bệnh Corynespora có biểu hiện triệu chứng rất khác nhau, thay đổi tùy theo tính mẫn cảm 36 của dvt đối với nấm bệnh. Ngoài triệu chứng điển hình (hình 4.1), bệnh còn biểu hiện ở những vết bệnh tròn, tâm đen có quầng màu vàng bao quanh (hình 4.2), triệu chứng này có thể gây nhầm lẫn giữa bệnh rụng lá Corynespora với bệnh héo đen đầu lá do nấm Colletotrichum gloeosporioidies gây ra trên lá trưởng thành nhưng không u lồi mà trơn láng khi dùng tay vuốt nhẹ (hình 4.3). Hình 4.1: Triệu chứng đặc trƣng của bệnh rụng lá Corynespora – vết bệnh hình xƣơng cá (fish bone). Nguồn: Bộ môn BVTV/VNCCSVN. Hình 4.2: Triệu chứng biến thiên của bệnh rụng lá Corynespora. Dấu mũi tên chỉ vị trí vết bệnh. Vết bệnh phóng lớn (góc trái). 37 Hình 4.3: Triệu chứng của bệnh héo đen đầu lá do Colletotrichum gloeosporioidies gây ra trên cây cao su. Nguồn: Bộ môn BVTV/VNCCSVN a) b) Hình 4.4: Bào tử của nấm C. cassiicola dạng đơn dƣới kính hiển vi quang học (a, b) và bào tử nấm Colletotrichum gloeosporioidies (c). Nguồn: Bộ môn BVTV/VNCCSVN 38 Sau khi phân lập, các mẫu nấm được kiểm tra lại bằng cách làm tiêu bản và quan sát bào tử dưới kính hiển vi, kết quả cho thấy, có 7 mẫu lá phân lập được nấm C. cassiicola, phần lớn các mẫu nấm là nấm Colletotrichum gloeosporioidies, phân biệt rất dễ dàng bằng bào tử (hình 4.4) Qua tiến trình phân lập chúng tôi thu nhận được 7 mẫu nấm C. cassiicola từ 7 dòng vô tính cao su khác nhau, đại diện cho các biểu hiện triệu chứng và địa điểm khác nhau (bảng 4.2). Bảng 4.2: Một số dòng vô tính cao su phân lập đƣợc nấm C. cassiicola Số thứ tự Dòng vô tính phân lập được C. cassiicola Đặc điểm triệu chứng Địa điểm lấy mẫu 1 2 3 4 5 6 7 RRIV 2 RRIV4 AC 88 RO/CM/10 MT/C/5 LH 82/008 LH 83/152 Không đặc trưng Không đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Đặc trưng Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương Lai Khê, Bình Dương An Lộc, Đồng Nai An Lộc, Đồng Nai Để dễ dàng trong việc phân tích, mẫu nấm được phân lập từ dòng vô tính cao su nào sẽ được gọi tên theo dòng vô tính cao su đó. Đặc điểm chung của các mẫu nấm phân lập từ các dvt cao su khác nhau là khuẩn lạc có màu xám, sợi nấm mọc thành những đường tròn đồng tâm. Khuẩn lạc mọc dầy và tụ lại. Khi quan sát bằng cách lật ngược đĩa petri có thể nhận thấy những đường tròn đồng tâm, nấm nuôi cấy lâu ngày sẽ tạo sắc tố màu đen. Ở điều kiện nuôi cấy bình thường, nấm C. cassiicola rất khó hình thành bào tử. Hình 4.5: Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng PDA. 39 4.2. Kết quả ly trích DNA từ các mẫu nấm Các mẫu nấm được xác định là nấm C. cassiicola được chuyển sang nuôi cấy trên môi trường potato dextrose broth (môi trường PDA không có agar), thu sinh khối sợi nấm và tiến hành ly trích DNA. Từ hình 4.5 cho thấy, các nguồn nấm đều cho kết quả ly trích DNA rất tốt. Ngoài DNA tổng số còn có phần tạp (là RNA) có thể loại bỏ phần tạp này bằng cách sử dụng enzyme RNase. Tuy nhiên, nguồn DNA này sau đó có thể sử dụng làm DNA khuôn mẫu để thực hiện phản ứng PCR mà không cần phải tiến hành tinh sạch. Hình 4.6: Kết quả ly trích DNA nấm C. cassiicola từ các nguồn khác nhau. 4.3. Kết quả PCR vùng ITS của nấm C. cassiicola Những trình tự DNA mã hóa cho rRNA đã được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu mối quan hệ về mặt phân loại và biến dị di truyền của các loài nấm. Những nhóm gen mã hóa cho rRNA được tìm thấy ở cả nhân và ti thể, bao gồm những vùng bảo tồn và có khả năng biến dị, vùng này gồm những gen mã hóa cho tiểu đơn vị nhỏ rRNA 5,8S và tiểu đơn vị lớn của rRNA (Bridge P.D. và Arora. D.K., 2000). Vùng nằm giữa các tiểu đơn vị gọi là vùng internal transcribed spacers (ITS) và vùng nằm giữa các nhóm gen gọi là intergenic spacers (IGS), hai vùng này có khả năng biến dị nhiều hơn là những trình tự mã hóa cho các tiểu đơn vị rRNA và được sử dụng rộng rãi hơn trong những nghiên cứu về mối quan hệ giữa các loài trong cùng một giống (Bridge P.D. và Arora. D.K., 2000). Vùng ITS bao gồm hai vùng có khả năng biến dị nhưng không có chức năng mã hóa, là những vùng trong các rDNA lặp lại, giữa tiểu đơn vị có tính bảo tồn cao (tiểu DNA tổng số Phần tạp . THẢO LUẬN 4.1. Về tác nhân gây bệnh rụng lá Corynespora Bệnh rụng lá Corynespora trên cây cao su do nấm C. cassiicola gây ra là một bệnh mới ở Việt Nam. Đây là một bệnh rất nguy hiểm, một. Hình 4. 3: Triệu chứng của bệnh héo đen đầu lá do Colletotrichum gloeosporioidies gây ra trên cây cao su. Nguồn: Bộ môn BVTV/VNCCSVN a) b) Hình 4. 4: Bào tử của nấm C. cassiicola dạng đơn. từ các mẫu bệnh. Bảng 4. 1: Các dvt cao su đƣợc lấy mẫu và đặc điểm triệu chứng của bệnh (đặc trƣng/ không đặc trƣng). Số thứ tự Dvt cao su được lấy mẫu bệnh Đặc điểm triệu chứng bệnh