1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NG DNG K THUT MULTIPLEX - PCR  PHÁT HIN CÁC GEN C LC CA VI KHUN ESCHERICHIA COLI PHÂN LP T PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CHY VÀ THT BÒ Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa : 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện : ĐOÀN THỊ TUYẾT LÊ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC 2 ************ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NG DNG K THUT MULTIPLEX - PCR  PHÁT HIN CÁC GEN C LC CA VI KHUN ESCHERICHIA COLI PHÂN LP T PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CHY VÀ THT BÒ Giáo viên hng dn: Sinh viên thc hin: PGS. TS. NGUYN NGC TUÂN OÀN TH TUYT LÊ BSTY. BÙI THỊ THU TRANG Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 3 LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành gởi lời cảm tạ với tấm lòng biết ơn sâu sắc đến: * Gia đình đã tạo cho tôi chỗ dựa vững chắc về vật chất lẫn tinh thần. Ba mẹ đã luôn sát cánh bên tôi, nuôi dưỡng chăm sóc tôi nên người, động viên tôi học tập. * Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hố Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiết thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường. * PGS. TS. Nguyễn Ngọc Tuân đã hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn cùng những hỗ trợ rất thiết thực cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài, giúp tôi hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp cũng như nâng cao kiến thức. * BSTY. Bùi Thị Thu Trang đã nhiệt tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành tốt khóa luận này. * Quý thầy cô, cán bộ công chức tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa sinh Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM. * BSTY. Lê Hữu Ngọc, phòng thực hành Kiểm nghiệm Thú sản và Môi trường, Khoa CNTY Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM. * Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K27 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập. Chân thành cảm ơn Đoàn Thị Tuyết Lê 4 TÓM TẮT ĐOÀN THỊ TUYẾT LÊ, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Tháng 8/2005. “ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ”. Hội đồng hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Ngọc Tuân BSTY. Bùi Thị Thu Trang Đề tài được thực hiện nhằm xác định các gen độc lực stx1, stx2, eae, hly, lt-I, sta, stb, vt2e của vi khuẩn E. coli được phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy của bò, heo, bê và 9 mẫu bề mặt thịt bò bằng kỹ thuật multiplex – PCR. Ghi nhận được khuẩn lạc hồng trên môi trường MAC; trên SMAC có 2 loại: khuẩn lạc hồng và khuẩn lạc trắng; khuẩn lạc trắng trên CT-SMAC. Mỗi nhóm chọn khoảng 6 – 10 khuẩn lạc riêng lẻ. Ly trích DNA theo nhóm khuẩn lạc và từng khuẩn lạc riêng lẻ theo phương pháp nhiệt. Kết quả multiplex - PCR được ghi nhận như sau: (1) Nhóm khuẩn lạc có mang gen độc lực thì chưa chắc từng khuẩn lạc riêng lẻ có mang gen độc lực đó. (2) Tần số phát hiện các gen độc lực của E. coli từ những mẫu phân tiêu chảy lần lượt là: 25% trên phân bò tiêu chảy (stx2, hly), 30% trên phân bê tiêu chảy (stx1, stx2, hly, eae), 88,89% trên phân heo tiêu chảy (stb, lt, vt2e, hly, stx1, eae). Điều này chứng tỏ rằng trên cả 3 nhóm đối tượng trên, E. coli mang các gen độc lực có thể là nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy. (3) 9 mẫu bề mặt thịt bò chưa phát hiện được gen độc lực của E. coli. (4) Chưa phát hiện được gen sta trong E. coli phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy của bò, bê và heo. 5 SUMMARY “Apply multiplex – PCR to detect some virulence genes of Escherichia coli isolated from diarrhea cattle and swine faeces, beef” The study was carried out to detect stx1, stx2, eae, hly, lt-I, sta, stb, vt2e genes of isolated E. coli from 27 diarrhea stools samples of cattles, calves, piglets, and 9 swabs of the beef surface by multiplex – PCR. Observation had one group of pink colony on MAC, white colony on SMAC, pink colony on SMAC, white colony on CT-SMAC. Each colony group was chosen about 6 – 10 separate colonies. DNA of the colony groups and each separate colony were extracted by heat method. The results of multiplex – PCR were showed that: (1) The colony group has virulence genes, the separate colony does or doesn’t have the genes. (2) Frequency of virulence genes of isolated E. coli from diarrhea stools samples was 25% from cattles (stx2, hly), 30% from calves (stx1, stx2, eae, hly), 88,89% from piglets (stb, lt-I, vt2e, hly, stx1, eae). (3) 9 swabs of the beef surface were detected that non virulence genes of E. coli. (4) Sta gene of E. coli isolated from 27 diarrhea cattle, calf, piglet stools samples weren’t detected. 6 MỤC LỤC CHƯƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Summary v Mục lục vi Danh sách các chữ viết tắt viii Danh sách các hình x Danh sách các bảng xi 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1 2. TỔNG QUAN 3 2.1. Vi khuẩn E. coli 3 2.1.1. Định nghĩa 3 2.1.2. Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa 3 2.1.3. Yếu tố kháng nguyên 4 2.1.4. Cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli 4 2.1.5. Phân loại E. coli 4 2.1.5.1. Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC 4 2.1.5.2. Nhóm EPEC 7 2.1.53. Nhóm ETEC 8 2.2. Kỹ thuật PCR 11 2.2.1. Nguyên tắc 11 2.2.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR 12 2.2.3. Các thành phần của phản ứng PCR 14 2.2.4. Phân tích kết quả PCR 15 2.2.5. Những ứng dụng của PCR 15 7 2.2.5.1. PCR được sử dụng để nghiên cứu lượng DNA nhỏ 15 2.2.5.2. PCR được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng 16 2.2.5.3. PCR được dùng để khuếch đại RNA 16 2.2.5.4. PCR được sử dụng để so sánh các genome khác nhau 17 2.2.6. Các hạn chế của PCR 17 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 19 3.2. Nội dung 19 3.3. Phương pháp nghiên cứu 19 3.3.1. Lấy mẫu 19 3.3.2. Nuôi cấy, phân lập và ly trích DNA của vi khuẩn E. coli 20 3.3.3. Xác định các gen stx1, stx2, eae, hly, stx2e, sta, stb, lt-I của E. coli phân lập được 23 3.3.4. Điện di trên gel aragose và đọc kết quả điện di 25 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 4.1. Kết quả phân nhóm khuẩn lạc và xác định E. coli từ các khuẩn lạc phân lập được 27 4.1.1. Các loại khuẩn lạc trên môi trường thạch MAC, SMAC, và CT-SMAC 27 4.1.2. Xác định E. coli cho các khuẩn lạc được chọn. 27 4.2. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bò tiêu chảy 28 4.3. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân heo tiêu chảy 32 4.4. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bê tiêu chảy 36 4.5. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli phân lập từ mẫu bề mặt thịt bò 38 4.6. Tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli trên các mẫu khảo sát 39 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41 5.1. Kết luận 41 8 5.2. Đề nghị 41 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 42 7. PHỤ LỤC 46 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT A/A : Aggregative adhesion A/E : Attaching and effacing CF : Colonization factor CFA : Colonization factor antigen CT : Cholera toxin CT-SMAC :Cefixime Tellurite Sorbitol MacConkey agar DNA : Deoxyribonucleic acid dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate eae : E. coli attaching and effacing EaggEC = EAEC : Enteroaggregative E. coli EHEC : Enterohaemorrhagic E. coli EIEC : Enteroinvasive E. coli EMB : Eosin methylen blue agar EPEC : Enterophathogenic E. coli ETEC : Enterotoxigenic E. coli FAO : Food and Agriculture Organization HC : Haemorrhagic colitis Hly : Haemolysin HM : Khuẩn lạc hồng trên môi trường MAC HS : Khuẩn lạc hồng trên môi trường SMAC HUS : Haemolytic uraemic syndrome IMViC : Indol, Methyl Red, Voges - Proskauer, Simmon Citrate LEE : Locus of enterocyte effacement LT : Heat labile toxin MAC : MacConkey agar NA : Nutrient agar 9 PCR : Polymerase chain reaction SMAC : Sorbitol MacConkey agar ST : Heat stable toxin STEC : Shiga toxin-producing E. coli Stx : Shiga toxin TBE : Tris borate EDTA TC : Khuẩn lạc trắng trên môi trường CT-SMAC TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam Tir : Translocated intimin receptor Tm : Melting temperature TS : Khuẩn lạc trắng trên môi trường SMAC UV : Ultra violet VT : Verotoxin VTEC : Verotoxigenic E. coli . Tháng 8/2005. ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ”. Hội đồng hướng dẫn: PGS. TS gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân heo tiêu chảy 32 4.4. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli phân lập được từ phân bê tiêu chảy 36 4.5. Kết quả phát hiện các gen độc lực. 2.2. Kỹ thuật PCR 11 2.2 .1. Nguyên tắc 11 2.2.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR 12 2.2.3. Các thành phần của phản ứng PCR 14 2.2.4. Phân tích kết quả PCR 15 2.2.5. Những ứng dụng của PCR