1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus sporogenes Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: Trần Hạnh Triết Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ************ NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus sporogenes Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. Nguyễn Ngọc Hải Trần Hạnh Triết Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 3 LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm tạ:  Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng  TS Nguyễn Ngọc Hải đã hết lòng hƣớng dẫn, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp  Phòng vi sinh khoa Chăn nuôi – Thú y, Trƣờng đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh  Phòng phân tích hóa lý – Trung tâm phân tích thí nghiệm, Trƣờng đại học Nông Lâm  Những anh chị lớp Thú y K26; các bạn lớp Chăn nuôi K27 đã thực hiện khóa luận tốt nghiệp cùng thời gian với tôi tại phòng vi sinh khoa Chăn nuôi – Thú y, Trƣờng đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh  Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K27 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập  Ba mẹ đã luôn động viên, chăm lo cho con trong suốt thời gian thực hiện đề tài 4 TÓM TẮT TRẦN HẠNH TRIẾT, Đại học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh. Tháng 9/2005. “NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN Lactobacillus sporogenes”. Hội đồng hƣớng dẫn: TS. NGUYỄN NGỌC HẢI Đề tài đƣợc thực hiện trên đối tƣợng là các chủng vi khuẩn L. sporogenes phân lập từ chế phẩm (Thorne Research, USA). Bƣớc đầu, chúng tôi tìm hiểu về đặc điểm hình thái vi/đại thể và sinh hóa của vi khuẩn. Sau đó, tiếp tục khảo sát những đặc tính khác: khả năng sinh acid lactic trong môi trƣờng 10% sữa đặc có đƣờng; khả năng hình thành bào tử trong hai loại môi trƣờng nuôi cấy MRSA và GYE, hai điều kiện nhiệt độ - thời gian 37 0 C/6 ngày và 37 0 C/2 ngày chuyển sang 50 0 C/2 giờ và 70 0 C/2 giờ. Những khảo sát về mặt sinh trƣởng và phát triển tạo cơ sở cho nghiên cứu ứng dụng sản xuất chế phẩm từ bào tử vi khuẩn L. sporogenes sau này. Những kết quả đạt đƣợc: 1. Đã phân lập đƣợc vi khuẩn L. sporogenes 2. Vi khuẩn L. sporogenes có khả năng sản sinh acid lactic nhƣng hàm lƣợng không cao (0,144 – 0,342 g/100 ml môi trƣờng sữa) 3. Môi trƣờng nuôi cấy (MRSA và GYE) và điều kiện nhiệt độ - thời gian hóa bào tử (37 0 C/6 ngày và 37 0 C/2 ngày → 50 0 C/2 giờ → 70 0 C/2 giờ) ảnh hƣởng không có ý nghĩa lên sự hình thành bào tử của các chủng L. sporogenes khảo sát 5 MỤC LỤC CHƢƠNG TRANG Trang tựa Lời cảm tạ iii Tóm tắt iv Mục lục v Danh sách các chữ viết tắt viii Danh sách các bảng ix Danh sách các hình ix Danh sách các sơ đồ x 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục đích 1 1.3. Yêu cầu 1 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 2.1. Tổng quan về probiotic 2 2.1.1. Định nghĩa về probiotic 2 2.1.2. Các chức năng sinh học của probiotic 2 2.1.2.1. Tăng khả năng tiêu hóa nhờ hệ thống enzyme 2 2.1.2.2. Tổng hợp vitamin K và nhóm B 2 2.1.2.3. Giúp ổn định hệ vi sinh vật đƣờng ruột 3 2.1.2.4. Trung hòa độc tố và phân hủy một số độc chất 3 2.1.2.5. Kích thích hệ thống miễn dịch 4 2.1.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng probiotic trong chăn nuôi 4 2.1.3.1. Trong nƣớc 4 2.1.3.2. Thế giới 5 2.2. Tổng quan về Lactobacillus sporogenes 5 2.2.1. Lịch sử phát hiện 5 6 2.2.2. Đặc điểm phân loại 5 2.2.3. Đặc điểm phân bố 6 2.2.4. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 6 2.2.4.1. Tế bào sinh dƣỡng 6 2.2.4.2. Bào tử 8 2.2.5. Những đặc điểm, chức năng sinh học tƣơng đồng giữa L. sporogenes và các vi khuẩn Lactobacillus khác 9 2.2.5.1. Những đặc điểm trao đổi chất 10 2.2.5.2. Lợi ích trong dinh dƣỡng và trị liệu 13 2.2.6. Các đặc tính giúp L. sporogenes vƣợt trội hơn các vi khuẩn Lactobacillus khác trong ứng dụng làm probiotic 15 2.2.7. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng L. sporogenes 18 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 19 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 19 3.1.1. Thời gian 19 3.1.2. Địa điểm 19 3.2. Vật liệu nghiên cứu 19 3.2.1. Mẫu khảo sát 19 3.2.2 Môi trƣờng 19 3.2.3. Hóa chất 19 3.2.4. Thiết bị – dụng cụ 19 3.3. Nội dung đề tài 19 3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 3.4.1. Tổng quan các bƣớc thực hiện đề tài 20 3.4.2. Phân lập vi khuẩn 20 3.4.2.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào 21 3.4.2.2. Khảo sát các phản ứng sinh hóa 22 3.4.3.Khả năng sinh acid lactic 22 3.4.3.1. Định tính 22 3.4.3.2. Định lƣợng 23 7 3.4.4 Khảo sát khả năng hình thành bào tử 24 3.4.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu 27 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4.1. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus sporogenes 28 4.1.1. Bố trí thí nghiệm 28 4.1.2. Đặc điểm hình thái của L. sporogenes 28 4.1.2.1. Quan sát khuẩn lạc 28 4.1.2.2. Quan sát hình thái tế bào 29 4.1.2.3. Quan sát hình thái bào tử 29 4.1.3. Đặc điểm sinh hóa của L. sporogenes 29 4.2. Khả năng sinh acid lactic 31 4.2.1. Định tính 31 4.2.2. Định lƣợng 32 4.3. Khảo sát khả năng hình thành bào tử 34 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36 5.1. Kết luận 36 5.2. Đề nghị 36 6: TÀI LIỆU THAM KHẢO 37 PHỤ LỤC 8 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ctv Cộng tác viên CV Coefficient of variation, hệ số biến thiên FDA Food & Drug Administration, cơ quan quản lý thực phẩm và dƣợc phẩm của Mỹ GRAS Generally Recognise As Safe, chứng nhận an toàn cho sức khỏe MRSA De Man-Rogosa-Sharpe agar GYE Glucose Yeast Extract SD standard deviation, độ lệch chuẩn 9 DANH MỤC CÁC BẢNG BẢNG TRANG Bảng 2.1 Những tƣơng đồng về mặt hình thái của L. sporogenes và Lactobacillus 6 Bảng 2.2 Những khác biệt về hình thái của L. sporogenes so với Bacillus 6 Bảng 2.3 Những tƣơng đồng về đặc điểm sinh trƣởng và sinh hóa của L. sporogenes và Lactobacillus 7 Bảng 2.4 Những khác biệt về đặc điểm sinh trƣởng và sinh hóa của L. sporogenes so với Bacillus 8 Bảng 2.5 Một vài loại bacteriocin từ vi khuẩn Lactobacillus 11 Bảng 2.6 Tác dụng của một vài sản phẩm trao đổi chất của Lactobacillus 12 Bảng 2.7 Bảng liệt kê những ƣu điểm của L. sporogenes so với L. acidophillus 17 Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng hình thành bào tử của vi khuẩn L. sporogenes . 24 Bảng 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn L. sporogenes 28 Bảng 4.2: Đặc điểm sinh hóa của các chủng L. sporogenes phân lập đƣợc từ chế phẩm . 30 Bảng 4.3 Khả năng sinh acid lactic của các chủng L. sporogenes đã thử sinh hóa 31 Bảng 4.4: Giá trị độ Therner và lƣợng acid lactic do vi khuẩn L. sporogenes sản xuất 33 Bảng 4.5 Số lƣợng bào tử L. sporogenes thu đƣợc trong 12 nghiệm thức đƣợc khảo sát 34 DANH MỤC CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1 Giản đồ cấu tạo bào tử 8 Hình 2.2 Hai loại đồng phân acid lactic 11 Hình 2.3 Cơ chế ngăn chặn sự hình thành và hấp thụ cholesterol 14 Hình 4.1: Khuẩn lạc vi khuẩn L. sporogenes trên môi trƣờng GYE 38 Hình 4.2: Tế bào vi khuẩn L. sporogenes đƣợc phóng đại 1000 lần dƣới kính hiển vi 29 Hình 4.3: Phản ứng lên men một số loại đƣờng của vi khuẩn L. sporogenes 31 Hình 4.4: Thí nghiệm tạo acid lactic của vi khuẩn L. sporogenes 32 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ 10 SƠ ĐỒ TRANG Sơ đồ 2.1 Ích lợi của Lactobacillus về mặt dinh dƣỡng và trị liệu 13 Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nghiên cứu đặc điểm sinh trƣởng, phát triển của L. sporogenes 20 Sơ đồ 3.2: Quy trình phân lập và định danh L. sporogenes 20 Sơ đồ 3.3: Quy trình phân lập và quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa 21 Sơ đồ 3.4: Quy trình tiến hành thủ nghiệm sinh hóa 22 Sơ đồ 3.5: Quy trình xác định độ chua Therner 23 Sơ đồ 3.6: Quy trình khảo sát sự hình thành vào nảy chồi của bào tử L. sporogenes 25 . NGHIỆM 19 3 .1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 19 3 .1. 1. Thời gian 19 3 .1. 2. Địa điểm 19 3.2. Vật liệu nghiên cứu 19 3.2 .1. Mẫu khảo sát 19 3.2.2 Môi trƣờng 19 3.2.3. Hóa chất 19 3.2.4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 4 .1. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus sporogenes 28 4 .1. 1. Bố trí thí nghiệm 28 4 .1. 2. Đặc điểm hình thái của L. sporogenes 28 4 .1. 2 .1. Quan sát khuẩn lạc 28 4 .1. 2.2 và trị liệu 13 Sơ đồ 3. 1: Sơ đồ nghiên cứu đặc điểm sinh trƣởng, phát triển của L. sporogenes 20 Sơ đồ 3. 2: Quy trình phân lập và định danh L. sporogenes 20 Sơ đồ 3. 3: Quy trình phân lập và