11 PHẦN 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Ngành chăn nuôi Việt Nam hiện nay đang có những chuyển biến mới. Số lƣợng bầy đàn ngày càng tăng và tình hình bệnh trong chăn nuôi ngày càng có nhiều diễn biến phức tạp. Vì thế yêu cầu kiểm soát mầm bệnh đảm bảo sức khỏe cho thú nuôi là yêu cầu cấp thiết. Bên cạnh đó, nhà chăn nuôi còn nhắm tới hiệu quả kinh tế tối đa trong sản xuất với những chi phí tối thiểu. Đó cũng là mục tiêu của các nhà khoa học nhằm ứng dụng thành quả nghiên cứu khoa học trong chăn nuôi. Hiện nay, bệnh đƣờng tiêu hóa đã và đang gây nhiều tổn thất về mặt kinh tế cho các nhà chăn nuôi. Việc sử dụng kháng sinh để điều trị bệnh này đang dần hạn chế do những tác dụng phụ. Liệu pháp thay thế cho kháng sinh là sử dụng probiotic (chế phẩm sinh học) ngày càng đƣợc chú trọng. Probiotic là một hỗn hợp các vi khuẩn sống có lợi hay các enzyme của chúng. Chúng có tác dụng ức chế các vi sinh vật gây bệnh, làm cân bằng lại hệ vi sinh vật đƣờng ruột, tổng hợp vitamin B, thúc đẩy sự tăng trƣởng của thú nuôi. Trong hỗn hợp probiotic, mỗi vi khuẩn có một đặc tính có lợi riêng. Trong đó, nhóm vi khuẩn Lactobacillus mà đặc biệt là Lactobacillus sporogenes với khả năng tạo bào tử sẽ cho phép kéo dài thời gian bảo quản và tế bào sinh dƣỡng sau khi phục hồi vẫn có hoạt tính ổn định. Nhờ vậy mà L. sporogenes ngày càng đƣợc ứng dụng nhiều trong sản xuất chế phẩm sinh học. 1.2. Mục đích Tìm hiểu một số đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus sporogenes nhằm ứng dụng để sản xuất chế phẩm vi sinh (probiotic). 1.3. Yêu cầu Phân lập các chủng L. sporogenes từ các sản phẩm chế phẩm sinh học có sẵn. Đánh giá khả năng hình thành bào tử trong điều kiện nhiệt độ và môi trƣờng nuôi cấy thay đổi. 12 PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.3. Tổng quan về probiotic 2.3.1. Định nghĩa về probiotic Thuật ngữ probiotic lần đầu tiên đƣợc đƣa ra bởi Lilly và Stillwell vào năm 1965 để mô tả những yếu tố kích thích sinh trƣởng do vi sinh vật tạo ra [4]. Những nghiên cứu tiếp theo giúp hoàn thiện dần định nghĩa về probiotic. Cho đến nay, theo Havenaar (1992) thuật ngữ probiotic đƣợc hiểu là một loại hay hỗn hợp các vi sinh vật sống ảnh hƣởng có lợi đối với động vật và ngƣời bằng cách cải thiện những tính chất của hệ vi sinh vật có sẵn trong đƣờng ruột vật chủ [4]. Những vi sinh vật đƣợc sử dụng làm probiotic là những vi sinh vật sống trong tự nhiên bao gồm vi khuẩn, nấm mốc và nấm men [2]. 2.3.2. Các chức năng sinh học của probiotic 2.3.2.1. Tăng khả năng tiêu hóa nhờ hệ thống enzyme Vi sinh vật đƣờng ruột có lợi của động vật nuôi có một vai trò quan trọng trong sự tiêu hóa và hấp thu thức ăn của vật chủ. Chúng tham gia vào quá trình tiêu hóa các chất dinh dƣỡng trong khẩu phần nhƣ: carbonhydrate, protein, lipid…thành những chất dễ hấp thu hơn nhờ hệ thống enzyme của chúng nhƣ: amylase, protease, cellulase… Nhóm này gồm những vi khuẩn: Bacillus subtilis, Ruminococcus, Cellulomonas, Saccaromyces cerevisiae, Aspergillus oryzae, Lactobacillus,… Theo một số nghiên cứu của Nahashon, việc bổ sung Lactobacillus vào trong khẩu phần bắp, lúa mạch, đậu nành đã kích thích thèm ăn và tăng tích lũy mỡ, N, Ca, P, Cu và Mn cho gà đẻ [2]. Ngoài ra, việc bổ dung chế phẩm Saccharomyces boulardii vào khẩu phần gà thịt làm giảm hệ số chuyển đổi thức ăn trên 1 kg tăng trọng, ảnh hƣởng phần nào lên sức đề kháng, làm giảm tỉ lệ chết, tăng hiệu quả sản xuất. 2.3.2.2. Tổng hợp vitamin K và nhóm B Hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp vitamin nhóm B nhƣ B1, B2, B6, B12 và vitamin K ở manh tràng và đại tràng. 13 Bản thân tế bào nấm men có chứa một lƣợng dinh dƣỡng rất cao bao gồm: protein, lipid, glucid, khoáng và nhiều vitamin nhất là vitamin nhóm B, cải thiện tăng trƣởng và sức đề kháng. 2.3.2.3. Trung hòa độc tố và phân hủy một số độc chất Theo Rami và Khetarpaul (1998), probiotic có khả năng sản xuất các chất có tác dụng trung hòa độc tố gây tiêu chảy của vi khuẩn E. coli, có thể làm giảm hoạt tính urease trong ruột non, ngăn chặn sự tổng hợp các amin độc, làm giảm nồng độ NH 3 trong phân gia súc, gia cầm [27]. Một vài vi sinh vật có khả năng khử độc và phân hủy một số chất có độc tính, tạo thành những dẫn xuất không độc. Nhiều nghiên cứu cho thấy tế bào nấm men có tính khử các chất độc đƣợc sinh ra trong quá trình tiêu hóa nhƣ: indol, skatol, phenol,… Tác dụng trung hòa và khử độc của probiotic không những giúp cho ống tiêu hóa hoạt động tốt hơn mà còn có ý nghĩa về mặt môi trƣờng. 2.3.2.4. Giúp ổn định hệ vi sinh vật đƣờng ruột Động vật khỏe mạnh, có hệ tiêu hóa hoạt động tốt là cơ sở cho sự chuyển hóa tốt thức ăn phục vụ cho nhu cầu cơ thể. Đặc tính quan trọng nhất của một đƣờng tiêu hóa khỏe mạnh là sự cân bằng của hệ vi sinh vật đƣờng ruột. Việc bổ sung probiotic giúp duy trì hệ vi sinh vật đƣờng ruột thông qua hoạt động cạnh tranh và đối kháng. Hoạt động cạnh tranh thể hiện ở các vị trí bám dính trên nhung mao ruột, các chất dinh dƣỡng và khối lƣợng các sản phẩm trao đổi chất của vi sinh vật. Nhiều nghiên cứu chứng minh probiotic ức chế sự bám dính của vi sinh vật gây bệnh nhƣ E. coli, Salmonella typhimurium [7, 19, 29]. Việc ức chế khả năng bám dính của vi sinh vật gây bệnh giúp ngăn ngừa sự phát triển và gây bệnh của chúng. Nhóm vi khuẩn lactic là những vi sinh vật tiêu biểu cho hoạt động đối kháng của của probiotic. Chúng chống lại các vi sinh vật gây bệnh nhờ vào các sản phẩm do chúng tạo ra nhƣ: bacteriocin, acid hữu cơ, hydroperoxydase, lactocidin,… Lactocidin có phổ kháng khuẩn rất rộng. Các acid acetic và lactic làm giảm pH đƣờng ruột khiến môi trƣờng đƣờng ruột trở nên bất lợi cho sự tồn tại của vi sinh vật gây bệnh Gr (-). Một số bacteriocin thƣờng gặp nhƣ: mycobacillin, subtilin (do Bacillus subtilis sinh ra), nizin (do Lactococcus lactis sinh ra), penicillin (do nấm penicillium sinh ra),…L. 14 acidophillus tạo ra lactacin B có tác dụng ức chế các loài Lactobacillus khác và acidocin ức chế vi sinh vật gây bệnh [6, 34]. 2.3.2.5. Kích thích hệ thống miễn dịch Yếu tố đƣợc xác định có vai trò kích thích hệ thống miễn dịch là thành phần của vách tế bào vi khuẩn: peptidoglycan. Sự phân hủy peptidoglycan tạo thành chất muramyl peptid có tác dụng kích hoạt đại thực bào [32]. Saarela và ctv (2000) cho rằng khả năng bám vào niêm mạc ruột của probiotic tạo sự tƣơng tác giúp probiotic tiếp xúc với hệ thống lympho đƣờng ruột và hệ thống miễn dịch, nhờ đó thúc đẩy hiệu quả miễn dịch và tạo nên sự ổn định hàng rào bảo vệ ruột [28]. 2.3.3. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng probiotic trong chăn nuôi 2.3.3.1. Trong nƣớc Cùng với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật, việc sản xuất các chế phẩm cung cấp vi sinh vật có lợi cho đƣờng ruột ở nƣớc ta không ngừng phát triển. Kết quả của các nghiên cứu tìm hiểu ảnh hƣởng của các chế phẩm này lên sức đề kháng, tỉ lệ tiêu tốn thức ăn, tỉ lệ chết, sức tăng trọng của gia súc, hiệu quả kinh tế… đƣợc ứng dụng trong chăn nuôi ngày càng rộng rãi. Các công trình nghiên cứu của Viện Thú Y quốc gia: Sữa chua và canh trùng B. subtilis dùng trong phòng trị bệnh phân trắng của lợn con (Đào Trọng Đạt và Vũ Đình Hƣng, 1962) Viên Subtilis để phòng trị các hội chứng nhiễm khuẩn đƣờng ruột trên gia súc (Lê Thị Tài và ctv, 1968 – 1978) [3]. Chế phẩm chứa Saccharomyces boulardii cải thiện tình hình bệnh phân trắng ở lợn con (Phan Thanh Phƣợng và ctv, 1979 – 1984) Các chế phẩm trên đều khẳng định kết quả phòng trị bệnh đƣờng ruột ở heo và tác dụng điều tiết kích thích sinh trƣởng của chế phẩm Năm 1982, Vũ Văn Ngữ và ctv đã sản xuất và thử nghiệm chế phẩm Subcolac (Bacillus subtilis, Lactobacillus) làm giảm tỉ lệ tử vong , giảm tỉ lệ tái phát cho bệnh tiêu chảy so với dùng kháng sinh và heo con tăng trọng tốt (cao hơn đối chứng 0,9 kg/con). Phòng vi sinh Khoa Chăn Nuôi Thú Y trƣờng Đại Học Nông Lâm đã sản xuất thành công chế phẩm Biolactyl, qua sử dụng đã cho hiệu quả tốt trong việc phòng bệnh tiêu chảy cho heo con theo mẹ và hiện đang đƣợc sử dụng rộng rãi. 15 Viện Pasteur Nha Trang cũng đã sản xuất chế phẩm Biosubtyl (Bacillus subtilis) đã sử dụng có hiệu quả trong phòng và trị bệnh tiêu chảy trên ngƣời và gia súc. 2.3.3.2. Thế giới Trên thế giới, trong những thập niên gần đây, ngƣời ta hƣớng vào việc phân lập và chọn các chủng vi sinh vật có tính đối kháng cao đƣa vào đƣờng ruột, nâng cao sức chống đỡ đối với mầm bệnh, phòng trị bệnh đƣờng ruột cho ngƣời, động vật nuôi, nhất là trẻ sơ sinh, ngƣời già và thú non. Hiện nay ở Mỹ, Nhật, Anh và nhiều nƣớc khác trên thế giới đã sản xuất những chế phẩm hỗn hợp nhiều loại enzyme, kết hợp nhiều loài vi sinh vật trong việc phòng trị bệnh, nâng cao khả năng tiêu hoá của ngƣời và vật nuôi nhƣ: Biozim, Rozim F - 3C, Lactopure, NatureFlora,… 2.4. Tổng quan về Lactobacillus sporogenes 2.4.1. Lịch sử phát hiện L. sporogenes lần đầu tiên đƣợc phân lập vào năm 1933 bởi L.M. Horowitz- Wlassowa và N.W. Nowotelnow. Vào thời gian đó, vi khuẩn đƣợc phân loại và mô tả nhƣ sau: tế bào hình que, Gram (+), tạo bào tử, sản xuất acid lactic, hiếu khí hay kị khí tùy ý, phản ứng catalase (+) (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 1974). Vi khuẩn còn có tên là Bacillus coagulans [8]. Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây, đặc biệt là nghiên cứu dựa trên sự tƣơng đồng về DNA đã khẳng định L. sporogenes gần gũi với Lactobacillus hơn Bacillus. Năm 1967, L. sporogenes đƣợc xếp lại vào giống Lactobacillus. 2.4.2. Đặc điểm phân loại Vi khuẩn L. sporogenes có đặc điểm phân loại nhƣ sau: Họ: Lactobacillaceae Giống: Lactobacillus Tộc: Lactobacilleae Loài: Lactobacillus sporogenes 2.4.3. Đặc điểm phân bố Vi khuẩn L. sporogenes có mặt trong các sản phẩm đồ hộp. Chúng phân bố tƣơng đối rộng rãi trong tự nhiên. 2.4.4. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa 16 2.4.4.1. Tế bào sinh dƣỡng Hình thái Vì có quan hệ với hai giống Bacillus và Lactobacillus nên hình thái của L. sporogenes có những nét tƣơng đồng Lactobacillus và khác biệt với Bacillus (xem Bảng 2.1 và 2.2) Bảng 2.1 Những tƣơng đồng về mặt hình thái của L. sporogenes và Lactobacillus [35] Điểm tƣơng đồng Chi tiết Hình dạng khuẩn lạc -Đƣờng kính khuẩn lạc: 2,5 mm -Hình dáng khuẩn lạc: lồi, trơn, lấp lánh, không tạo sắc tố. Hình dạng tế bào -Hình que thon, dài -Kích thƣớc: 0,3 - 0,8 µm 3,0 - 5,0 µm -Tròn ở đầu tận cùng Bảng 2.2 Những khác biệt về hình thái của L. sporogenes so với Bacillus [35] Điểm khác biệt Chi tiết Hình dạng khuẩn lạc -Khuẩn lạc Bacillus có bề mặt nhăn. Hình dạng tế bào -Bacillus luôn có dạng hình que thẳng, trong khi Lactobacillus còn có dạng hình que uốn cong. -Bào tử của Bacillus ở giữa thân còn bào tử của L. sporogenes có ở một đầu tế bào. Các đặc điểm sinh trƣởng phát triển và sinh hóa Tƣơng tự nhƣ hình thái, những điểm tƣơng đồng Lactobacillus và khác biệt Bacillus về mặt sinh trƣởng phát triển và sinh hóa của L. sporogenes đƣợc trình bày ở Bảng 2.3 và 2.4 17 Bảng 2.3 Những tƣơng đồng về đặc điểm sinh trƣởng và sinh hóa của L. sporogenes và Lactobacillus [35] Điểm tƣơng đồng Chi tiết Môi trƣờng nuôi cấy -Khó nuôi cấy, cần những chất hữu cơ phức tạp để phát triển nhƣ: carbonhydrate (để lên men), peptone, chiết thịt, chiết nấm men. -Môi trƣờng nuôi cấy thích hợp: MRSA có bổ sung nƣớc ép cà chua a . pH tối ƣu 5,5 - 6,8 Nhiệt độ tối ƣu 30 - 45 0 C Một số phản ứng sinh hóa -Không thủy phân tinh bột, casein. -Không hóa lỏng gelatine -Indole (-) -Không sinh gas hay H 2 S -Không có menaquinones Khả năng lên men đƣờng -Sản xuất acid khi lên men các loại đƣờng: lactose, arabinose, xylose, glucose, galactose, mannose, fructose, maltose, sucrose và trehalose. -Sản xuất acid lactic khi lên men: glucose, fructose, sucrose, trehalose và lactose. Một số đặc điểm khác -Gram (+) -Hiếu khí hay kị khí tùy ý Lƣu ý: (a) L. sporogenes cũng phát triển tốt trong môi trƣờng GYE (glucose yeast extract agar). Bảng 2.4 Những khác biệt về đặc điểm sinh trƣởng và sinh hóa của L. sporogenes so với Bacillus [35] Điểm khác biệt Chi tiết Môi trƣờng nuôi cấy Dễ nuôi cấy hơn Lactobacillus 18 Một số phản ứng sinh hóa Lactobacillus cho phản ứng oxidase (-) và nitrate (-) trong khi Bacillus luôn cho hai phản ứng này (+) Khả năng lên men đƣờng Bacillus không lên men đƣợc lactose 2.4.4.2. Bào tử Hình thái Lớp vỏ bào tử có cấu tạo là một phức hệ peptidoglycan - acid dipicolinic - calcium. Bào tử hình ellip, nằm ở một đầu của tế bào sinh dƣỡng, có kích thƣớc 0,9 - 1,21,0 - 1,7 µm . Cấu tạo chi tiết của bào tử L. sporogenes đƣợc mô tả theo Hình 2.1. Hình 2.1 Giản đồ cấu tạo bào tử. Gồm: lớp ngoại bào tử (exosporium), màng ngoài (outer coat), màng trong (inner coat), lớp vỏ dƣới màng trong (cortex), màng vỏ của vách tế bào mầm (cortical membrane of the germ cell wall), tế bào chất sát nhập vào tế bào mẹ (incorporated mother cell cytoplasm), nguyên sinh chất (core/protoplast), vật chất nhân (nuclear material) [15, 39]. Khi gặp phải điều kiện bất lợi nhƣ nhiệt độ, pH, môi trƣờng dinh dƣỡng không phù hợp,… L. sporogenes từ dạng tế bào sinh dƣỡng tạo thành bào tử. Đặc tính o In vitro 19 Bào tử L. sporogenes bền với nhiệt và những điều kiện môi trƣờng khắc nghiệt khác. Chúng vẫn sống ngay cả sau khi đã xử lý ở 100 o C trong 20 phút trong dung dịch đệm phosphate ở pH 7. Bào tử nảy chồi trong dịch canh chứa malt ngay cả khi có HCl pha loãng (pH 4,6 – 5,6), dịch NaOH (pH 7,6 – 9,6), dịch muối (nồng độ 5%, 10%, 20%), dịch acid boric 2,5% và nƣớc cất. Bào tử chịu đƣợc kháng sinh 2 – 8 lần so với tế bào dinh dƣỡng [12]. o In vivo Khi qua đƣờng miệng, bào tử đƣợc hoạt hóa và hồi sinh trong môi trƣờng acid của dạ dày - ruột với pH thấp nhờ hoạt động đánh khuấy hóa học của dạ dày và môi trƣờng nƣớc trong dạ dày. Các lớp màng (coat) hút nƣớc và trƣơng phồng lên. Sự gia tăng hàm lƣợng nƣớc làm tăng tỉ lệ trao đổi chất của vi khuẩn trong bào tử, chồi hình thành và ló ra ngoài lớp màng của bào tử. Tại tá tràng, bào tử không còn nữa, các tế bào nảy chồi chuyển thành tế bào sinh dƣỡng. Chúng nhân lên rất nhanh trong ruột non. Thông thƣờng, sự nảy chồi diễn ra khoảng 4 giờ sau khi bào tử đi vào qua đƣờng miệng. Tế bào sinh dƣỡng nhân đôi sau mỗi 30 phút. Các tế bào này cố định trên bộ máy tiêu hóa và tiếp tục hoạt động trao đổi chất, sản xuất acid lactic và bacteriocin. Điều này tạo một môi trƣờng bất lợi cho vi khuẩn có hại trong đƣờng ruột [13]. 2.4.5. Những đặc điểm, chức năng sinh học tƣơng đồng giữa L. sporogenes và các vi khuẩn Lactobacillus khác Vi khuẩn L. sporogenes là một loài thuộc giống Lactobacillus nên mang nhiều đặc tính và chức năng sinh học của Lactobacillus. Những đặc tính và chức năng này đều có ý nghĩa trong ứng dụng sản xuất probiotic. 2.4.5.1. Những đặc điểm trao đổi chất Quá trình trao đổi chất của Lactobacillus có vai trò rất quan trọng trong khả năng chữa bệnh của vi khuẩn. Các nghiên cứu nuôi cấy Lactobacillus trong môi trƣờng sữa đã thể hiện rõ ràng những hoạt tính đáng chú ý sau: Phân giải protein Lactobacillus sản sinh enzyme proteinase phân giải protein thành các polypeptide mạch ngắn. 20 Hoạt tính này của vi khuẩn giúp cho protein đƣợc cơ thể vật chủ tiêu hóa dễ dàng. Vì vậy, các chế phẩm từ hoạt động lên men của Lactobacillus đƣợc đánh giá là nguồn dinh dƣỡng có giá trị cao cho các đối tƣợng: trẻ sơ sinh, ngƣời đang dƣỡng bệnh, ngƣời già hay gia súc non. Phân giải lipid Nhờ có enzyme lipase, Lactobacillus có khả năng phân cắt chất béo ở dạng triglyceride thành các acid béo và glycerol. Điều này cũng có ý nghĩa về mặt dinh dƣỡng đối với ngƣời và vật nuôi. Có những nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng (preclinical) cho rằng Lactobacillus phân giải đƣợc cholesterol trong lipid huyết thanh (serum lipids) [25, 26] và muối mật [14]. Cả hai khả năng này đều có ý nghĩa về mặt lâm sàng. Phân giải đƣờng lactose Lactobacillus mang enzyme beta - galactosidase, glycolase và lactic dehydrogenase (LDH) có tác dụng chuyển hoá đƣờng lactose thành acid lactic. Đây là một acid hữu cơ có những đặc tính sinh học đặc biệt. o Vai trò của acid lactic [5] Về mặt sinh lý học, acid lactic có những ƣu điểm sau:  Tăng cƣờng khả năng tiêu hóa protein sữa thông qua sự đông vón  Tăng cƣờng hoạt tính Ca, P, Fe  Kích thích sự tiết dịch vị  Tăng nhanh cử động đẩy nhanh thức ăn đi xuống dạ dày  Là nguồn năng lƣợng cho quá trình hô hấp Chính những ƣu điểm trên đã phần nào chứng minh hiệu quả của việc ứng dụng Lactobacillus làm probiotic. Tùy thuộc vào loài và điều kiện nuôi cấy, Lactobacillus sản xuất hai loại đồng phân quang học: D (-) và L (+) acid lactic (xem Hình 2.3). Ở ngƣời, cả hai loại đồng phân này đều đƣợc hấp thu trong đƣờng ruột. . Lactobacillus và khác biệt Bacillus về mặt sinh trƣởng phát triển và sinh hóa của L. sporogenes đƣợc trình bày ở Bảng 2. 3 và 2. 4 17 Bảng 2. 3 Những tƣơng đồng về đặc điểm sinh trƣởng và sinh hóa của. 1967, L. sporogenes đƣợc xếp lại vào giống Lactobacillus. 2. 4 .2. Đặc điểm phân loại Vi khuẩn L. sporogenes có đặc điểm phân loại nhƣ sau: H : Lactobacillaceae Giống: Lactobacillus Tộc: Lactobacilleae. Bảng 2. 1 và 2. 2) Bảng 2. 1 Những tƣơng đồng về mặt hình thái của L. sporogenes và Lactobacillus [35] Điểm tƣơng đồng Chi tiết Hình dạng khuẩn lạc -Đƣờng kính khuẩn lạc: 2, 5 mm -Hình dáng khuẩn