31 3.4.2.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào [9, 40]  Hình thái khuẩn lạc Sơ đồ 3.3: Quy trình phân lập và quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa [9, 40] Hình dáng khuẩn lạc: lồi, trơn, màu vàng trùng với màu môi trƣờng xung quanh. Đƣờng kính khuẩn lạc: 2,5 mm.  Hình thái tế bào Tế bào đƣợc quan sát ở vật kính 100X sau khi đã tiến hành nhuộm Gram (xem phụ lục 5.1). Vi khuẩn L. sporogenes có hình que, bắt màu Gram (+), không tạo chuỗi. Bào tử nằm ở một đầu tế bào. Kích thƣớc tế bào: 0,4 – 0,8 µm  2,5 – 4,5 µm.  Hình thái bào tử Bào tử đƣợc quan sát ở vật kính 100X sau khi đã tiến hành nhuộm Gram (xem phụ lục 5.2). Bào tử L. sporogenes có hình bầu dục, bắt màu hồng, nằm ở một đầu tế bào. Kích thƣớc bào tử: 0,9 – 1,2 µm  1 – 1,7 µm. Mẫu chế phẩm Pha loãng trong 9 ml NaCl 9% 0 đến nồng độ 10 -8 Giữ 3 ống nồng độ pha loãng 10 -6 , 10 -7 , 10 -8 ở 100 0 C/10 phút Cấy trang trên đĩa GYE Quan sát khuẩn lạc đặc trƣng Giữ giống trên GYE thạch nghiêng Ủ 37 0 C/48 giờ 32 3.4.2.2. Khảo sát các phản ứng sinh hóa [35] Để định danh L. sporogenes, ngoài hình thái khuẩn lạc và tế bào, còn cần đến những phản ứng sinh hóa đặc trƣng (xem phụ lục 6.1 – 6.3). Sơ đồ 3.4: Quy trình tiến hành thủ nghiệm sinh hóa [35] 3.4.3. Khả năng sinh acid lactic 3.4.3.1. Định tính  Nguyên tắc Chúng tôi sử dụng phƣơng pháp phát hiện khả năng sinh acid lactic của vi khuẩn L. sporogenes bằng phản ứng với thuốc thử Uffelman  Tiến hành Cấy vi khuẩn từ môi trƣờng tăng sinh vào 10 ml canh GYE. Ủ 37 0 C/48 giờ. Ly tâm ống canh khuẩn ở tốc độ 3000 vòng/10 phút. Thu dịch nổi vào bình chiết, thêm 2,5 ml H 2 SO 4 10%, 25 ml diethyl ether và lắc đều. Thu lấy tầng ether và cho bốc hơi thật kỹ trong bồn nƣớc nóng (trong khoảng 60 - 100 0 C)cho đến khi còn lại một thể tích dung dịch ổn định. Hòa tan phần còn lại này trong 2,5 ml nƣớc cất. Thêm vào 2,5 ml thuốc thử Uffelman màu tím xanh. Đọc kết quả. Kết quả Phản ứng (-): dung dịch không chuyển thành màu vàng Phản ứng (+): dung dịch chuyển thành màu vàng Giống Cấy tăng sinh trong GYE lỏng Ủ 37 0 C/24 giờ Cấy sang các môi trƣờng thử sinh hóa Lên men đƣờng Di động Catalase 33 3.4.3.2. Định lƣợng  Nguyên tắc L. sporogenes lên men đƣờng tạo ra acid nên có cũng có khả năng làm đông vón sữa. Dựa vào đặc điểm này, chúng tôi xác định và đánh giá lƣợng acid lactic (chiếm hơn 85% tổng lƣợng acid đƣợc tạo ra) do các chủng L. sporogenes trong chế phẩm Lactospore ® sản xuất thông qua giá trị độ chua Therner.  Tiến hành o Xác định độ chua 34 Sơ đồ 3.5: Quy trình xác định độ chua Therner Công thức tính độ chua (T) trong 100 ml dịch sữa lên men o Tính lƣợng acid lactic Công thức tính lƣợng acid lactic trong 100 ml dịch lên men dựa vào giá trị độ chua T = n.100/V T: độ chua n: V NaOH 0,1N sử dụng (ml) V: thể tích dịch sữa lên men chƣa pha loãng (ml) 4 ml GYE lỏng Hấp vô trùng Cấy vi khuẩn Ủ 37 0 C/24 giờ Sữa đặc có đƣờng Pha loãng bằng nƣớc cất với tỉ lệ 1:10 Chiết 40 ml vào bình tam giác Ủ 37 0 C/24 giờ Hút 10 ml dịch lên men + 90 ml nƣớc cất + 2-3 giọt phenolphtalein Chuẩn độ bằng NaOH 0,1N cho đến khi dịch lên men chuyển sang màu hồng nhạt bền trong 5 phút Ghi nhận V NaOH 0,1N Tính giá trị độ chua (T) theo công thức 35 3.4.4 Khảo sát khả năng hình thành bào tử  Nguyên tắc Sự hình thành và hồi sinh của bào tử L .sporogenes chịu ảnh hƣởng lớn bởi những điều kiện môi trƣờng. Thí nghiệm sau đây đƣợc thực hiện nhằm khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và môi trƣờng nuôi cấy lên khả năng tạo bào tử. Đối tƣợng đƣợc lựa chọn để thực hiện thí nghiệm là 3 trong số các chủng giữ giống.  Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu 3 yếu tố Yếu tố 1: nhiệt độ nuôi cấy Yếu tố 2: môi trƣờng nuôi cấy Yếu tố 3: 3 chủng vi khuẩn L. sporogenes Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát khả năng hình thành bào tử L. sporogenes Yếu tố 3 Yếu tố 1 Yếu tố 2 37 0 C/6 ngày [9] 37 0 C/2 ngày  50 0 C/2 giờ  70 0 C/2 giờ MRSA GYE MRSA GYE Chủng 1 Nghiệm thức 1 Nghiệm thức 2 Nghiệm thức 3 Nghiệm thức 4 2 Nghiệm thức 5 Nghiệm thức 6 Nghiệm thức 7 Nghiệm thức 8 3 Nghiệm thức 9 Nghiệm thức 10 Nghiệm thức 11 Nghiệm thức 12 Chú ý: mỗi thí nghiệm lập lại 3 lần A = 0,009.n.100/V = 0,009.T A: khối lƣợng acid lactic (g) n : V NaOH 0,1N chuẩn độ (ml) 0,009 : hệ số chuyển 1 ml NaOH 0,1N sang số gam acid lactic V : thể tích dịch sữa lên men chƣa lên men (ml) 36  Quy trình khảo sát Sơ đồ 3.6: Quy trình khảo sát sự hình thành vào nảy chồi của bào tử L. sporogenes [9, 40] Chọn 3 chủng Cấy tăng sinh trên GYE lỏng Ủ 37 0 C/24 giờ Hút 1ml sinh khối và cấy lên 2 môi trƣờng thạch đĩa MRSA GYE Ủ 37 0 C/6 ngày Ủ 37 0 C/6 ngày Ủ 37 0 C/2 ngày, tiếp tục ủ ở 50 0 C/2 giờ và 70 0 C/2 giờ Ủ 37 0 C/2 ngày, tiếp tục ủ ở 50 0 C/2 giờ và 70 0 C/2 giờ Thu sinh khối (a) Thu sinh khối (a) Thu sinh khối (a) Kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối (b) So sánh số lƣợng bào tử và đánh giá khả năng hình thành bào tử trong mỗi thí nghiệm bố trí Kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối (b) Kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối (b) Kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối (b) Thu sinh khối (a) 37 Ghi chú: (a) xem phƣơng pháp thu sinh khối (b) xem phƣơng pháp kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối o Phƣơng pháp thu sinh khối  Nguyên tắc Nhằm đảm bảo thu một lƣợng sinh khối đồng đều giữa các đĩa, chúng tôi dùng cùng một lƣợng thể tích dung dịch để đồng nhất sinh khối và thu nhận một thể tích dịch sinh khối nhất định.  Tiến hành Hút 6 ml NaCl 9% 0 vào mỗi đĩa. Dùng que cấy trang trộn đều sinh khối trên mặt thạch NaCl 9% 0 . Chuyển 4 ml dịch sinh khối vào ống nghiệm. o Phƣơng pháp kiểm tra số lƣợng bào tử trong sinh khối [9,40]  Nguyên tắc Số lƣợng bào tử L. sporogenes trong sinh khối chỉ có thể đếm đƣợc sau khi đã pha loãng nhiều lần và cấy trang trên đĩa. Ngoài ra, để đánh giá chính xác số lƣợng bào tử trƣớc khi cấy trang, chúng tôi gia nhiệt những ống pha loãng ở nhiệt độ và thời gian thích hợp để tiêu diệt toàn bộ tế bào sinh dƣỡng. Những bào tử còn sống sau quá trình gia nhiệt sẽ hồi sinh trở lại khi cấy trang. Vì vậy, số khuẩn lạc đặc trƣng thu nhận đƣợc cũng tƣơng ứng với số bào tử trong dịch pha loãng.  Tiến hành Từ sinh khối thu đƣợc, hút 1ml và đồng nhất trong 9 ml NaCl 9% 0 để có nồng độ pha loãng 10 -1 . Hút tiếp 1 ml và đồng nhất trong 9 ml NaCl 9% 0 để có nồng độ pha loãng 10 -2 . Tiếp tục nhƣ thế cho đến nồng độ pha loãng 10 -9 . Giữ 3 ống 10 -7 ,10 -8 , 10 -9 bồn nƣớc 100 0 C/10 phút. Hút 0,1 ml dịch khuẩn ở 3 nồng độ trên và trang trên 2 loại môi trƣờng thạch đĩa GYE và MRSA, nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 37 0 C/48 giờ. Đếm số lƣợng khuẩn lạc trong mỗi đĩa và tính số bào tử có trong sinh khối ban đầu.  Tính kết quả Số khuẩn lạc trong 1 g hay 1 ml dịch mẫu ở mỗi độ pha loãng 38 Công thức Số khuẩn lạc trung bình trong 1 g hay 1 ml mẫu ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp khác nhau 3.4.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu Số liệu đƣợc xử lý thống kê bằng phần mềm Statgraphics 7.0 để so sánh số lƣợng bào tử khác nhau ở các điều kiện khảo sát V 1 h 1 x N X X: số lƣợng khuẩn lạc trong 1 g mẫu hay 1 ml dịch mẫu N: tổng số khuẩn lạc trong các đĩa cùng nồng độ pha loãng x: số đĩa cùng nồng độ pha loãng h: nồng độ pha loãng (10 -7 , 10 -8 , 10 -9 ) V: thể tích dịch mẫu cấy trên 1 đĩa (ml) 3 XXX Y 321 Y: số khuẩn lạc trung bình ở các nồng độ pha loãng X 1 , X 2 , X 3 : số lƣợng khuẩn lạc trung bình có trong 1 g hay 1 ml mẫu ở các nồng độ pha loãng 39 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.4. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus sporogenes 4.4.1. Kết quả phân lập Từ chế phẩm, chúng tôi phân lập đƣợc 20 chủng L. sporogenes (xem Bảng 4.1) Bảng 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn L. sporogenes Số khuẩn lạc nghi ngờ đƣợc chọn Khuẩn lạc có hình thái vi/đại thể phù hợp với L. sporogenes Khuẩn lạc có sinh hóa phù hợp với L. sporogenes 20 Số lƣợng Tỷ lệ (%) Số lƣợng Tỷ lệ (%) 20 100% 20 100% Vì 100% khuẩn lạc nghi ngờ đƣợc chọn đều có hình thái vi thể và đặc điểm sinh hóa phù hợp với L. sporogenes nên chúng tôi kết luận trong chế phẩm của Thorne Research (USA) chỉ thuần một loại vi khuẩn L. sporogenes. 4.4.2. Đặc điểm hình thái của L. sporogenes 4.4.2.1. Quan sát khuẩn lạc Vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng GYE ở 37 0 C/48 giờ. Chúng tôi quan sát đƣợc hình dạng khuẩn lạc nhƣ sau: tròn, lồi, đều, màu vàng, bề mặt mịn; đƣờng kính khuẩn lạc trung bình 2 – 3 mm; vùng môi trƣờng xung quanh khuẩn lạc chuyển từ màu tím sang màu vàng. 4.4.2.2. Quan sát hình thái tế bào Hình 4.1: Khuẩn lạc vi khuẩn L. sporogenes trên môi trƣờng GYE 40 Chúng tôi tiến hành nhuộm Gram khuẩn lạc điển hình phân lập đƣợc trên môi trƣờng thạch GYE sau 48 giờ ủ ở 37 0 C. Vi khuẩn đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần (100X). Hình thái của tế bào vi khuẩn đƣợc chúng tôi ghi nhận nhƣ sau: hình que, bắt màu Gram (+), 2 đầu hơi tròn, không tạo chuỗi; kích thƣớc tế bào 0,4 – 0,8 µm  2,1 – 4,5 µm; bào tử nằm về một đầu tế bào (xem Hình 4.2). 4.4.2.3. Quan sát hình thái bào tử Chúng tôi tiến hành nhuộm bào tử từ mẫu khuẩn lạc điển hình trên môi trƣờng GYE sau 72 giờ ủ ở 37 0 C. Bào tử quan sát trên kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần có những đặc điểm sau: hình bầu dục; phình to ở một đầu tế bào; bắt màu hồng; kích thƣớc 1 – 1,2 µm  1,2 – 1,8 µm. 4.4.3. Đặc điểm sinh hóa của L. sporogenes Từ 20 chủng L. sporogenes phân lập đƣợc, chúng tôi tiến hành thử phản ứng sinh hóa. Kết quả ghi nhận đƣợc trình bày qua bảng 4.2 Hình 4.2: Tế bào vi khuẩn L. sporogenes đƣợc phóng đại 1000 lần dƣới kính hiển vi . PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4. 4. Phân lập vi khuẩn Lactobacillus sporogenes 4. 4.1. Kết quả phân lập Từ chế phẩm, chúng tôi phân lập đƣợc 20 chủng L. sporogenes (xem Bảng 4. 1) Bảng 4. 1 Kết. khuẩn L. sporogenes. 4. 4.2. Đặc điểm hình thái của L. sporogenes 4. 4.2.1. Quan sát khuẩn lạc Vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng GYE ở 37 0 C /48 giờ. Chúng tôi quan sát đƣợc hình dạng khuẩn. 31 3 .4. 2.1 Quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào [9, 40 ]  Hình thái khuẩn lạc Sơ đồ 3. 3: Quy trình phân lập và quan sát hình thái khuẩn lạc trên đĩa [9, 40 ] Hình dáng khuẩn lạc: lồi,