11 có bổ sung BA (5,0mg/L), Ki (0,5mg/L) và IBA (0,5mg/L) là thích hợp cho khả năng biệt hóa chồi từ mô sẹo. Ở nồng độ BA (3,0mg/L), Ki (0,5mg/L) và IBA (0,5mg/L) chồi sẽ phát triển mạnh hơn, chồi lớn hơn và khi cắt chồi nuôi cấy trên môi trƣờng MS thì khả năng tạo rễ và phát triển tốt hơn những môi trƣờng còn lại. Môi trƣờng tạo rễ là ½ MS + NAA (0,1-1,0mg/L) hoặc IBA (0,1-1,0mg/L). Môi trƣờng ½ MS có bổ sung than hoạt tính (1,0mg/L) là thích hợp để cây ra rễ ở cây hồ tiêu, không cần sử dụng Auxin cho mục đích ra rễ (Đoàn Thị Ái Thuyền, Thái Xuân Du và Đỗ Văn Giáp, 2003). 2.3.2 Một số công trình nghiên cứu nuôi cấy cây hồ tiêu ở nƣớc ngoài: Phƣơng pháp vi nhân giống tạo dòng cây hồ tiêu sử dụng các mảnh cấy nhƣ: đầu rễ, mắt nhánh và chồi ngọn từ cả cây tiêu non và cây trƣởng thành (Mathews và Rao, 1984; Agarwal, 1988; Philip và ctv. 1992; Nazeem và ctv. 1993; Nirmal Babu và ctv. 1993; Joseph và ctv. 1996; Lissamma và ctv. 1996). Trong phƣơng pháp vi nhân giống cây tiêu bị gây trở ngại do sự nhiễm của vi sinh vật (Kelkar và Krishnamurthy, 1996). Trong đó việc nuôi cấy hạt tiêu là ít bị nhiễm nhất. Tốc độ nhân chồi của tiêu khoảng 6 chồi / 90 ngày nuôi cấy. Các cây con in vitro phải đƣợc để trong phòng ẩm mát khoảng 20-30 ngày để cây con có điều kiện phát triển cứng cáp và thích nghi dần với điều kiện sống bên ngoài. Cây tiêu in vitro phát triển khá tốt trên đồng ruộng. Qua báo cáo sớm về phƣơng pháp nuôi cấy in vitro cây tiêu (Chua 1981, Fitchet 1988), phenolic đƣợc tiết ra từ vết cắt của mẫu cấy và vi sinh vật gây nhiễm nội sinh trong mẫu cấy (Mohan 1985, Fitchet 1988) là hai yếu tố ngăn cản qui trình nhân giống in vitro cây tiêu. Madhusudhanan và Rahiman (1996) báo cáo họ đã sử dụng hoạt chất charcoal (200mg/L) kết quả là đã làm giảm đƣợc sự hóa nâu mẫu cấy của các giống tiêu P. nigrum, P. longum, P. attenuatum và P. betle. Sự kết hợp chất kháng sinh trong môi trƣờng nuôi cấy đã kiểm soát đƣợc vi sinh vật nội sinh trong cây tiêu nuôi cấy theo Kelkar và Krishnamurthy (1996). Tái sinh cây tiêu từ nuôi cấy mô sẹo đã đƣợc hệ thống hóa mô sẹo phát triển thành lá và chồi để tái sinh cây tiêu mới (Nirmal Babu và ctv. 1993, Nazeem và ctv. 1993, Bhat và ctv. 1995). Cây mới đƣợc tái sinh trực tiếp từ mô lá thông qua giai đoạn mô sẹo (Nirmal Babu và ctv. 1993). 12 Những báo cáo về phƣơng pháp vi nhân giống cây tiêu đã đóng góp quan trọng cho nền kinh tế và mối liên hệ giữa các giống tiêu: Piper viz, P. longum, P. chaba, P. betle, P. colubrinum, P. attenuatum và P. barberi. Các Protocol của P. longum có tốc độ nhân dòng nhanh bắt đầu từ các đầu rễ (Sarasan và ctv. 1993, Nirmal Babu và ctv. 1993, Rema và ctv. 1995). Phƣơng pháp vi nhân giống cây tiêu P. chaba đã đƣợc (Nirmal Babu và ctv. 1993, Rema và ctv. 1995) tiêu chuẩn hóa. Sự chuyển hóa của mô phân sinh rễ và mô phân sinh ngọn đã giúp cây con phát triển, ở cây tiêu P. longum và P.colurinum đã đƣợc báo cáo về vấn đề này (Nirmal Babu và ctv. 1993). Các cây con in vitro của giống tiêu này đã đƣợc đánh giá, thử nghiệm ở phòng thí nghiệm nghiên cứu chủng loại Calicus ở Ấn Độ. Cây tiêu đã đƣợc tái sinh từ lá và thân là: P. longum, P. betle, P. chaba, P. attenuatum và P. colubrinum chúng tái tạo các cơ quan một cách trực tiếp hoặc gián tiếp (Bhat và ctv. 1992, Bhat, ctv. 1995, Rema và ctv. 1995, Madhusudhanan và ctv. 1996). 2.4 Nhóm các chất điều hòa tăng trƣởng ảnh hƣởng tới quá trình nuôi cấy mô Sự hiện diện của các hormone tăng trƣởng đã đƣợc khám phá ra cuối thế kỷ 20. Trong đó chất Auxin là chất đƣợc khám phá đầu tiên vào năm 1934, kế đến là các chất Gibbérellines và chất cytokinin trong những năm 1950. Các hormone này đều có tác dụng kích thích lên sự chuyển hóa của tế bào .Các chất này có nguồn gốc nội sinh, ngoài ra còn có các chất tổng hợp khác do con ngƣời điều chế mà nó có công thức hóa học gần giống hoặc khác với các chất trong thiên nhiên, nhƣng chúng biểu hiện một hoạt động về một sinh lý tƣơng tự. *Một số đặc tính cơ bản của các chất kích thích sinh trưởng Chúng hoạt động ở liều rất yếu; ở liều cao chúng trở nên độc, điều này cho phép một số chất kích thích tố đƣợc sử dụng nhƣ thuốc diệt cỏ. Chúng can thiệp vào nhiều hiện tƣợng sinh lý, điều này bao hàm ít nhiều dạng thức hoạt động của chúng, từ sự kiện này khái niệm về “hormone chuyên biệt” hiện tại đã đƣợc bỏ đi. 2.4.1 Auxin Auxin đƣợc khám phá ra do các thí nghiệm thực hiện trên các phản ứng về đƣờng cong của loài Coléoptiles họ Graminées. Do có tác dụng trong hoạt động kéo dài tế bào nên có tên nhƣ vậy. Đây là một chất có nhân indole, có công thức nguyên là C 10 H 9 O 2 N, có tên là acid indole β acetique hoặc acid β indolylacétique. 13 2.4.1.1 Tính chất sinh lý của Auxin Auxin can thiệp vào nhiều hiện tƣợng sinh lý, hoạt động của nó phụ thuộc vào nồng độ và các sự hỗ tƣơng qua lại của chúng với các chất điều hòa khác. Các tác động của Auxin đƣợc thể hiện nhƣ sau: Kéo dài tế bào: làm ra tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nƣớc vào bên trong tế bào; lúc đó sự đề kháng của thành tế bào giảm đi và tế bào tự kéo dài ra. Sự thay đổi về tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng một sự phóng thích ion H + , ion này gây ra một hoạt tính acid có tác dụng làm giảm tính đề kháng của thành tế bào và bởi sự hấp thu ion K + . Một hoạt động tổng quát trên sự chuyển hóa và đặc biệt là trên sự tổng hợp ARN robosomique. Sự kích thích về sự phân chia tế bào đối với các tế bào nguồn gốc cambium. Hiệu quả này là do chất “histogène” bởi vì nó dẫn đến có nhiều tế bào giống nhau hoàn toàn, các tế bào này tạo nên một “mô sẹo”. Hoạt động lên sự tổng hợp ethylene bắt đầu từ một vài nồng độ; chất etylen tham gia trong giai đoạn trở về để điều chỉnh tỉ lệ chất auxin, ít nhất ở mức độ chuyên chở. Hoạt động trong các phản ứng về tăng trƣởng và trong các sự hỗ tƣơng giữa các cơ quan với nhau, đặc biệt về tính ƣu thế của chồi non. Có tác dụng làm giảm sự rụng lá và trái. Có tác dụng kích thích tạo rễ. 2.4.1.2 Auxin trong cây trồng Tất cả cây trồng đều tổng hợp đƣợc chất auxin dạng tổng hợp tùy theo giai đoạn phát triển của chúng. Chất auxin sinh ra đƣợc hiện diện trong các lá rất non, trong các chồi đang hoạt động, ở mức độ phát hoa và ở trên các quả còn non. Auxin lƣu thông từ đỉnh xuống phần dƣới các cơ quan với một sự phân cực rõ ràng đƣợc thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non, nhƣng trong quá trình chuyển vận này chúng bị thoái hóa bởi sự auxin-oxydases, điều này cho thấy nồng độ auxin thì luôn cao hơn gần với những nơi tổng hợp chúng. Nhƣ vậy, auxin hiện diện với nồng độ vừa đủ ở mức các điểm tăng trƣởng hoặc ở phát hoa để đảm bảo sự nhân giống và kéo dài tế bào. 14 2.4.1.3 Các chất auxin tổng hợp Gồm các chất chính sau:  Acid indolylbutyrique (AIB)  Acid naphtylacetique (ANA) hoặc các chất dẫn xuất của chúng nhƣ:  Acid naphtyloxyacetique (ANOA)  Acid naphtylacétamide (NAD)  Acid 2,4 dichrolophen-oxyacetique (2,4-D) Trong lĩnh vực nuôi cấy in vitro, những chất giống đƣợc sử dụng và auxin đã chiếm một vị trí quan trọng hơn, hai tính chất của chúng đƣợc nghiên cứu thuộc lĩnh vực nhân tế bào và hiệu quả ra rễ. Ngoài ra, trong thực tiễn chúng còn đƣợc dùng để giâm cành, để làm sáng quả, sự đậu quả và làm chậm sự thu hoạch quả. (Dƣơng Công Kiên, 2002) 2.4.2 Gibbérelline Gibbérelline đã nổi bật rất lâu trƣớc khi đƣợc nhận dạng. Chất Gibbérelline đầu tiên đƣợc nhận dạng là acid gibbérellique hoặc là GA 3 , kế đến là GA 4 + GA 7 và GA 7 . Tất cả các Gibbérelline thể hiện một nhân giống nhau; chúng có sự khác nhau bởi chất lƣợng và vị trí của các chất gắn trên nhân. 2.4.2.1 Tính chất sinh lý của Gibbérelline Hoạt động kéo dài các đốt của cây, hoạt động này cũng có thể áp dụng lên các cuống hoa và điều này cho phép có một sự chín tốt hoặc những phát hoa phát triển hơn. Trong nuôi cấy in vitro, Gibbérelline có tác động đối với nhiều đỉnh sinh trƣởng, nếu thiếu Gibbérelline đỉnh sinh trƣởng thể hiện một dạng hình cầu, tạo nên các mắt cây. Hoạt động phức tạp trong sự ra hoa. Tác động lên sự đậu trái của các trái không hạt. Tác động gây thức giấc các chồi, mầm ngủ trên các hạt giống làm thuận lợi cho sự nảy mầm. Trong lĩnh vực sinh tạo cơ quan thực vật, Gibbérelline cho thấy các hoạt động đối kháng: chúng dƣờng nhƣ đối ngƣợc với hiện tƣợng phân hóa tế bào. Trong nuôi cấy in vitro Gibbérelline không đƣợc sử dụng vào mục đích này, nhƣng 15 chúng có công dụng với các mô đã có tổ chức (đỉnh sinh trƣởng, chồi ngọn, chồi thân…). 2.4.2.2 Gibbérelline trong cây trồng Gibbérelline đƣợc tìm thấy trong tất cả các loại cây và trong các loại nấm, ở đây chúng đƣợc phân bố không đồng đều, một vài loại có trong vài loại cây, một vài loại nấm và một vài chất Gibbérelline có trong cả hai nhóm (nhƣ GA 1 , 3, 4, 7, 9). Trong cây trồng, một vài loại cây chỉ có một chất Gibbérelline, các loài cây khác có thể có nhiều loại chất Gibbérelline. 2.4.3 Cytokinine Cytokinine đƣợc khám phá do trung gian của sự nuôi cấy in vitro. Ngƣời ta đã biết sự thêm nƣớc dừa vào môi trƣờng nuôi cấy gây ra hiệu quả làm thuận lợi cho việc nhân chia tế bào và cho việc hình thành các chồi. Vào năm 1956, Skoog đã cô lập đƣợc một chất rất hoạt động mà ngƣời ta đặt tên là kinétine, do ADN biến chất. Cytokinine là các chất adenine đƣợc thay thế, chất này đƣợc ngƣời ta biết qua 2 nhóm nội sinh là:  Zeatine.  Isopentényladénine (IPA), Cytokinine tự nhiên và các chất tổng hợp. Có hai loại đƣợc sử dụng nhiều nhất là:  Kinetine ( 6 furfuryl-aminopurine).  Benzyladenine (BAP) (6-benzyl- aminopurine). 2.4.3.1 Tính chất sinh lý của Cytokinine Tác động hiệu quả rất rõ lên sự phân chia tế bào, trong quá trình này, chúng cần thiết nhƣng chúng không hiệu quả nếu vắng mặt auxin: Cytokinine là chất bổ sung; auxin làm thuận lợi cho sự nhân đôi của acid desoxyribonucleique (ADN) và Cytokinine cho phép làm tách rời các chromosome. Có vai trò rất rõ trong việc tạo cơ quan thực vật, ở đây chúng sẽ kích thích mạnh mẽ sự thành lập các chồi non. Trái lại, chúng là chất đối kháng với sự tạo rễ. Hoạt động kích thích trên sự chuyển hóa, làm thuận lợi một phần việc tổng hợp protein, mặt khác trong lúc bảo vệ các chất chuyển hóa chống lại tác động của enzyme li giải. Hiệu quả đối kháng của tính ƣu thế chồi non: các chồi nách đƣợc xử lí Cytokinine sẽ tăng trƣởng và cạnh tranh với chồi tận cùng. 16 Cytokinine có vai trò quan trọng trong nuôi cấy in vitro, nó thể hiện các tính chất cần thiết để duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hƣớng tế bào trong con đƣờng phân hóa. 2.4.3.2 Cytokinine trong cây trồng Đƣợc tìm thấy đầu tiên vào năm 1963 trong các phôi còn non của cây ngô (là zeatine); chất thứ hai là IPA thấy ở trong cây bị nhiễm vi khuẩn corynebacterium fascines. Chúng định vị ở lá non trong chồi và ở các đầu của rễ cây. 17 PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu - Thời gian thực hiện từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2005 - Địa điểm thực hiện tại Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Trƣờng Đại Học Nông Lâm – TP.HCM. 3.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 3.2.1 Phòng chuẩn bị Tủ sấy: để sấy khô các dụng cụ. Nồi hấp autolave: hấp vô trùng môi trƣờng và dụng cụ nuôi cấy. Tủ lạnh: để bảo quản hóa chất và môi trƣờng dự trữ. Bể rửa chai, ống nghiệm. Bếp điện: để nấu môi trƣờng và hấp cách thủy hóa chất. Cân phân tích: để cân đƣờng, Agar, các hóa chất. Máy đo pH. 3.2.2 Phòng cấy Tủ cấy vô trùng. Đèn cực tím. Giá, bàn để môi trƣờng và mẫu cấy. Các dụng cụ cấy gồm: dao cấy, kéo, pince, đèn cồn, bình phun và bông gòn tất cả đã đƣợc hấp vô trùng. 3.2.3 Phòng nuôi cây Kệ đặt chai hoặc ống nghiệm nuôi cấy, trên mỗi kệ đều lắp đèn huỳnh quang dài 1,2m. Máy điều hòa nhiệt độ để đảm bảo nhiệt độ phòng nuôi cây là 25 ± 2 0 C. Nhiệt kế để đo nhiệt độ phòng nuôi cây. Ẩm kế để đo độ ẩm của phòng nuôi cây. 18 3.2.4 Môi trƣờng cơ bản dùng trong thí nghiệm Môi trƣờng dùng trong thí nghiệm là MS (Murashige & Skoog), gồm các thành phần sau: Nguyên tố đa lượng: NH 4 NO 3 1650 mg/L KNO 3 1900 mg/L MgSO 4 .7H 2 O 370 mg/L KH 2 PO 4 170 mg/L CaCl 2 .2H 2 O 440 mg/L Nguyên tố vi lượng: H 3 BO 3 6,2 mg/L MnSO 4 .4H 2 O 22,5 mg/L ZnSO 4 .7H 2 O 8,6 mg/L KI 0,83 mg/L Na 2 MoO 4 .2H 2 O 0,25 mg/L CuSO 4 .5H 2 O 0,025 mg/L CoCl 2 .6H 2 O 0,025 mg/L Vitamins: Inositol 100 mg/L Nicotinic 0,5 mg/L Pyridoxin Hcl 0,5 mg/L Thiamin Hcl 0,1 mg/L Glyxin 2 mg/L Fe EDTA: FeSO 4 .7H 2 O 27,8 mg/L Na 2 EDTA.2H 2 O 37,3 mg/L 3.3. Vật liệu nuôi cấy Đối tƣợng đƣợc dùng để thí nghiệm là cây tiêu LadaBelangtoeng. 3.4. Phƣơng pháp thí nghiệm Trong giới hạn của đề tài chúng tôi chỉ tập trung nghiên cứu các nội dung: 19 Hiệu quả khử trùng của hai loại kháng sinh Tetracylin, Streptomycin. Nghiên cứu khả năng tạo mô sẹo từ các mẫu lá trên môi trƣờng nuôi cấy khác nhau về tỷ lệ chất kích thích sinh trƣởng. Nghiên cứu khả năng tạo chồi từ các mô sẹo trên môi trƣờng nuôi cấy khác nhau về tỷ lệ chất kích thích sinh trƣởng. Các nội dung trên đƣợc nghiên cứu lần lƣợt qua các thí nghiệm. 3.4.1. Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu cấy 3.4.1.1 Thí nghiệm 1a: Khảo sát việc khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch thuốc kháng sinh Tetracylin. 3.4.1.2 Thí nghiệm 1b:Khảo sát việc khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch thuốc kháng sinh Streptomycin.  Bố trí thí nghiệm 1a và 1b: Thực hiện thí nghiệm về thời gian xử lí kháng sinh. - Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại 10 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm cấy một mẫu. - Thí nghiệm gồm 3 nghiệm thức - Tổng số ống nghiệm cho mỗi nghiệm thức: 30 - Tổng số mẫu cho mỗi nghiệm thức: 30 - Tổng số mẫu trong thí nghiệm: 90 Bảng 3.1 Mô tả thí nghiệm 1a Tên NT Kháng sinh Nồng độ kháng sinh (g/L) Mẫu cấy Số ống nghiệm Số chồi T2 T6 T10 Tetracylin Tetracylin Tetracylin 2,5 2,5 2,5 chồi tiêu chồi tiêu chồi tiêu 30 30 30 30 30 30 Bảng 3.2 Mô tả thí nghiệm 1b Tên NT Kháng sinh Nồng độ kháng sinh (g/L) Mẫu cấy Số ống nghiệm Số chồi S2 S6 S10 Streptomycin Streptomycin Streptomycin 2,5 2,5 2,5 chồi tiêu chồi tiêu chồi tiêu 30 30 30 30 30 30 20  Tiến hành thí nghiệm: * Chuẩn bị mẫu: Cắt phần ngọn của cây tiêu dài khoảng 3-5 cm rồi cắt bỏ hết phần lá. Rửa sạch mẫu dƣới vòi nƣớc. Lắc mẫu trong dung dịch xà bông loãng khoảng 15 phút, rồi rửa sạch lại mẫu dƣới vòi nƣớc cho sạch xà bông. Cho mẫu vào dung dịch kháng sinh Tetracylin hoặc Streptomycin đã pha sẵn, rồi bỏ lên máy lắc và tính giờ để lấy mẫu ra. * Vào tủ cấy: Rửa lại mẫu bằng nƣớc cất vô trùng 3 lần. Ngâm mẫu trong dung dịch nƣớc Javel với tỷ lệ giữa nƣớc và Javel là 1:1 trong khoảng 15 phút. Rửa sạch Javel trong nƣớc cất vô trùng 3 lần. Lắc mẫu trong dung dịch cồn 70 o trong 30 giây. Rửa lại nƣớc cất vô trùng 3 lần. Lột bỏ hết lớp lá cho tới khi lộ ra phần ngọn nhỏ màu xanh (không còn phần màu đen) thì dùng dao cấy bén cắt lấy phần ngọn này (dài khoảng 0,5 – 1 cm). Đƣa các phần ngọn này vào trong các ống nghiệm đã chuẩn bị sẵn môi trƣờng của thí nghiệm này là: khoáng MS + 8,5g/L Agar + 10g/L Đƣờng saccharose.  Điều kiện thí nghiệm: Môi trƣờng: Các mẫu ngọn đƣợc nuôi trên môi trƣờng khoáng MS + 8,5g/L Agar + 10g/L Đƣờng saccharose. Môi trƣờng đã khử trùng ở 1.2 atm, 121 o C trong thời gian 25 phút. pH môi trƣờng: 5.8 Thể tích môi trƣờng: 15ml / ống nghiệm Cƣờng độ ánh sáng: 100µmol/m 2 .s Thời gian chiếu sáng: 16 giờ / ngày Nhiệt độ: 25 ± 2 0 C Ẩm độ: 65 ± 5% Thời gian thí nghiệm là 15 ngày . Thái Xuân Du và Đỗ Văn Giáp, 20 03) . 2 .3. 2 Một số công trình nghiên cứu nuôi cấy cây hồ tiêu ở nƣớc ngoài: Phƣơng pháp vi nhân giống tạo dòng cây hồ tiêu sử dụng các mảnh cấy nh : đầu rễ, mắt nhánh. Streptomycin 2,5 2,5 2,5 chồi tiêu chồi tiêu chồi tiêu 30 30 30 30 30 30 20  Tiến hành thí nghiệm: * Chuẩn bị mẫu: Cắt phần ngọn của cây tiêu dài khoảng 3- 5 cm rồi cắt bỏ hết phần. Tetracylin 2,5 2,5 2,5 chồi tiêu chồi tiêu chồi tiêu 30 30 30 30 30 30 Bảng 3. 2 Mô tả thí nghiệm 1b Tên NT Kháng sinh Nồng độ kháng sinh (g/L) Mẫu cấy Số ống nghiệm Số