21 kháng thuốc diệt cỏ (Chen và ctv., 1994; Perlak và ctv., 1990). Các loại mẫu cấy nhƣ trụ hạ diệp, tử diệp, mô sẹo từ trụ hạ diệp và tử diệp cũng nhƣ phôi non đã đƣợc dùng trong việc chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens hay nhờ súng bắn gen (Firoozabady và ctv., 1987, Perlak và ctv., 1990). Gould và Cedeno (1998) đã sử dụng đỉnh chồi làm mẫu cấy phục vụ cho việc chuyển nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Ngoài ra còn có các mô phân sinh phân lập từ trục phôi đã đƣợc sử dụng cho việc chuyển gen bằng súng bắn gen ở bông vải (Chlan và ctv., 1995). Chuyển gen bằng súng bắn gen đã đƣợc Finer và McMullen (1990) thực hiện trên dịch huyền phù tế bào và kết quả là thu đƣợc cây chuyển gen. Trƣớc đó Finer và Smith (1984) đã thực hiện nghiên cứu tạo mô sẹo và phôi soma từ mẫu cấy là thân và cuống lá. Súng bắn gen cũng đƣợc sử dụng để chuyển gen vào các mô thu đƣợc từ việc tái sinh phôi soma (Rajasekaran, 1996, Reichert và ctv., 2002). Tuy nhiên tỉ lệ chuyển gen thƣờng khá thấp, biến động 20 – 30% khi trụ hạ diệp đƣợc dùng làm mẫu cấy (Firoozabady và ctv., 1987, Rajasekaran, 1996). Một hiệu quả chuyển gen cao hơn có ý nghĩa (đến 60%) đã đƣợc công bố khi trụ hạ diệp đƣợc dùng làm mẫu cấy và gen onc (mã hóa cho enzyme tổng hợp octopin-octopin synthase) đƣợc dùng làm gen chỉ thị (Firoozabady và ctv., 1987). Chaudhary và ctv. (2003) cũng báo cáo với mẫu lây nhiễm là phôi soma sau khi thanh lọc tỉ lệ mẫu biểu hiện GUS là 75%. Nhƣng chỉ là kết quả của thử nghiệm sự biểu hiện gen tạm thời của gen onc và gen gus. Một báo cáo gần đây cho rằng hiệu quả chuyển nạp ở song tử diệp chỉ khoảng 20-30%, hiệu quả chuyển nạp gen thậm chí còn thấp hơn khi sử dụng phƣơng pháp bắn gen. Nhiều công trình nghiên cứu đã công bố sự khác biệt giữa các loại mẫu cấy đƣợc dùng trong chuyển nạp gen có ảnh hƣởng đến hiệu quả của chuyển nạp gen và tái sinh cây. Ví dụ ngƣời ta cho rằng để giảm thiểu các thể chuyển nạp dƣơng tính giả, tử diệp là mẫu cấy tốt hơn trụ hạ diệp (Firoozabady và ctv., 1987). Nghiên cứu về chuyển nạp gen trên cây bông vải, Sunilkumar và Rathore (2001) đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Nghiên cứu này cho thấy các yếu tố nhƣ chủng vi khuẩn, acetosyringone và nhiệt độ trong chuyển gen có ảnh hƣởng đáng kể đến hiệu quả chuyển gen. Thêm vào đó kích thƣớc mẫu cấy cũng ảnh hƣởng đến sự sống sót của các mẫu cấy trên môi trƣờng chọn lọc (Sunilkumar và Rathore, 2001). Theo Chen và ctv. (2000) để chuyển nạp gen có hiệu quả nhiệt độ trong giai đoạn đồng nuôi cấy không lớn hơn 28 0 C, thời gian chiếu 22 sáng 16h sáng/8h tối là thích hợp cho tất cả các giai đoạn chuyển nạp gen và tái sinh. Ngoài ra, pH môi trƣờng nuôi cấy cũng ảnh hƣởng đáng kể đến hiệu quả chuyển nạp gen. Sự chuyển nạp gen cũng phụ thuộc vào kiểu gen. Chỉ có một số giống nhất định mới có khả năng tái sinh và chuyển nạp gen nhƣ bông Luồi Coker 312 và Jin 7, còn hầu hết các giống khác thƣờng khó có thể tái sinh và chuyển nạp đƣợc. Sự thiếu một phƣơng pháp tái sinh cây hiệu quả đã đƣợc xem nhƣ là một rào cản chính cho việc áp dụng phƣơng pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens ở bông vải (Firoobady và ctv., 1987). Để cải tiến phƣơng pháp chuyển nạp, một quy trình chuyển gen hiệu quả cao dùng cuống lá và trụ hạ diệp cây mầm làm mẫu cấy phải đƣợc phát triển, cùng với môi trƣờng cải tiến thích hợp. Hiện nay, Trung Quốc thành công trong việc chuyển nạp gen vào cây bông vải bằng phƣơng pháp tiêm DNA qua ống phấn, nhƣng phƣơng pháp này gặp khó khăn trong việc xác định cây chuyển gen vì rất nhiều cây đƣợc tạo thành nhƣng chỉ một số ít cây đƣợc chuyển nạp gen (Chen và ctv., 2000). 2.3. Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Chuyển nạp gen là kỹ thuật chuyển gen ngoại lai vào bộ gen sinh vật đang nghiên cứu. Những thành tựu của kỹ thuật nuôi cấy mô và kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã mở ra triển vọng đối với chuyển nạp gen ở thực vật bậc cao, tạo ra các cây trồng mang những tính trạng di truyền mong muốn. Chuyển nạp gen thành công trên cây trồng đã đƣợc ghi nhận bằng cách sử dụng vectơ plasmid Ti, thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để đƣa gen mong muốn vào trong bộ gen cây trồng. Phƣơng pháp sử dụng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để chuyển nạp gen còn đƣợc gọi là phƣơng pháp chuyển nạp gen gián tiếp (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000). 23 2.3.1. Đặc điểm vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Chi Agrobacterium đƣợc chia làm một số loài dựa trên triệu chứng gây bệnh và kí chủ. Một số loài thuộc chi Agrobacterium nhƣ: A. radiobacter (loài này không gây bệnh cho cây), A. tumefaciens và A. rhizogens gây bệnh khối u và bệnh cổ rễ, A. rubi gây bệnh khối u trên cây mía. Gần đây nhất một loài mới vừa đƣợc đề nghị là A. vitis, loài này gây bệnh khối u trên cây nho và một số loài cây khác (Ophel và Kerr, 1990). Hình 2.1. Một số khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra. A: một khối u lớn trên thân cây hoa Hồng, B: các khối u trên cành Nho (Deacon và ctv., 2005). Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hình que, gram âm, có khả năng di động, không sinh bào tử và có quan hệ gần gũi với vi khuẩn cố định đạm Rhizobium. (Deacon và ctv., 2005). Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens là vi khuẩn hiếu khí, có 5-11 lông roi. Vi khuẩn này phát triển tối ƣu ở nhiệt độ 29 0 C trong môi trƣờng có bổ sung một chút mangan và succinate nhƣ là nguồn cacbon duy nhất. Agrobacterium tumefaciens là tác nhân gây bệnh cho cây bằng cách tạo khối u trên cây hai lá mầm do nó có khả năng chuyển DNA vào tế bào cây (Hansen và Chilton, 1999, Gelvin, 2000). Khi rễ cây xuất hiện vết thƣơng, tế bào vi khuẩn sẽ di chuyển về phía vết thƣơng và xâm nhập vào cây qua vết thƣơng đó. Vi khuẩn độc mang một hoặc nhiều plasmid, một trong số đó có mang gen tạo khối u và đƣợc biết đến với tên gọi là pTi. Plasmid Ti cũng mang các gen để xác định kí chủ và triệu chứng khi nhiễm vào cây. Những vi khuẩn không mang pTi đƣợc xem nhƣ là vi khuẩn không độc và không có khả năng gây bệnh khối u cho cây. Khối u đầu tiên xuất hiện nhỏ mầu trắng, ban đầu đƣợc tìm thấy ở gốc cây. Các khối u lớn dần và xuất hiện các vết lốm đốm nâu đen do các tế bào ngoại biên chết đi (hình 2.1 và 2.2). Các khối u có thể mềm và xốp, có thể bị vỡ vụn 24 khi chạm vào, nhƣng cũng có thể cứng và xuất hiện các u nhỏ hoặc nhiều mấu. Các khối u có đƣờng kính đến 30 cm nhƣng phổ biến là 5-10 cm. Cây bị nhiễm vi khuẩn sẽ trở nên còi cọc, lá úa vàng và rất nhạy cảm với các điều kiện môi trƣờng. Khi xâm nhiễm vào cây, một phần gen trên pTi sẽ gắn vào nhiễm sắc thể của cây làm cho các tế bào phát triển mạnh và sản xuất ra một chất đặc biệt gọi là Opine. Vi khuẩn sẽ sử dụng chất này nhƣ một nguồn cacbon cho các hoạt động biến dƣỡng(Zhu và ctv., 2000). Hình 2.2. Một khối u do vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens tạo ra (nguồn http://biologi.uio.no/plfys/haa/gen/gmo.htm). Bộ nhiễm sắc thể vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens dạng vòng có kích thƣớc là 2,6 Mb. Ngoài ra vi khuẩn còn mang plasmid lớn có kích thƣớc 200-800 kbp (Gelvin, 2003), chính plamid này là nguyên nhân gây ra khối u trên cây khi vi khuẩn này xâm nhập. Plasmid này có tên gọi là plasmid Ti , hầu hết các gen gây khối u đều nằm trên plasmid này (Deacon và ctv., 2005). 2.3.2. Plamid Ti Plasmid Ti là một DNA vòng tách rời với nhiễm sắc thể và có khả năng nhân lên một cách độc lập trong tế bào vi khuẩn. Việc xác định pTi nhƣ một nguyên lý tạo bƣớu TIP (tumor inducing principle) đã đánh dấu bƣớc khởi động của một giai đoạn mới trong nghiên cứu về Agrobacterium tumefaciens. Điều này đã mở ra khả năng nghiên cứu cấu trúc và chức năng của plasmid bằng kỹ thuật di truyền phân tử (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000). 25 Plasmid Ti có cấu trúc bao gồm: đoạn T-DNA-trình tự mã hoá đƣợc chuyển vào trong cây, vùng vir-vùng trực tiếp tham gia tạo T-DNA sợi đơn và chuyển T-DNA này vào tế bào cây, vùng rep-cần cho sự tái bản của pTi, vị trí tra và trb- tham gia vào quá trình chuyển tiếp hợp của pTi, các gen cần cho việc hấp thu và chuyển hoá các opine (Zhu và ctv., 2000). Trong cấu trúc của pTi, hai yếu tố quan trọng cần cho sự chuyển gen vào cây là đoạn T- DNA bao gồm cả trình tự 25 bp ở hai cánh của đoạn T- DNA và gen Vir (Gelvin, 2003). 2.3.2.1. Chức năng của T-DNA T-DNA đã đƣợc nghiên cứu rất kỹ. Đó là một đoạn DNA có kích thƣớc 10-30 kbp (Gelvin, 2003), trong đó có chứa gen mã hoá cho việc tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u. Trong pTi, vị trí của T-DNA đƣợc giới hạn bởi bờ phải và bờ trái. Trình tự nucleotid của bờ phải và bờ trái tƣơng tự nhau và đều có kích thƣớc 25 bp (Gelvin, 2003). Tuy nhiên, bờ trái của T-DNA có thể đƣợc bỏ qua trong chuyển nạp T-DNA, trong khi đó bờ phải lại cần thiết và đƣợc đề nghị rằng tiến trình chuyển nạp diễn ra với bờ phải trƣớc rồi tiến dần về phía trái. Việc đảo ngƣợc bờ phải sẽ làm yếu đi khả năng tạo khối u (Miranda và ctv., 1992, Gelvin, 2003). Các trình tự bờ không chỉ là mục tiêu của của VirD1/VirD2 endonuclease mà còn là vị trí gắn của protein VirD2. T-DNA mã hóa một vài protein, protein này biểu hiện trong tế bào cây đƣợc chuyển gen làm kiểu hình cây thay đổi lớn. Các gen trên T-DNA có thể biểu hiện trong tế bào cây bằng cách mô phỏng các gen của cơ thể đa bào. Theo Binns và Costantino (1998), T-DNA mã hóa cho 13 protein và những vùng không sao mã của các gen đƣợc chuyển mang nhiều đặc điểm của các gen trong cây bao gồm kiểu hộp TATA (TATA box) và hộp CAAT (CAAT box), yếu tố tăng cƣờng sao mã, các vị trí gắn đuôi poly A của cơ thể đa bào. Một nhóm các gen của T-DNA điều khiển tổng hợp các hormon sinh trƣởng của cây, những hormon này làm các tế bào tăng sinh và làm thay đổi hình dạng bên ngoài. Sản phẩm của gen iaaM và gen iaaH điều khiển sự chuyển hoá tryptophan thông qua indolacetamin thành indolacetic axit (auxin). Sản phẩm của gen ipt giúp gắn kết isopentenyl pyrophosphat với AMP (Binns và Costantino, 1998) và các enzyme trong cây đƣợc cho là chuyển hoá isopentenyl-AMP thành cytokinin zeatin bằng cách loại bỏ nhóm phosphoribosyl và loại bỏ phân tử 26 hydro của một nhóm methyl của isopentenyl. Hai gen trên T-DNA khác đƣợc cho là có chức năng trong tạo khối u là 5 và tml (cũng còn gọi là 6b). Sản phẩm của gen 5 điều khiển sinh tổng hợp indole-3-lactate, đó là một chất đồng đẳng với auxin (Korber và ctv., 1991). Trong khi đó gen tml (cũng còn gọi là 6b) làm tăng mức độ nhạy cảm của các tế bào cây với phytohormon bằng một cơ chế chƣa đƣợc giải thích (Tinland và ctv., 1992). Gen tml có thể kích thích tạo các khối u ngay cả khi vắng mặt các gen gây khối u khác. Một nhóm gen đƣợc chuyển thứ hai điều khiển sản xuất nguồn dinh dƣỡng cho vi khuẩn, đó là các opine. Đây là một dạng kết hợp giữa một amino axit với một ceto (keto) axit hoặc một đƣờng (Dessaux và ctv., 1998). Các tế bào chuyển gen tổng hợp và tiết ra một số lƣợng lớn các opine. Các opine này hấp dẫn vi khuẩn mang kiểu gen tiêu biểu (bên ngoài vùng T-DNA và thƣờng trên plasmid độc) cần cho việc phân giải các opine đƣợc tổng hợp từ khối u (Ziemienowicz, 2001, trích từ Petit và Tempé, 1985). Dựa trên các kiểu opine đƣợc tạo ra từ các khối u mà phân chia nhóm vi khuẩn Agrobacterium thành các chủng nhƣ là: octopine, nopaline, succinamopine và leucinopine. Hiện có ít nhất là 20 loại opine khác nhau, mỗi chủng tạo ra và phân giải một nhóm opine chuyên biệt. Cho ví dụ, các plasmid Ti kiểu octopine điều khiển tổng hợp ít nhất 8 opine. Gen ocs mã hóa cho octopine synthase, enzym này gắn pyruvate với arginine, lysine, histidine hoặc ornithine để tạo ra octopine, lysopine, histopine hoặc octopinic axit và tất cả những opine này đều đƣợc tìm thấy trong các khối u (Dessaux và ctv., 1998). Sản phẩm của gen mas2’ đƣợc cho là làm kết nối glutamine hoặc glutamic axit với glucose (mặc dù điều này chƣa đƣợc chứng minh bằng thực nghiệm), trong khi đó sản phẩm của mas1’ lại làm giảm bớt các dạng trung gian mannopine và mannopinic axit. Sản phẩm của gen ags sẽ làm lacto hóa mannopine thành agropine. Mannopine và agropine cũng có thể lactate hóa thành agropinic axit (Dessaux và ctv., 1998). Bởi vậy, các khối u đƣợc tạo ra bởi plasmid Ti kiểu octopine có thể tạo 4 loại octopine và 4 kiểu thuộc nhóm mannityl opine. 27 2.3.2.2. Chức năng của gen Vir Vùng Vir trên plasmid Ti có khoảng 25 gen đƣợc nhận biết trong 7 đơn vị phiên mã là: virA, virB, virC, virD, virE, virG, virF và vùng này có kích thƣớc khoảng 30- 40 kbp (de la Riva và ctv., 1998). Theo Stachel và ctv. (1987) vùng này có 20 gen nằm trên 6 operon, các gen đó là: virA, virB, virC, virD, virE và virG. Những gen vir này mã hoá cho các vai trò nhƣ: nhận ra tế bào thực vật, tấn công vào tế bào thực vật, tạo đoạn T-DNA sợi đơn, chuyển nạp đoạn T-DNA và có lẽ có cả vai trò trong sự xâm nhập của T-DNA vào tế bào kí chủ (Gelvin, 2003). Các gen vir có vai trò trong việc nhận diện ra vết thƣơng của cây thông qua dấu hiệu hoá học tiết từ vết thƣơng. Các tín hiệu hoá học từ vết thƣơng ở tế bào cây chủ tạo ra đƣợc nhận biết trƣớc tiên bởi protein VirA, rồi đến protein VirG để làm kích hoạt các gen độc khác ở vùng vir, tạo ra các protein cần thiết. Gen vir đƣợc kích hoạt tối đa ở pH axit với sự hiện diện của các hợp chất phenon nhƣ là acetosyringone (AS), chất mà đƣợc giải phóng khi tế bào cây bị tổn thƣơng (Stachel và ctv., 1987). Hệ thống điều hoà gen vir hoạt động thông qua hai gen độc: virA và virG. Biểu hiện cơ bản của gen virA tổng hợp nên protein nằm trong màng tế bào. Protein VirA đáp ứng với sự trao đổi chất của vết thƣơng của cây và có thể đáp ứng nhạy cảm với sự thay đổi của môi trƣờng. Với một nồng độ AS thích hợp VirA có thể đƣợc kích thích bởi đƣờng, các opine khối u hoặc amino axit (Ziemienowicz, 2001). Protein VirA sẽ tự phosphoryl hoá. Sự tự phosphoryl hoá này sẽ làm protein nội bào VirG đƣợc phosphoryl hoá bởi aspartic axit còn lại sau khi VirA tự phosphoryl hoá (Jin và ctv., 1990) và kích hoạt sao mã cho tất cả các gen vir. Các promoter của gen vir có kích thƣớc khoảng 12 bp trong trình tự “vir box” (Winans và ctv., 1987). Sự phosphoryl hoá làm cho protein VirG gắn kết vào “vir boxes” và kích hoạt sự sao mã của các gen virBCDEFGH (Ziemienowicz, 2001). Các gen vir có vai trò trong việc tạo sợi đơn T-DNA trong vi khuẩn (hình 2.3) và đƣa sợi đơn T-DNA vào trong tế bào cây. Các protein đƣợc mã hoá bởi gen virD và virE thực hiện chức năng tạo ra phức hợp T-DNA. Protein VirD2 là một endonuclease, protein này sẽ cắt T-DNA tại vị trí nucleotide thứ 3 và thứ 4 trên trình tự bờ vai 25 bp để tạo ra phân tử sợi đơn T-DNA và liên kết đồng hoá trị với đầu 5’ của sợi đơn T- DNA. Protein VirD2 đƣợc tinh sạch từ oligonucleotide sợi đơn mang các trình tự bờ ở vị trí tƣơng đồng (Deng và ctv., 1998). Protein VirE2 là một protein gắn trên sợi đơn 28 DNA, nó sẽ bảo vệ T-DNA khỏi sự phân giải của các enzyme nuclease trong tế bào cây (Deng và ctv., 1998). Protein VirE2 là protein chiếm số lƣợng nhiều nhất. Protein VirE2 và VirD2 mang trình tự định vị nhân, trình tự này giúp thúc đẩy đƣa phức hợp T-DNA vào nhân. Hai sản phẩm của gen vir cũng đƣợc cho là có chức năng trong việc tạo T-DNA sợi đơn là: VirC1 và VirC2. VirC1 đã đƣợc thấy gắn kết vào vùng “overdrive”, vùng này nằm gần bờ phải, và bởi vậy giúp tăng cƣờng sự cắt T-DNA ở vị trí bờ vai của VirD1/VirD2 endonuclease (Gelvin, 2003). Một số tác giả khác cho rằng VirC1 và VirC2 không cần cho tạo T-DNA sợi đơn. Nhƣng khi vắng mặt hai protein này thì hiệu quả chuyển nạp T-DNA vào cây khá thấp. Do đó đề nghị rằng chúng có chức năng trong việc xuất T-DNA (Zhu và ctv., 2000). Ngoài ra, protein VirD2 đƣợc cho là có chức năng trong sự kết nạp T-DNA, bởi nó gắn vào đầu 5’ của T-DNA, đƣa T-DNA vào nhân tế bào và lƣu lại cùng với T-DNA trong các bƣớc kết nạp. Hai giả thuyết về chức năng của protein VirD2 trong sự kết nạp T-DNA đã đƣợc đề nghị: VirD2 hoạt động nhƣ một enzyme integrase và VirD2 hoạt động nhƣ một ligase (Ziemienowicz, 2001). Cùng với protein VirD4, mƣời một protein VirB, VirE2 và VirF tham gia đƣa T-DNA vào nhân. Hệ thống chuyển nạp T-DNA đƣợc mã hóa bởi operon virB, operon này mang 11 gen. Sự chuyển phức hợp T-DNA dựa trên chiên mao (pili) do operon virB mã hoá và đột biến ở bất kì gen nào trong số 11 gen của operon này đều làm mất khả năng tạo pili và tạo khối u (Lai và Kado, 1998). Các protein VirB điều khiển tạo chiên mao này (chiên mao này tƣơng tự nhƣ chiên mao tiếp hợp) và VirB2 là tiểu phần chính của chiên mao này. Hai protein VirB là VirB4 và VirB11 có hoạt tính ATPase và đƣợc cho là cung cấp năng lƣợng cho việc xuất các tiểu phần protein khác, cho vận chuyển T-DNA, hoặc cả hai. Hệ thống VirB đƣa T-DNA tới tế bào chất của tế bào cây, nơi đây các bƣớc cần cho chuyển T-DNA vào nhân và kết nạp với DNA của cây đƣợc thực hiện (Zhu và ctv., 2000). Cầu nối VirB có thể gắn kết với phức hợp T-DNA bởi protein VirD4, protein này nằm trong màng và rất cần cho việc chuyển nạp. Hệ thống VirB/VirD4 đƣa phức hợp T-DNA–VirD2 và protein VirE2 vào tế bào chất của tế bào cây, phức hợp T-DNA cuối cùng đƣợc tạo ra bằng cách phủ T-DNA với protein VirE2 (Ziemienowicz, 2001). 29 2.3.3.3. Cơ chế lây nhiễm Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens sống phổ biến ở xung quanh và trên bề mặt rễ cây. Vùng mà vi khuẩn sống gọi là vùng rễ, nơi mà vi khuẩn tồn tại nhờ việc sử dụng chất dinh dƣỡng do mô rễ tạo ra. Nhƣng vi khuẩn chỉ xâm nhiễm vào cây khi cây bị tổn thƣơng do nhiều nguyên nhân. Yêu cầu về vết thƣơng cho việc xâm nhiễm có thể dễ dàng đƣợc chứng minh bằng các thí nghiệm. Trong điều kiện tự nhiên, các tế bào vi khuẩn di chuyển đến vị trí vết thƣơng nhờ các dấu hiệu hoá học. Điều này có đƣợc là do đáp ứng giải phóng đƣờng và các thành phần phổ biến khác trong rễ. Tuy nhiên, chủng vi khuẩn có mang pTi sẽ đáp ứng mạnh hơn bởi vì chúng xác định các hợp chất vết thƣơng (hợp chất phenolic) nhƣ acetosyringone. Chất này có tác dụng rất mạnh mặc dù ở nồng độ thấp (10 -7 M). Bởi vậy, một trong những chức năng của pTi là mã hoá cho các thụ thể (receptor) nhận biết các chất hoá học. Những thụ thể này nằm trên màng tế bào vi khuẩn và có thể giúp cho vi khuẩn nhận biết ra các vùng bị tổn thƣơng. Acetosyringone đóng vai trò quan trọng trong tiến trình xâm nhiễm. Ở nồng độ cao (10 -5 – 10 -4 M) hơn nó sẽ kích hoạt các gen vir trên pTi (Deacon và ctv., 2005). Các gen vir đƣợc kích hoạt tốt nhất ở nhiệt độ 25-27 0 C. Tuy nhiên, hầu hết các chủng Agrobacterium hoạt động ổn định ở nhiệt độ 18-20 0 C (Gelvin, 2003) Hình 2.3. Quá trình tạo phức hợp sợi đơn T-DNA (nguồn Valentine, 2003). Sau khi đƣợc kích hoạt, các gen vir sẽ điều khiển quá trình tạo T-DNA sợi đơn trong tế bào vi khuẩn (hình 2.3). Quá trình tạo T-DNA sợi đơn đƣợc thực hiện trong tế bào vi khuẩn và do các protein VirD1 và VirD2 thực hiện. Sau đó protein VirD2 gắn vào sợi đơn T-DNA để tạo thành phức hợp T-DNA. Ngoài VirD1, VirD2 ngƣời ta còn cho rằng VirC1 và VirC2 cũng tham gia vào quá trình tạo T-DNA sợi đơn. Phức hợp 30 T-DNA-VirD2 cùng với protein VirE2 đƣợc chuyển vào trong tế bào cây thông qua hệ thống chuyển nạp đƣợc mã hoá bởi các gen virB. Cùng với một số thành phần trong tế chất của tế bào cây, các protein của vi khuẩn sẽ tiếp tục đƣa phức hợp T-DNA vào trong nhân tế bào (Ziemienowicz, 2001). Hình 2.4. Quá trình kết nạp T-DNA vào bộ gen của tế bào cây (nguồn Valentine, 2003) Trong nhân tế bào cây, T-DNA đƣợc kết nạp vào bộ gen của cây (hình 2.4) không theo một quy luật tái tổ hợp nào cả. Mô hình cơ sở cho sự kết nạp T-DNA vào bộ gen của cây đã đƣợc đề nghị. Theo mô hình này, đầu tiên đầu 3’ của T-DNA nhận diện các đoạn tƣơng đồng với DNA của cây và gắn vào. Cả việc tách sợi DNA của cây và overhang đầu 3’ của T-DNA đều đƣợc enzyme nuclease thực hiện. Cuối cùng nucleotide gắn với VirD2 tìm các đoạn vi tƣơng đồng (microhomology) trên DNA cây và gắn vào. Sự gắn kết này mang cầu nối phosphotyrosine có ái lực điện tử của đầu 5’ đến gần đầu 3’ nucleophilic của DNA cây mà bị tách ra. Cuối cùng sự gắn kết trên sợi DNA của cây đƣợc hoàn thành và cây chuẩn bị một cơ chế sinh tổng hợp đoạn T-DNA dẫn đến sự kết nạp của T-DNA hoàn thành. Cuối cùng, sau khi sự kết nạp hoàn thành các gen trên T-DNA hoạt động tổng hợp nên các sản phẩm cần thiết cho vi khuẩn (Ziemienowicz, 2001). Các opine đƣợc tạo ra từ các khối u do vi khuẩn Agrobacterium nhiễm vào đƣợc vi khuẩn biến dƣỡng nhờ vào các gen ở vùng phân giải opin trên pTi. Tùy theo kiểu opine mà đƣợc chuyển hóa bởi các gen khác nhau (Ziemienowicz, 2001, trích từ Petit và Tempé, 1985). . trong vi c xác định cây chuyển gen vì rất nhiều cây đƣợc tạo thành nhƣng chỉ một số ít cây đƣợc chuyển nạp gen (Chen và ctv., 2000). 2 .3. Chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. . một số giống nhất định mới có khả năng tái sinh và chuyển nạp gen nhƣ bông Luồi Coker 31 2 và Jin 7, còn hầu hết các giống khác thƣờng khó có thể tái sinh và chuyển nạp đƣợc. Sự thiếu một phƣơng. hƣởng đến hiệu quả chuyển nạp gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Nghiên cứu này cho thấy các yếu tố nhƣ chủng vi khuẩn, acetosyringone và nhiệt độ trong chuyển gen có ảnh hƣởng đáng