31 Khả năng chuyển nạp đoạn DNA của Agrobacterium vào trong tế bào cây cung cấp một công cụ mạnh cho công nghệ sinh học thực vật và do đó chuyển nạp gene qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium là một trong những kỹ thuật đƣợc sử dụng phổ biến trong chuyển nạp gene cây trồng. Trong thời gian ban đầu, phƣơng pháp này bị hạn chế chỉ thực hiện trên cây hai lá mầm do tin rằng Agrobacterium chỉ có thể nhiễm vào cây hái lá mầm. Sau này, ngƣời ta tìm ra rằng mặc dù Agrobacterium chỉ tạo khối u trên cây hai lá mầm nhƣng nó có thể nhiễm vào cây một lá mầm và không tạo khối u. (Ziemienowicz, 2001). Hình 2.5. Mô hình chuyển nạp T-DNA từ tế bào vi khuẩn vào tế bào cây (nguồn Zhu và ctv., 2000). 32 CHƢƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu Giống bông vải: hạt của giống bông vải Coker 312 (đối chứng), SSR60F đƣợc thu từ nhà lƣới của Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long. Hạt của các giống bông vải này phải đảm bảo là các hạt tự thụ. Mẫu cấy: Trụ hạ diệp của cây mầm 5-7 ngày tuổi. Dụng cụ, hóa chất, nguồn vi khuẩn và hóa chất: Các dụng cụ và hóa chất chuẩn bị cho nuôi cấy mô, chuyển nạp gen và xét nghiệm sinh học của phòng thí nghiệm Công Nghệ Gen, Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long (phụ lục). 3.2. Địa điểm và thời gian tiến hành Địa điểm: Nghiên cứu đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Công Nghệ Gen, Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Cờ Đỏ, Tp. Cần Thơ. Thời gian thực hiện: Nghiên cứu đƣợc tiến hành từ ngày 21 tháng 3 năm 2005 đến ngày 31 tháng 7 năm 2005. 3.3. Phƣơng pháp 3.3.1. Quy trình chuển nạp gen 3.3.1.1. Chuẩn bị vật liệu nuôi cấy Hạt của các giống bông vải đƣợc đốt lớp bông xơ bao quanh bằng axit sulfuric (H 2 SO 4 ) đậm đặc (98%), rồi rửa với nƣớc máy cho đến khi sạch hết axit và bột than, sau đó sấy trong tủ sấy ở 40 0 C cho đến khi đạt độ ẩm 14% (khoảng 48h). Hạt đƣợc khử trùng bề mặt với cồn 70 0 (2 phút) và rửa hai lần bằng nƣớc cất vô trùng. Sau đó, hạt đƣợc khử trùng bằng dung dịch HgCl 2 0,1% (w/v) bổ sung thêm 2 hoặc 3 giọt Tween 20 và lắc ở tốc độ 80 rpm. Thao tác khử trùng bằng dung dịch HgCl 2 0,1% (w/v) đƣợc lặp lại hai lần, mỗi lần 10 phút và giữa hai lần khử trùng hạt đƣợc rửa bằng nƣớc cất tiệt trùng. Sau khi khử trùng bằng HgCl 2 0,1% (w/v), hạt đƣợc 33 rửa nhiều lần với nƣớc cất vô trùng (5lần) và ngâm qua đêm trong nƣớc cất vô trùng. Ngày hôm sau, hạt đƣợc lấy ra rửa hai lần với nƣớc cất tiệt trùng, sau đó khử trùng tiếp bằng HgCl 2 0,1% (w/v) trong 2 lần, mỗi lần khử trùng 5 phút. Giữa hai lần khử trùng bằng thủy ngân, hạt đƣợc rửa 3 lần bằng nứơc cất vô trùng. Sau khi khử trùng, hạt đƣợc bóc bỏ vỏ và cấy vào môi trƣờng nảy mầm MSG (phụ lục 4). Mẫu đƣợc nuôi cấy trong tủ cấy (Sanyo MLR35OH, Nhật) ở nhiệt độ 29 0 C dƣới ánh sáng huỳnh quang, độ ẩm tƣơng đối bằng 50%. Từ cây mầm 5-7 ngày tuổi (hình 3.1) đã đƣợc chuẩn bị ở bƣớc trên, trụ hạ diệp đƣợc cắt cẩn thận (khoảng 5 mm) và đƣợc dùng làm vật liệu cho các thí nghiệm chuyển nạp gen. Hình 3.1. Cây mầm trên môi trƣờng nảy mầm. A: hạt mầm sau xử khử trùng đƣợc cấy lên môi trƣờng nảy mầm, B: Cây Coker 312 5 ngày tuổi 3.3.1.2. Nguồn Plasmid Plasmid pManCa (Hoa và Bong, 2003) mang gen pmi (phosphomannose isomerase) giúp tế bào thực vật biến dƣỡng đƣờng mannose và gen chỉ thị gus trong chủng vi khuẩn A. tumefaciens LBA4404 (Hoekema và ctv ,1984) đƣợc sử dụng trong nghiên cứu này ( hình 3.2). 34 Hình 3.2. Sơ đồ vectơ pManCa mang gen pmi 3.3.1.3. Chuẩn bị vi khuẩn Chủng vi khuẩn LBA4404 mang vectơ pManCa, từ ống tồn trữ trong glycerol (50% v/v) trong tủ lạnh âm 80 0 C đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng đặc ABG (Chilton và ctv., 1974) có 50 mg/l kanamycine. Từ vi khuẩn trên môi trƣờng ABG (phụ lục 3) chọn ra một khuẩn lạc tốt (single colony) cấy vào 3ml môi trƣờng YEP có bổ xung kanamycin 50 mg/l (phụ lục 2) và nuôi khoảng 24 – 28 giờ ở 28 0 C, trên máy lắc với tốc độ 200 rpm. Sau khi nuôi cấy đƣợc khoảng 24-28 giờ, dịch huyền phù vi khuẩn đƣợc cấy chuyển sang 50 ml môi trƣờng YEP có bổ sung kanamycin 50 mg/l và nuôi cấy tiếp khoảng 16–18 giờ ở 28 0 C, lắc 200 rpm. Sau khi nuôi cấy khoảng 16-18 giờ, lấy 1ml dịch vi khuẩn để đo OD 600 nhằm xác định mật số vi khuẩn (OD 600 ~ 0,5-1,0), dịch huyền phù vi khuẩn đƣợc ly tâm 5000 rpm trong 10 phút. Phần lắng sau khi ly tâm sẽ đƣợc pha loãng (để OD 600 = 0,6) với môi trƣờng lây nhiễm không có phytagel và lắc với tốc độ 220 rpm ở 28 0 C trong 1giờ (có bổ sung 0,2 mM AS). 3.3.1.4. Đồng nuôi cấy Cơ bản dựa theo qui trình của Chen và ctv., 2000 (WO 00/77230 A1, Syngenta) nhƣng có vài thay đổi. Mẫu trụ hạ diệp đƣợc cắt thành nhiều đoạn dài khoảng 5 mm. Các khúc cắt này đƣợc ngâm trong dung dịch vi khuẩn pha loãng (OD 600 = 0,6) trong 20 phút (thay vì 5 phút), sau đó đem lắc chung dịch vi khuẩn và mẫu trụ hạ diệp trên máy lắc với tốc độ 35 50 rpm trong 10 phút. Sau đó, dịch vi khuẩn đƣợc loại bỏ, mẫu trụ hạ diệp đƣợc làm khô trên giấy thấm tiệt trùng. Khi các mẫu trụ hạ diệp khô sẽ đƣợc cấy chuyển sang các đĩa Petri chứa môi trƣờng lây nhiễm (thay vì đặt mẫu lên giấy lọc trong đĩa petri chƣa 50 ml môi trƣờng) MSCo (phụ lục 5). Các đĩa mẫu này đƣợc giữ trong tủ nuôi cấy mô thực vật ở 21 0 C, với điều kiện chiếu sáng liên tục trong 3 ngày. 3.3.1.5. Thanh lọc và tái sinh mẫu lây nhiễm Sau 3 ngày đồng nuôi cấy với vi khuẩn các mẫu trụ hạ diệp đƣợc rửa bằng nƣớc cất tiệt trùng và kháng sinh carbenicillin để ức chế vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Sau khi rửa các mẫu trụ hạ diệp đƣợc làm khô bằng giấy thấm tiệt trùng và chuyển sang môi trƣờng phục hồi MSRec (phụ lục 6) có bổ sung thêm 500 mg/l carbenicillin. Các mẫu này sẽ đƣợc nuôi cấy một tuần ở 28 0 C với quang kỳ 16 giờ sáng/ 8 giờ tối. Sau đó, các mẫu đƣợc cấy chuyền sang môi trƣờng thanh lọc MSS (phụ lục 7) chứa glucose và mannose ở nồng độ thăm dò theo sự tăng dần nồng độ mannose (25-35 g/l) và giảm dần nồng độ glucose (10-0 g/l). Qua 3 lần thanh lọc, mỗi lần cách nhau 2 tuần hoặc đến khi nghiệm thức đối chứng cho thấy tất cả các mẫu nuôi cấy đều chết. Bảng 3.1. Nồng độ mannose và glucose qua ba lần thanh lọc Lần thanh lọc Mannose Glucose I II III 25g/l 30g/l 35g/l 10g/l 5g/l 0g/l Chọn các mô kháng phát triển tốt trên môi trƣờng thanh lọc để cấy chuyển sang môi trƣờng phát sinh phôi. Các mô kháng đƣợc tách nhỏ khoảng 3 mm theo từng khối mô sẹo riêng biệt để tạo thành các dòng chuyển nạp gen giả định và cấy chuyển lên môi trƣờng phát sinh phôi DM (phụ lục 8). 36 3.3.2. Các chỉ tiêu theo dõi 3.3.2.1. Sự hình thành mô sẹo Tỷ lệ hình thành mô sẹo đƣợc theo dõi ở thời điểm là sau 7 ngày trên môi trƣờng phục hồi. Từ các số liệu này cho phép so sánh tỷ lệ hình thành mô sẹo giữa mẫu đối chứng và giữa các giống. Phần mềm sử dụng trong quá trình phân tích số liệu: Microsoft Excel (Microsoft Office 2003) 3.3.2.2. Kết quả thanh lọc Tỷ lệ sống sót của các mẫu lây nhiễm đƣợc theo dõi qua các lần thanh lọc. Tỷ lệ sống sót đƣợc theo dõi nhằm đánh giá hiệu quả thanh lọc của mannose cũng nhƣ cho phép có kết luận sơ bộ về khả năng đáp ứng chuyển nạp gen của các giống. Phần mềm sử dụng trong quá trình phân tích số liệu: Microsoft Excel (Microsoft Office 2003). 37 Bảng 3.2. Tóm tắt quy trình chuyển nạp gen vào cây bông vải bằng vi khuẩn Agrobactrieum tumefaciens. Bƣớc Nội dung thực hiện Hình minh họa Thời gian (ngày) 1. Tạo vật liệu Hạt đƣợc khử trùng bằng cồn 70 0 trong 2 phút và dung dịch HgCl 2 0,1% (w/v) trong 20 phút (2 lần), rửa lại bằng nƣớc cất tiệt trùng 5 lần, ngâm hạt trong nƣớc cất tiệt trùng qua đêm, bóc bỏ vỏ, cấy hạt lên môi trƣờng nảy mầm MSG. 5-7 2. Lây nhiễm và đồng nuôi cấy Trụ hạ diệp cây 5-7 cắt thành khúc 5 mm, ngâm trong dung dịch vi khuẩn (OD 600 = 0,6) 20 phút, làm khô mẫu và cấy lên môi trƣờng lây nhiễm MsCo. 2-3 3. Phục hồi Sau 3 ngày đồng nuôi cấy mẫu trụ hạ diệp đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng phục hồi MSRec có bổ sung 500 mg/l carbenicillin. 7 4. Thanh lọc Sau 7 ngày phục hồi, mẫu trụ hạ diệp đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc (MSS) có mannose với nồng độ tăng dần (2,5-3,5%, w/v) và glucose có nồng độ giảm dần (1%- 0%, w/v). Các mẫu đƣợc thanh lọc qua ba lần. 42-56 38 CHƢƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Sự hình thành mô sẹo 4.1.1. Đặc điểm hình thái mô sẹo Các khúc trụ hạ diệp (khoảng 5 mm) sau 3 ngày đồng nuôi cấy với vi khuẩn (hình 4.1) đƣợc rửa với nƣớc và kháng sinh để ức chế vi khuẩn. Sau khi rửa, các mẫu lây nhiễm đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng phục hồi MsRec. Sau 7 ngày trên môi trƣờng phục hồi MsRec (sau 10 ngày), các mẫu lây nhiễm và mẫu đối chứng bắt đầu hình thành mô sẹo (hình 4.2). Đặc biệt là một số mẫu lây nhiễm hình thành mô sẹo khá sớm (sau 5 ngày trên môi trƣờng MsRec). Tuy nhiên, các mô sẹo lúc này còn nhỏ và có màu xanh trong. Sau 7 ngày (sau 10 ngày) trên môi trƣờng phục hồi, các mẫu lây nhiễm đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 1 (MSS1). Hình 4.1. Các khúc trụ hạ diệp đồng nuôi cấy với vi khuẩn (A: Giống Coker 312, B: Giống SSR60F) 39 Hình 4.2. Mô sẹo giống Coker 312 sau 7 ngày trên môi trƣờng phục hồi (A: đối chứng, B: mẫu lây nhiễm) Trên môi trƣờng thanh lọc lần 1, các mô sẹo của các mẫu lây nhiễm phát triển nhanh làm cho kích thƣớc khối mô sẹo gia tăng nhanh chóng. So với khi trên môi trƣờng phục hồi, các mô sẹo của mẫu lây nhiễm tăng gấp đôi về kích thƣớc sau 14 ngày (sau 24 ngày) trên môi trƣờng thanh lọc 1 (hình 4.3). Các khối mô sẹo lúc này có màu xanh đậm và cứng. Trong khi đó, mô sẹo của các mẫu đối chứng có kích thƣớc lớn hơn và mô sẹo của đối chứng 1 (đối chứng không thanh lọc) có màu xanh vàng. Sau 14 ngày (sau 24 ngày) trên môi trƣờng thanh lọc lần 1 các mô sẹo đƣợc cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 2 (MSS2). Hình 4.3. Mô sẹo mẫu lây nhiễm 2 tuần trên môi trƣờng thanh lọc lần 1 (giống Coker 312) 40 Trên môi trƣờng thanh lọc lần 2, các khối mô sẹo bắt đầu chuyển từ màu xanh đậm sang màu xanh vàng và không xốp. So sánh giữa mô sẹo của đối chứng và mô sẹo mẫu lây nhiễm thì thấy rằng các mô sẹo mẫu đối chứng có màu xanh vàng tốt hơn các mô sẹo mẫu lây nhiễm (hình 4.4). Ngoài ra, trên các khối mô sẹo thấy xuất hiện các mô sẹo mới có xu hƣớng rời ra khi chạm kẹp vào. Theo Mishra và ctv. (2003) các mô sẹo này đáp ứng tốt với khả năng tái sinh. Tuy nhiên, sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc lần 2, màu xanh vàng và mức độ rời của các mô sẹo chƣa rõ ràng. Sau 14 ngày (sau 38 ngày) trên môi trƣờng thanh lọc lần 2 các mô sẹo đƣợc tách nhỏ và cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 3 (MSS3). Hình 4.4. Mô sẹo giống Coker 312 sau 2 tuần trên môi trƣờng thanh lọc lần 2 (A: đối chứng, B: mẫu lây nhiễm) Sau 14 ngày trên môi trƣờng thanh lọc lần 3 (sau 52 ngày), trong 2 thí nghiệm đầu tiên, các mô sẹo đƣợc cấy chuyển trực tiếp lên môi trƣờng thanh lọc lần 3. Khi đó, các mô sẹo của cả mẫu đối chứng và mẫu lây nhiễm có kích thƣớc lớn gấp khoảng 3-4 lần khối mô sẹo trên môi trƣờng thanh lọc lần 1. Các mô sẹo có xu hƣớng rời rạc và có màu xanh vàng rõ ràng hơn so với khi trên môi trƣờng thanh lọc lần 2. Hơn nữa, trên các mô sẹo của các mẫu lây nhiễm có xuất hiện các vùng màu xám bên cạnh các cụm mô sẹo mới màu xanh vàng (hình 4.5 A). Các mô sẹo màu xanh vàng và màu xám này xuất hiện sau 42- 56 ngày, nhƣng Chaudhary và ctv. (2003) đã báo cáo các mô sẹo này xuất hiện sau 30-40 ngày. . vi khuẩn vào tế bào cây (nguồn Zhu và ctv., 2000). 32 CHƢƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu Giống bông vải: hạt của giống bông vải Coker 312 (đối chứng), SSR60F đƣợc. 31 Khả năng chuyển nạp đoạn DNA của Agrobacterium vào trong tế bào cây cung cấp một công cụ mạnh cho công nghệ sinh học thực vật và do đó chuyển nạp gene qua trung gian vi khuẩn Agrobacterium. cấy chuyển lên môi trƣờng thanh lọc lần 1 (MSS1). Hình 4. 1. Các khúc trụ hạ diệp đồng nuôi cấy với vi khuẩn (A: Giống Coker 312, B: Giống SSR60F) 39 Hình 4. 2. Mô sẹo giống Coker