65 hóa học, vật lý như: thao tác kĩ thuật viên, ethidium bromide, tia UV, dòng điện…làm ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm khả ngoại nhiễm cao Mặc khác, việc đánh giá kết thực mắt thường, kết khơng đồng nhất, thuyết phục Các yếu tố làm cho việc phân tích kết gặp khó khăn Phƣơng pháp 2: Phản ứng Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green Trong thí nghiệm sàng lọc phương pháp này, giữ nguyên thành phần phản ứng mẫu sản phẩm (10 mẫu) Các kết phản ứng thể đồ thị DNA quantification sau: - Kết thí nghiệm mẫu đối chứng với cặp mồi đặc hiệu p35S Hình 4.4: Đồ thị DNA quantification mẫu đối chứng Ghi chú: Đối chứng dương Đối chứng âm Bảng 4.5: Kết sàng lọc mẫu đối chứng thí nghiệm phƣơng pháp Tên mẫu Chu kỳ ngƣỡng Kết luận Đối chứng + 27,62 + Đối chứng - N/A - 65 66 - Kết thí nghiệm mẫu sản phẩm: Hình 4.5: Đồ thị DNA quantification mẫu thí nghiệm Ghi chú: B1 B6 B2 B7 B3 B9 B4 B10 B5 B11 Bảng 4.6: Kết sàng lọc mẫu thí nghiệm thí nghiệm phƣơng pháp Tên đặc điểm mẫu STT Kí hiệu Chu kỳ ngƣỡng Kết luận - Bắp giống B1 20,62 + - Bắp giống B2 41,04 + - Bắp giống B3 N/A - - Bắp giống B4 16,96 + - Bắp giống B5 N/A - - Bắp trái ăn tươi B6 22,22 + - Bột bắp nguyên liệu làm thức ăn gia súc B7 21,15 + - Thức ăn gia súc B9 N/A - - Thức ăn gia súc B10 22,22 + 10 - Bột ngũ cốc dinh dưỡng B11 24,04 + 66 67 Qua kết nhận đây, rút số nhận xét: - Các mẫu dương tính có chu kỳ ngưỡng phát chênh lệch (16,9641,04) Một số mẫu có chu kỳ ngưỡng phát thấp (mẫu B2, B6, B10, B11) Điều diện promoter 35S mẫu có khác biệt mẫu lấy từ nguồn sản phẩm khác - Đường đồ thị mẫu âm tính (B3, B5, B9) cịn chưa rõ ràng, có chiều hướng lên Đặc biệt, đường khơng có khác biệt q lớn mẫu B11 Điều cần phải phân tích thêm Bên cạnh đó, phương pháp 2, chúng tơi đồng thời tiến hành phân tích đồ thị nhiệt độ nóng chảy (Melt curve analysis) Kết thể đồ thị sau: Hình 4.6: Đồ thị Melt curve mẫu đối chứng Ghi chú: Đối chứng dương Đối chứng âm Hình 4.7: Đồ thị Melt curve mẫu thí nghiệm Ghi chú: B1 B6 B2 B7 B3 B9 B4 B10 67 B5 B11 68 Bảng 4.7: Nhiệt độ nóng chảy sản phẩm khuếch đại mẫu thí nghiệm Mẫu Nhiệt độ nóng chảy ( OC ) Chiều cao peak (-d(RFU)/dT) 86,5 86,5 86,0 86,5 - 47,40 23,54 20,72 18,8 18,93 26,45 31,40 24,23 Đối chứng + Đối chứng B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B9 B10 B11 86,5 86,0 86,0 86,0 Từ kết trên, nhận thấy: - Đồ thị Melt curve sản phẩm khuếch đại mẫu dương tính xuất peak nhiệt độ trùng với nhiệt độ nóng chảy đối chứng dương (8686,5oC) - Độ cao peak xấp xỉ với độ cao peak đối chứng dưong (47,40) Sự chênh lệch số lượng DNA khuếch đại sau mẫu thí nghiệm gây - Sản phẩm khuếch đại mẫu âm tính khơng xuất peak nhiệt độ nóng chảy Như vậy, ta rút số kết luận sau: - Nhiệt độ nóng chảy sản phẩm khuếch đại mẫu dương tính tương đương với đối chứng dương Nói cách khác, sản phẩm khuếch đại promoter 35S chúng có chiều dài tương tự với đối chứng - Các kết nhận từ đồ thị Melt curve khớp với kết đồ thị DNA quantification Điều chứng tỏ kết phản ứng Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I xác 68 69 - Mẫu B11 có chu kỳ ngưỡng phát thấp, kết phân tích đồ thị Melt curve cho thấy, sản phẩm đặc hiệu có chất lượng tốt phản ứng khuếch đại PCR - Đồng thời, mẫu B3, B5 B9 mẫu âm tính thật Đồ thị mẫu (Hình 4.7) khơng có đỉnh nhiệt độ nóng chảy đặc trưng cho sản phẩm khuếch đại vùng promoter 35S - Các kết chứng tỏ mồi đặc hiệu quy trình phản ứng PCR thiết kế phịng thí nghiệm có chất lượng tốt, độ đặc hiệu cao Điều phù hợp với kết điện di sản phẩm PCR phương pháp Bảng 4.8: So sánh hiệu kinh tế phƣơng pháp thí nghiệm Phƣơng pháp Chỉ tiêu Thời gian (giờ) Phƣơng pháp Phƣơng pháp (PCR điện di) (Real-Time PCR với SYBR Green I) Nhiều, phức tạp Ít, đơn giản Độ độc hại Cao Thấp Khả ngoại nhiễm Có Khơng Thấp Cao Giá thành 1-1,5 USD 1,5-3 USD Công cụ Đơn giản, giá thành thấp Phức tạp, giá thành cao Khơng Có Thao tác Mức độ tiện dụng Khả phát triển thành kỹ thuật định lượng Trên số tiêu so sánh mà rút từ phương pháp thí nghiệm Chúng tơi rút số nhận xét sau: - Phương pháp Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I cho phép phát trình tự DNA với độ nhạy cao kết đáng tin cậy (tương đương phương pháp PCR truyền thống) Điều cần thiết cho trình 69 70 sàng lọc sản phẩm biến đổi gen Bên cạnh đó, phương pháp cịn có số ưu điểm sau: Thời gian thao tác ngắn so với phương pháp (3 so với giờ), số lượng thao tác hơn, q trình tự động hóa cao (điều khiển máy vi tính), mức độ độc hại thấp (không tiếp xúc với ethidium bromide, tia UV) Điều giảm thiểu tác động yếu tố khách quan bên ngoài, nâng cao độ tin cậy kết Nếu kết phương pháp đánh giá mắt thường qua ảnh chụp tia UV nên khơng xác, kết phương pháp thể biểu đồ với số liệu cụ thể máy tính thiết lập, phù hợp cho công tác lưu trữ báo cáo Phương pháp Real-Time PCR có khả phát triển thành phương pháp định lượng DNA - Về vấn đề giá thành công cụ, ưu điểm phương pháp tiết kiệm chi phí, chủ động thí nghiệm (khơng phụ thuộc kit hóa chất), ứng dụng rộng rãi quen thuộc thời gian lâu Đối với phương pháp 2, xuất gần đây, đồng thời hệ thống máy móc cần đầu tư lớn nên phạm vi ứng dụng nhiều hạn chế Tuy nhiên, số so sánh giá thành cho thấy: Hóa chất thành phần phản ứng phương pháp hồn tồn chủ động phương pháp truyền thống Các thành phần phản ứng chuẩn bị bình thường cần bổ sung thêm thuốc nhuộm SYBR Green I Theo cách này, giá thành phản ứng Real-Time PCR 20% so với giá phản ứng PCR truyền thống Giá thành kit 300USD/100 phản ứng với 50 µl/1 phản ứng Mức giá không đắt so với phương pháp PCR truyền thống Như vậy, với ưu điểm nêu trên, hiệu phương pháp Real-Time PCR chuẩn đoán sản phẩm biến đổi gen ưu so với phương pháp truyền thống Đặc biệt, trình sàng lọc mẫu sản phẩm biến đổi gen vốn đòi hỏi cần thực số lượng mẫu lớn, thời gian ngắn, với kết 70 71 xác, phù hợp cho việc báo cáo lưu trữ, việc áp dụng phương pháp thuận lợi hiệu Thí nghiệm 3: Xác định phƣơng pháp định lƣợng GMO Trong thí nghiệm này, so sánh khả định lượng phương pháp Real-Time PCR loại hóa chất khác nhau: thuốc nhuộm SYBR Green I (Phương pháp 1) mẫu dị Taqman có gắn chất phát quang FAM 490 (Phương pháp 2) Các kết thu nhận trình bày bên Xây dựng đƣờng chuẩn: Đây yếu tố định đến kết định lượng p35S Trong hai thí nghiệm, chúng tơi sử dụng mẫu chuẩn 35S công ty GeneScan để xây dựng đường chuẩn Kết sau: Trái: Phƣơng pháp 1, Phải: Phƣơng pháp Hình 4.8 : Đồ thị mẫu chuẩn 35S hai phƣơng pháp Ghi chú: Chuẩn Chuẩn Chuẩn Bảng 4.9: Chu kỳ phát mẫu chuẩn phƣơng pháp Chu kỳ phát Mẫu chuẩn SYBR Green I Taqman Chuẩn 22,99 26,83 Chuẩn 24,32 30,04 Chuẩn 25,26 33,07 71 72 Trên: Phƣơng pháp Dƣới: Phƣơng pháp Hình 4.9: Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng từ mẫu chuẩn 35S Ghi chú: Mẫu chuẩn Mẫu chưa biết Thông số từ việc xây dựng đường chuẩn sau: Bảng 4.10: Các thông số xây dựng đƣờng chuẩn Thí nghiệm định lƣợng Phƣơng pháp Phƣơng pháp SYBR Green I Taqman Hệ số tương quan (Correlation Coefficient) 0,995 1,000 Hiệu PCR (PCR Efficiency) (%) 527, 94,8 Thông số Trong phương pháp 1, chúng tơi cịn tiến hành phân tích Melt curve Kết thu nhận sau: 72 73 Hình 4.10: Đồ thị Melt curve mẫu chuẩn 35S phƣơng pháp Ghi chú: Chuẩn Chuẩn Chuẩn Từ kết trên, rút số nhận xét sau: - Hai phương pháp có khả xây dựng đường chuẩn có chất lượng tốt từ mẫu chuẩn biết trước Điều chứng minh qua thông số xây dựng đường chuẩn thu nhận Bảng 4.10 - Tuy nhiên, phương pháp (Real-time PCR với mẫu dị Taqman) có kết dựng đường chuẩn tốt hơn, thể qua thông số sau: Hệ số tương quan phương pháp cao phương pháp (1,000 so với 0,995) (Bảng 4.10) Hiệu PCR phương pháp nằm ngưỡng cho phép (90-120 %) Còn phương pháp vượt ngưỡng, nguyên nhân vấn đề phân tích sau Ta biết mẫu chuẩn có số lượng lý thuyết khoảng định (gấp lần), vậy, chu kỳ phát phải khoảng tương ứng Các kết thu nhận Bảng 4.9 cho thấy, chu kỳ phát mẫu chuẩn phương pháp tốt, khoảng chu kỳ Điều quan sát rõ đồ thị DNA quantification phương pháp (Hình 4.8) Trong đó, thơng số phương pháp khơng tốt (hơn khoảng chu kỳ) 73 74 - Phân tích đồ thị Melt curve phương pháp 1, ta thấy bên cạnh sản phẩm khuếch đại đặc hiệu với nhiệt độ nóng chảy 86oC, cịn có sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu nhiệt độ 58-58,5oC Nguyên nhân tượng primer-dimer (Tổng quan Tài Liệu, mục 8.1.1.1.) Điều dẫn đến hiệu PCR phương pháp đạt 527,0 % (vượt ngưỡng cho phép), bên cạnh sản phẩm đặc hiệu, q trình cịn tổng hợp sản phẩm không đặc hiệu mồi tự bắt cặp với Đây khuyết điểm phương pháp ảnh hưởng đến kết định lượng tín hiệu huỳng quang thu nhận từ thuốc nhuộm SYBR Green I tín hiệu từ tất DNA mạch đơi mẫu kể sản phẩm khuếch đại đặc hiệu khơng đặc hiệu Cịn phương pháp 2, tín hiệu huỳnh quang thu nhận từ DNA khuếch đại đặc hiệu (mẫu dị đặc hiệu) nên hồn tồn khơng xảy sai lệch ảnh hưởng đến kết định lượng Đánh giá kết định lƣợng Kết thu nhận từ phương pháp sau Đơn vị tính quy định copy copy tương ứng với số lượng gen đích mẫu thí nghiệm Bảng 4.11: Kết thu nhận từ phƣơng pháp thí nghiệm Mẫu copy Chu kỳ phát Kết thực tế (copy) SYBR Green I Taqman SYBR Green I Taqman 27.58 26.18 36,22 35,96 1,28 16,5 1,11 1,38 Nhận xét: - Các kết thu nhận cho thấy (Bảng 4.11), hai phương pháp có độ nhạy tốt, có khả phát copy gen đích mẫu Tuy nhiên, kết định lượng phương pháp có sai lệch lớn hai lần lặp lại (1,28 copy 16,5 copy) Điều tượng primer-dimer ảnh hưởng đến kết thí nghiệm Nguyên nhân sai lệch hàm lượng DNA khuông phản ứng định lượng thấp, dẫn đến số lượng mồi tự do, không tham gia phản ứng khuếch đại cịn nhiều, chúng tự bắt cặp với theo tượng primer-dimer Do thuốc nhuộm SYBR Green I định lượng 74 75 DNA tín hiệu huỳnh quang từ DNA mạch đơi, khơng phân biệt sản phẩm đặc hiệu hay không đặc hiệu, dẫn đến kết sai lệch Nhận xét phương pháp sau: Hình 4.11: Đồ thị Melt curve phƣơng pháp SYBR Green I thí nghiệm Ghi chú: - Chuẩn Chuẩn Mẫu copy Chuẩn Cả hai phương pháp thể khả định lượng DNA Chúng có khả xây dựng đường chuẩn có chất lượng, độ nhạy độ xác cao - Tuy nhiên, kết định lượng thu nhận từ phương pháp có độ xác lặp lại cao phương pháp Điều độ đặc hiệu hóa chất định lượng mang lại - Khuyết điểm phương pháp độ đặc hiệu hóa chất định lượng (SYBR Green I) Nhìn Hình 4.11 ta thấy tất sản phẩm khuếch đại phương pháp xảy tượng primer-dimer Hiện tượng ảnh hưởng đến lượng tín hiệu huỳnh quang phát từ sản phẩm khuếch đại làm sai lệch kết thí nghiệm Như vậy, hai phương pháp có khả định lượng, phương pháp thể độ đặc hiệu độ lặp lại cao qua lần thí nghiệm khác Vì vậy, chúng tơi đề nghị sử dụng phương pháp (Real-Time PCR với mẫu dò Taqman) cho thí nghiệm định lượng sản phẩm biến đổi gen Thí nghiệm 4: Đánh giá khả định lƣợng phƣơng pháp Real-Time PCR Trong thí nghiệm này, mục tiêu đánh giá khả định lượng phương pháp Real-Time PCR với mẫu dò Taqman Các kết thí nghiệm sau: Độ nhạy phƣơng pháp: Mẫu thí nghiệm: mẫu copy gen đích 75 76 Hình 4.12:Đồ thị DNA quantification mẫu copy Ghi : Chuẩn Chuẩn Chuẩn Chuẩn Mẫu copy 1và Bảng 4.12: Kết định lƣợng mẫu copy Mẫu pha loãng Chu kỳ phát copy Kết thực tế (copy) Lần 36,22 1,21 Lần 35,96 1,38 Trung bình 36,09 1,25 Nhận xét : - Các kết định lượng Bảng 4.13 cho thấy khơng có sai khác đáng kể kết định lượng thực tế với số lượng lý thuyết (1,25 copy so với copy) Sự sai khác (0,21 0,38 copy) xảy thao tác người thực bơm hút mẫu - Các kết định lượng lần lặp lại khác cho thấy sai khác đáng kể Khác biệt (0,17 copy) nguyên nhân Như vậy, kết thí nghiệm cho thấy phương pháp Real-Time PCR cho phép định lượng diện gen đích mức thấp copy Điều chứng tỏ độ nhạy phương pháp tốt Độ xác phƣơng pháp 76 77 Bảng 4.13: Kết định lƣợng mẫu Bt 176 1% Kết định lƣợng Chu kỳ phát Tỷ lệ (copy) Độ lặp lại chuyển Promoter Gen tham Promoter Gen tham 35S chiếu 35S chiếu Lần 32,59 28,93 200 20300 0,985 Lần 28,56 24,51 124 12500 0,992 Độ lệch gen (%) 0,007 Nhận xét thí nghiệm định lượng mẫu bắp Bt 176 1%: - Kết định lượng bắp chuyển gen Bt 176 1% (Bảng 4.14) tốt Các kết có sai khác khơng đáng kể so với tỷ lệ phần trăm chuyển gen 1% mẫu (sai lệch 0,015 % 0,008 %) Sự sai lệch nhỏ không đáng kể - Kết định lượng lần lặp lại có khác biệt không đáng kể (sai lệch 0,007 %) Sai lệch thấp, chứng tỏ phương pháp có độ lặp lại tốt Như vậy, kết thí nghiệm chứng minh độ nhạy độ xác phương pháp Real-Time PCR: - Định lượng copy gen đích mẫu thí nghiệm - Xác định xác tỷ lệ phần trăm chuyển gen mẫu biết trước qua lần lặp lại khác Hiệu phương pháp đặc biệt quan trọng định lượng sản phẩm biến đổi gen, quy định mức ngưỡng cho diện thành phần biến đổi gen thực phẩm (đặc biệt châu Âu) thấp Các mức ngưỡng quy định 0,5 % 0,9 % đòi hỏi phương pháp định lượng phải có kết xác Các kết thu nhận chứng minh khả áp dụng phương pháp Real-Time PCR định lượng sản phẩm biến đổi gen Thí nghiệm 5: Ứng dụng phƣơng pháp định lƣợng Real-Time PCR 77 ... kết thu nhận chứng minh khả áp dụng phương pháp Real-Time PCR định lượng sản phẩm biến đổi gen Thí nghiệm 5: Ứng dụng phƣơng pháp định lƣợng Real-Time PCR 77 ... 33, 07 71 72 Trên: Phƣơng pháp Dƣới: Phƣơng pháp Hình 4. 9: Đƣờng chuẩn đƣợc xây dựng từ mẫu chuẩn 35S Ghi ch? ?: Mẫu chuẩn Mẫu chưa biết Thông số từ việc xây dựng đường chuẩn sau: Bảng 4.1 0: Các. .. với phương pháp PCR truyền thống Như vậy, với ưu điểm nêu trên, hiệu phương pháp Real-Time PCR chuẩn đoán sản phẩm biến đổi gen ưu so với phương pháp truyền thống Đặc biệt, trình sàng lọc mẫu sản