21  Giảm gốc tự do hydroxyl  Ức chế khối u phát triển  Bảo vệ cơ thể chống lại tia bức xạ  Tăng chức năng gan  Duy trì khả năng tái sinh tủy và cơ một cách bình thường  Tham gia tổng hợp ADN, ARN và protein 2.6.2. Ganoderic Acid Ganoderic acid được định hướng là một cyclopropene hoặc cyclopentene. Hàm lượng G.acid thay đổi theo giống Linh chi, môi trường nuôi trồng, giai đoạn bào tử ganodermal. Chính sự thay đổi này làm cho mức độ đắng bị ảnh hưởng. Hàm lượng G.acid cao thì có nhiều vị đắng. [21, 22] Triterpenoid là những hợp chất được tổng hợp từ 6 đơn vị isopren. Các triterpen có bộ khung chính từ 27 – 30 nguyên tử carbon (C 38 H 48 ) rất thường gặp trong thực vật. Các triterpenoid tồn tại dưới dạng tự do (không có phần đường), có cấu trúc vòng, mang một số nhóm chức như: -OH; -Oac; eter -O-; Carbanil C=O; nối đôi C=C. Đặc tính chung là có tính thân dầu (tan tốt trong eter dầu hỏa, hexan, eter ethyl, cloroform), ít tan trong nước ngoại trừ khi chúng kết hợp với đường để tạo thành glycosid. [5, 9] Bảng 2.8: Các hoạt chất triterpenoid có tác dụng chữa bệnh trong nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) (Lê Xuân Thám, 1996) Ngoài ra các nghiên cứu cho thấy rằng Ganoderic acid còn có tác dụng:  Giảm đau  Bảo vệ gan Hoạt chất Hoạt tính Ganoderic acid R,S Ức chế giải phóng histamin Ganoderic acid B, D, F, H, K, S, Y Hạ huyết áp Ganodermaldiol Hạ huyết áp Ganodermic acid Mf Ức chế tổng hợp cholesterol Ganodermic acid T.O Ức chế tổng hợp cholesterol Ganodermic acid Ức chế tổng hợp cholesterol 22  Chống khối u 2.6.3. Ganoderma Adenosine [21, 22] Adenosine thuộc nhóm purine và là thành phần chính trong cấu trúc nucleic acid. Nấm Linh chi có nhiều dẫn xuất adenosine, tất cả chúng đều có hoạt tính dược liệu mạnh. Chức năng của adenosine:  Giảm độ nhớt máu  Ức chế kết dính tiểu cầu  Ngăn chặn hình thành cục nghẽn  Tăng lượng lipoprotein 2 – 3 phosphricglycerin  Gia tăng khả năng vận chuyển oxygen, tăng lưu lượng máu cung cấp cho não  Lọc máu và tăng tuần hoàn máu trong cơ thể 2.6.4. Alcaloid [5, 9] 2.6.4.1. Định nghĩa Alcaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, đa số có nhân dị vòng, có phản ứng kiềm, chúng có cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học rất đa dạng. Tuy nhiên cũng có một số alcaloid không có nhân dị vòng với nitơ và một số alcaloid không có phản ứng kiềm. Một số alcacoid còn có thể có phản ứng acid yếu do có nhóm chức acid trong phân tử. 2.6.4.2. Tính chất Đa số alcaloid không màu, ở trạng thái kết tinh rắn. Một vài alcaloid ở dạng nhựa vô định hình, một vài alcaloid ở dạng lỏng và có màu. Alcaloid là những hợp chất có tính baz yếu, do sự có mặt nguyên tử nitơ. Tính baz của các alcaloid khác nhau tùy theo nhóm thế (R-) gắn trên nguyên tử nitơ. Các alcaloid tính baz yếu thì phải cần môi trường acid mạnh để tạo thành muối, tan trong nước. Các alcaloid ở dạng tự do hầu như không tan trong nước, nhưng thường tan trong dung môi hữu cơ: cloroform, eter diethyl, alcol bậc thấp. Các muối của alcaloid thì tan trong nước, alcol và hầu như không tan trong dung môi hữu cơ như: cloroform, eter, benzen. Chính vì thế, tính hòa tan của các alcaloid đóng vai trò quan trọng trong 23 việc ly trích alcaloid ra khỏi nguyên liệu và trong kỹ nghệ dược phẩm điều chế dạng thuốc để uống. 2.6.4.3. Công dụng Alcaloid là những chất có hoạt tính sinh học, nhiều ứng dụng trong ngành y dược và nhiều chất rất độc. Các alcaloid có tác dụng rất khác nhau phụ thuộc vào cấu trúc của alcaloid.  Tác dụng lên hệ thần kinh  Tác dụng lên huyết áp  Tác dụng trị ung thư 2.6.5. Hợp chất Saponin [28, 29] 2.6.5.1. Khái niệm chung về Saponin Saponin là một loại glycosid, có cấu trúc gồm hai phần: phần đường gọi là glycon và phần không đường gọi là aglycon. Saponin có tính chất đặc trưng: khi hòa tan vào nước sẽ có tác dụng làm giảm sức căng bề mặt của dung dịch và tạo nhiều bọt; làm vỡ hồng cầu. Saponin thường ở dạng vô định hình, có vị đắng. Saponin rất khó tinh chế, có điểm nóng chảy cao từ 200 o C trở lên và có thể trên 300 o C. Saponin bị tủa bởi chì acetat, hidroxid barium, sulfat amonium nên lợi dụng tính chất này để cô lập saponin. - Saponin triterpenoid: Phần aglycon của saponin triterpenoid có 30 cacbon, cấu tạo bởi 6 đơn vị hemiterpen và chia làm 2 nhóm:  Saponin triterpenoid pentacyclic: phần aglycon của nhóm này có cấu trúc gồm 5 vòng và phân ra thành các nhóm nhỏ: olean, ursan, lupan, hopan. Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên đều thuộc nhóm olean.  Saponin triterpenoid tetracyclic: phần aglycon có cấu trúc 4 vòng và phân thành 3 nhóm chính: dammanran, lanostan, cucurbitan. - Saponin steroid: Gồm các nhóm chính: spirostan, furostan, aminofurostan, spiroalan, solanidan. 2.6.5.2. Công dụng [11]  Trị long đờm, chữa ho  Là chất phụ gia trong một số vắc xin  Tác dụng thông tiểu  Tác dụng kháng viêm, chống khối u 24 2.6.6. Germanium hữu cơ [21, 22] Gemanium là nguyên tố hiếm, do nhà khoa học người Đức khám phá vào năm 1885. Germanium có thể cung cấp một lượng lớn oxygen và thay thế chức năng của oxygen. Nó kích thích khả năng vận chuyển oxygen tuần hoàn máu trong cơ thể lên đến 1,5 lần. Vì thế, làm tăng mức độ trao đổi chất và ngăn chặn quá trình lão hóa. Cơ thể con người là thành phần của các electron. Khi mức năng lượng tăng hoặc giảm thấp, dẫn đến sự xáo trộn cân bằng và biểu lộ tình trạng bệnh lý. Gemanium hữu cơ sẽ duy trì mức năng lượng một cách bình thường trong cơ thể và bảo vệ sức khoẻ. Khi tế bào ung thư xuất hiện, chúng làm xáo trộn quá trình trao đổi chất. Gemanium sẽ điều hoà và kiểm soát quá trình này, từ đó ngăn chặn tế bào ung thư phát triển. Chức năng của Germanium:  Tăng cường khả năng mang oxygen và giảm nguy cơ xuất hiện ung thư  Giảm nguy hiểm từ kết quả trị liệu phóng xạ  Ngăn chặn bệnh thiếu máu cục bộ 2.7. Phƣơng pháp ổn định dƣợc liệu [5] Muốn bảo quản dược liệu được lâu, tránh hiện tượng lên meo mốc, hoạt chất trong dược liệu bị biến đổi thì dược liệu phải có độ ẩm không quá 1 giới hạn nào đó. Giới hạn này gọi là độ ẩm an toàn, độ ẩm đạt tốt nhất là 13%. Thông thường sự hoạt động của men xảy ra ngay sau khi nguyên liệu bị cắt khỏi cây. Vấn đề xử lý nguyên liệu sau khi thu hái nhằm ức chế hoạt động của men để đảm bảo cấu trúc ban đầu của hợp chất trong cây và nâng cao hiệu suất chiết là cần thiết. Bản thân men là những protein không tan trong cồn, tan trong nước, bị tủa bởi một số muối vô cơ có nồng độ cao. Men hoạt động ở nhiệt độ thích hợp từ 20 – 45 o C và bị phá hủy trên 60 o C. Có nhiều phương pháp ổn định dược liệu, phương pháp thông thường là sấy ở nhiệt độ thấp trong khoảng thời gian dài. 2.7.1. Chuẩn bị dịch chiết Các chất trong nguyên liệu thực vật được phân thành các nhóm theo độ phân cực của chúng: Nhóm các chất không hoặc kém phân cực Nhóm các chất có độ phân cực trung bình 25 Nhóm các chất có độ phân cực mạnh Các nhóm chất này lần lượt được chiết từ nguyên liệu với các dung môi ether ethylic, ethanol (hay methanol) và nước. Xác định các nhóm hợp chất trong từng dịch chiết bằng các phản ứng đặc trưng. Trong một số trường hợp, sự thay đổi mức độ ion hóa của phân tử (dẫn đến thay đổi tính tan) của 1 nhóm chất trong môi trường acid hay baz cũng được dùng để tách các phân nhóm. Yêu cầu chung của các phản ứng hay các thuốc thử sử dụng trong định tính 1 nhóm hợp chất là chúng phải đặc hiệu, nhạy và dễ phát hiện, chúng cũng phải không hay ít bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các nhóm hợp chất khác có trong môi trường phản ứng. 2.7.2. Phƣơng pháp ngâm [5] Ngâm là một phương pháp chiết gián đoạn trong đó toàn bộ lượng dung môi được tiếp xúc đồng thời với toàn bộ lượng dược liệu trong dụng cụ thích hợp. Quá trình chiết xuất xảy ra mọi điểm trong thiết bị chiết là như nhau và dịch chiết được rút khỏi thiết bị cùng một lúc. Quá trình ngâm này có thể được lặp lại thêm 1 hay vài lần để chiết kiệt hoạt chất trong dược liệu. Sự khuấy trộn, yếu tố phụ trợ như nhiệt độ, siêu âm…, được dùng làm tăng quá trình chiết. - Phương pháp ngâm lạnh: Dược liệu được ngâm với dung môi ở nhiệt độ phòng. Thời gian ngâm không dưới 12 giờ với các dược liệu mỏng manh hay dược liệu đã xay nhỏ để đảm bảo quá trình chiết được hoàn tất - Phương pháp ngâm nóng: Là phương pháp ngâm ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng nhưng dưới nhiệt độ sôi của dung môi. Do có sự gia nhiệt nên quá trình chiết xảy ra nhanh hơn, dịch chiết thu được có nồng độ cao hơn và ít tốn dung môi hơn. 26 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm Đề tài được thực hiện từ 22/03/2005 đến 1/08/2005 tại Trung tâm nghiên cứu Linh chi - Nấm dược liệu, Quận 12, Thành Phố Hồ Chí Minh và phòng thí nghiệm vi sinh thuộc Bộ môn Công Nghệ Sinh học, Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh. 3.2. Đối tƣợng thí nghiệm Nấm Hắc chi (Amauroderma subresinosum) do ThS. Phan Thị Nhiều thu hái tại vùng núi Chứa Chan thuộc Tỉnh Đồng Nai (2004) và ThS. Cổ Đức Trọng phân lập, giám định. 3.3. Vật liệu thí nghiệm 3.3.1. Thiết bị Cân phân tích Kính hiển vi Máy chụp ảnh kỹ thuật số Tủ cấy vô trùng Nồi hấp Autoclave và nồi hấp hơi nước Tủ sấy 3.3.2. Hóa chất - Các hóa chất vô cơ: AgNO 3 , Bi(NO 3 ) 3 , Fe 2 (SO 4 ) 3 , HCl, HgCl 2 , HNO 3 , H 2 SO 4 , KI, NaOH, NH 4 OH. - Các hóa chất hữu cơ: anhidrid acetic, cloroform, diethyl ether, etanol. 3.3.3. Môi trƣờng sử dụng 3.3.3.1. Môi trƣờng dinh dƣỡng - Môi trường PGA (Potato glucose agar) Khoai tây: 200 (g) Glucose: 20 (g) Agar: 20 (g) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) 27 - Môi trường PGA + 10% nước dừa già Khoai tây: 200 (g) Glucose: 20 (g) Agar: 20 (g) Nước dừa: 100 (ml) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) - Môi trường PGA + 10% dịch chiết cà rốt Khoai tây: 200 (g) Glucose: 20 (g) Agar: 20 (g) Cà rốt: 100 (ml) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) - Môi trường Mizuno Pepton: 10 (g) Glucose: 25 (g) Maltose: 50 (g) NaCl: 5 (g) Agar: 20 (g) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) Điều chỉnh môi trường về pH = 6 – 6,5 - Môi trường Czapek – Dox Saccharose: 30 (g) NaNO 3 : 3 (g) KH 2 PO 4 : 1 (g) MgSO 4 : 0,5 (g) KCl: 0,5 (g) FeSO 4 : 0,01 (g) Agar: 20 (g) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) Điều chỉnh môi trường về pH = 6 – 6,5 28 - Môi trường lỏng PG (Potato glucose) Khoai tây: 200 (g) Glucose: 20 (g) Nước cất vừa đủ: 1000 (ml) Các môi trường đều được khử trùng ở 121 o C trong 25 phút. 3.3.3.2. Môi trƣờng nhân giống: Chọn loại lúa gạo tốt, nấu cho lúa vừa nứt nanh, vớt ra để ráo, sau đó phối trộn vào trong các nghiệm thức thí nghiệm. 3.3.3.3. Môi trƣờng giá thể mạt cƣa cao su: Mạt cưa mua về cần phải rây để loại bỏ dăm bào, sau đó ủ với nước vôi 0,25% qua đêm và tiến hành phối trộn dinh dưỡng theo các nghiệm thức thí nghiệm. 3.4. Phƣơng pháp thí nghiệm 3.4.1. Quan sát hình thái giải phẩu quả thể nấm Amauroderma subresinosum 3.4.1.1. Hình thái quả thể nấm 3.4.1.2. Phƣơng pháp quan sát hệ sợi nấm [7]  Lấy một ít sợi nấm dàn đều vào 1 giọt nước có trên lam kính  Cố định sợi nấm trên lam kính bằng cách hơ nhẹ mặt dưới lam kính qua lại trên ngọn lửa đèn cồn  Nhuộm bằng dung dịch fuchsin trong 5 – 10 phút  Rửa thuốc nhuộm bằng cồn 95%  Rửa ngay với nước cất để chấm dứt công đoạn tẩy màu  Quan sát mẫu vật dưới vật kính x100 3.4.1.3. Phƣơng pháp quan sát bào tử nấm Linh chi đen [19, 20]  Lấy quả thể nấm Linh chi đen trong giai đoạn phóng thích bào tử, đặt lên 1 tờ giấy trắng để thu bào tử  Dùng khuyên cấy lấy ít bào tử rồi dàn đều vào 1 giọt nước trên lam kính  Cố định bào tử trên lam kính bằng cách hơ nhẹ mặt dưới của lam kính qua ngọn lửa đèn cồn đến khô  Quan sát bào tử nấm dưới vật kính x100 3.4.2. Khảo sát sinh trƣởng hệ sợi nấm Linh chi đen trên các môi trƣờng thạch Theo T. Mizuno (1998), môi trường dùng phân lập giống từ thiên nhiên và phân giống cấp 1 thường là môi trường có chứa Maltose. Để xác định môi trường thích hợp 29 nhất cho việc bảo quản và nhân giống cấp 1 phù hợp với phòng thí nghiệm ở Việt Nam và chuẩn bị cho quá trình phát triển nuôi trồng sản xuất, chúng tôi tiến hành khảo sát tốc độ tăng trưởng của hệ sợi nấm trên các loại môi trường: PGA, PGA bổ sung, Mizuno, Czaper – Dox. Thí nghiệm được bố trí với 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 10 đĩa với 3 lần lặp lại: Nghiệm thức Môi trường nuôi cấy 1 PGA 2 PGA + 10% nước dừa 3 PGA + 10% dịch chiết cà rốt 4 Mizuno 5 Czaper - Dox Tổng số đĩa cấy: 150 đĩa Các chỉ tiêu theo dõi sau khi cấy 2 ngày:  Đo tốc độ lan tơ nấm (cm/ngày)  Quan sát màu sắc và hình thái sợi nấm Cách tiến hành thí nghiệm: Các môi trường đều hấp khử trùng ở 121 o C/25 phút. Đổ môi trường vào đĩa petri vô trùng, để nguội, cấy giống vào đĩa và ủ ở nhiệt độ phòng (30 2 o C). Theo dõi và tiến hành đo đường kính của khuẩn lạc định kỳ 2 ngày 1 lần cho đến khi hệ sợi lan ra hết đĩa petri. 3.4.3. Nghiên cứu quá trình lên men dịch thể Chúng tôi khảo sát sự tích lũy sinh khối sợi nấm Linh chi đen trên môi trường lỏng PG Cách tiến hành: pha môi trường và đổ vào chai thuỷ tinh 0.5 lít một lượng môi trường 50 ml. Hấp khử trùng ở 121 o C/25 phút, để nguội và cấy một lượng giống nhất định vào (mỗi lần cấy gắp 1 hạt lúa), ủ ở nhiệt độ phòng. Tiến hành thu nhận sinh khối ở các ngày 10, 15, 20. Sinh khối được sấy đến khô ở nhiệt độ 50 o C và tiến hành cân trọng lượng khô. Trong quá trình thí nghiệm, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần 10 chai. Tổng số chai cấy là 30 chai. 30 3.4.4. Khảo sát sự sinh trƣởng của sợi nấm trên môi trƣờng nhân giống Nguyên liệu dùng là hạt lúa nấu chín và mạt cưa cao su bổ sung các thành phần: cám gạo, cám bắp theo tỷ lệ của các nghiệm thức thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí với 4 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 10 ống với 3 lần lặp lại: Nghiệm thức Môi trường nuôi cấy 1 Lúa 90% + mạt cưa 5% + cám gạo 5% 2 Lúa 50% + mạt cưa 25% + cám gạo 25% 3 Mạt cưa 50% + cám bắp 50% 4 Lúa 50% + cám bắp 25% + cám gạo 25% Tổng số ống nghiệm cấy: 120 ống nghiệm Các chỉ tiêu theo dõi:  Đo tốc độ lan sâu của sợi nấm 3 ngày 1 lần (cm/ngày)  Quan sát màu sắc, đặc điểm sợi nấm Cách tiến hành thí nghiệm: Tiến hành phối trộn môi trường theo các nghiệm thức thí nghiệm sao cho độ ẩm đạt khoảng 60%, cho môi trường vào khoảng 2/3 chiều dài ống nghiệm, khử trùng 121 o C/60 phút, để nguội và cấy giống vào ở độ tuổi 10 – 12 ngày. Tiến hành theo dõi và đo độ lan sâu của sợi nấm theo định kỳ 3 ngày một lần. 3.4.5. Khảo sát sự sinh trƣởng và phát triển của nấm Linh chi đen trên môi trƣờng mạt cƣa cao su Thí nghiệm được bố trí với 10 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 13 bịch với 3 lần lặp lại: Nghiệm thức Môi trường giá thể mạt cưa cao su 1 Mạt cưa cao su + cám gạo 5% + urê 2,5 o / oo 2 Mạt cưa cao su + cám gạo 5% + urê 2,5 o / oo + DAP 2,5 o / oo 3 Mạt cưa cao su + SA 5 o / oo + DAP 2,5 o / oo 4 Mạt cưa cao su + nitrat canxi 5 o / oo + DAP 2,5 o / oo 5 Mạt cưa cao su + N-P-K202015 5 o / oo 6 Mạt cưa cao su + cám gạo 10% . 6 – 6,5 - Môi trường Czapek – Dox Saccharose: 30 (g) NaNO 3 : 3 (g) KH 2 PO 4 : 1 (g) MgSO 4 : 0,5 (g) KCl: 0,5 (g) FeSO 4 : 0,01 (g) Agar: 20 (g) Nước cất vừa đ : 1000 (ml). chấm dứt công đoạn tẩy màu  Quan sát mẫu vật dưới vật kính x100 3. 4.1 .3. Phƣơng pháp quan sát bào tử nấm Linh chi đen [19, 20]  Lấy quả thể nấm Linh chi đen trong giai đoạn phóng thích bào. chất vô c : AgNO 3 , Bi(NO 3 ) 3 , Fe 2 (SO 4 ) 3 , HCl, HgCl 2 , HNO 3 , H 2 SO 4 , KI, NaOH, NH 4 OH. - Các hóa chất hữu c : anhidrid acetic, cloroform, diethyl ether, etanol. 3. 3 .3. Môi trƣờng