41 3.2.1.1 Thiết bị chính (tháp lên men) Đặc điểm: loại tháp đệm, thân hình trụ được chế tạo từ vật liệu thủy tinh hữu cơ, đáy inox hoặc bằng thép không rỉ, hệ thống van và đường ống nhựa. Thông số kích thước tháp:  Đường kính D=100 mm.  Bề dày δ=2 mm.  Chiều cao H = 1200 mm; có chiều cao lớp đệm h = 1025 Vật liệu làm chất mang vi khuẩn giấm: Trên cở sở các yêu cầu về vật liệu làm chất mang vi sinh vật đã trình bày ở phần I, nhận thấy thân tre Việt Nam có thể đáp ứng được vì có các ưu điểm: rẻ tiền, dễ kiếm, có tính trơ và độ nhám cao, bề mặt riêng lớn, không chứa các chất gây ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật, dễ gia công và xử lý. Vì thế, chọn thân tre làm chất mang để nghiên cứu và khảo nghiệm khả năng thay thế cho phôi gỗ sồi. Hình 3.2 Vật liệu mang vi khuẩn acid acetic được làm từ thân tre Phương pháp gia công – xử lý: thân tre về được gọt bỏ lớp vỏ trơn bên ngoài để tăng độ nhám, sau đó được cắt thành những đoạn ngắn có kích thước: (xem hình 3.2) 42  Đường kính ngoài: d N = 11.9 mm  Đường kính trong: d T =8,3 mm  Chiều cao: h = 12,2 mm Vật liệu bám (thân tre) được xử lý triệt khuẩn bằng hơi nước nên trước khi cho vào tháp, vật liệu đệm được đem luộc và sấy khô nhiều lần nhằm tách hết những chất không có lợi cho vi khuẩn giấm và quá trình lên men như: tinh dầu, lignin, …Sau đó, đem ngâm với dịch cấy giống trong một ngày rồi cho vào tháp một cách ngẫu nhiên để tiến hành cấy giống. 3.2.1.2 Các thiết bị phụ Bộ phận phân phối lỏng: đây là bộ phận biến dòng liên tục thành dòng gián đoạn cung cấp cho tháp lên men dưới dạng xung. Nó hoạt động theo cơ cấu máng lật. Lưu lượng lỏng được đo bằng cách thay đổi đối trọng ở máng lật để đo thể tích dịch lên men trong mỗi lần lật, và dùng thì kế để đo thời gian mỗi lần lật. Lưu lượng dòng lỏng: 50÷200ml/phút; Lưu lượng kế khí (rotameter): thang đo từ 0 đến 1,54m 3 /ph; Bình mariot: ổn định lưu lượng lỏng theo nguyên tắc chiều cao hình học của dòng chảy không đổi; Bơm hoàn lưu: công suất 1/4 Hp; năng suất 0,1 m 3 /h Các thiết bị được mô tả theo sơ đồ hệ thống hình 3.4 3.2 Nguyên liệu 3.2.1 Giống vi khuẩn giấm Chọn giống: như đã trình bày ở phần I, giống vi khuẩn giấm được chọn để nghiên cứu quá trình lên men là giống acetobacter – loài aceti vì có nhiều ưu điểm thích hợp cho phương pháp lên men nhanh:  Có độ bám dính cao.  Tạo màng mỏng tơi xốp.  Tích lũy và chịu được nồng độ axit cao khoảng 6%. 43 Đặc điểm sinh học của vi khuẩn acetobacter: chúng là trực khuẩn ngắn, không chuyển động và có thể liên kết với nhau tạo thành chuỗi dài, nhuộm màu vàng với dung dịch iod, có thể sống ở nồng độ cồn khá cao 11%. Nhiệt độ phát triển tối ưu của chúng là 34 0 C. Nếu nhiệt độ cao quá (40 0 C) sẽ gây ra hiện tượng co tế bào và tạo thành hình quả lê. Nhiệt độ trung bình của miền Nam rất phù hợp cho sự phát triển của con giấm. (Theo Nguyễn Công Huân, 1985). Những chủng vi khuẩn aceti này rất hiếu khí. Tốc độ sinh trưởng của chúng rất nhanh. Từ một tế bào sau 12h có thể phát triển thành 17 triệu tế bào. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, chúng tạo thành acid acetic và nồng độ acid thấp lại kích thích sự sinh trưởng của chúng. (Lương Đức Phẩm, 1998) Giống vi khuẩn giấm acetobacter aceti được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm Vi Sinh thuộc Khoa Công Nghệ Thực Phẩm – Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, vi khuẩn này đã được phân lập và nuôi thuần chủng. 3.2.2 Thành phần môi trường và cấy giống lên men Trong quá trình lên men vi sinh vật thường lấy chất dinh dưỡng từ dịch lên men. Do đó, việc cung cấp đầy đủ và cân đối các thành phần dinh dưỡng trong dung dịch lên men là một trong những yếu tố quyết định đến năng suất của cả quá trình lên men. Thành phần dịch lên men hay môi trường lên men phải có đầy đủ các thành phần cơ bản sau: nguồn dinh dưỡng cacbon, nitơ, khoáng, các yếu tố vi lượng và các chất kích thích sinh trưởng. Các chất hữu cơ dùng làm nguồn dinh dưỡng cacbon cho sự phát triển của vi khuẩn giấm có thể kể đến như: cồn, các loại nước ép trái cây có đường, mật rỉ, đường đơn, đường kép,… Như đã trình bày ở phần trên (xem 1.6) thì nước dùng trong quá trình lên men phải đảm bảo đúng tiêu chuẩn nước uống. Nước này phải không có màu, mùi, vị lạ, không chứa kim loại nặng (thuỷ ngân, bari, chì,…). Vì vậy, nước được chọn dùng để pha môi trường lên men trong thí nghiệm này là nước máy đã qua quá trình xử lý. 44 Môi trường cấy giống và lên men được pha theo thực đơn tham khảo do Khoa Công Nghệ Thực Phẩm – trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh có thành phần ở bảng 3.1 sau: Bảng 3.1. Thành phần của môi trường cấy giống và lên men Môi trường Thành phần Số lượng Cấy giống Nước máy 5lít Đường glucose 50g Cao nấm men 25g Pepton 15g Cồn thực phẩm 25ml Acid acetic 1,5ml Nước dừa già 1lít Giống (từ lên men chậm) - Lên men Nước máy 20lit Đường glucose 200g Cồn thực phẩm 800ml Nước dừa già 2lit Acid acetic 200ml Dung dịch môi trường (khi chưa bổ sung dịch giống) thì được đem khử trùng. Chế độ khử trùng chung cho hai môi trường trên là: 121 0 C, trong 20 phút. Trước khi lên men thì mới bổ sung dịch giống vào môi trường đã khử trùng. 3.2.3 Các hóa chất và dụng cụ thí nghiệm khác:  Máy đo pH: 744 pH Meter  Các dung dịch dùng chuẩn độ: NaOH 0,1N; HCl 0,1N và phenolphthalein.  Nhiệt kế, đồng hồ, pipet, buret, phiểu, bình tam giác, ống đong, … 45 3.3 Phương pháp thí nghiệm 3.3.1 Cấy giống Hình 3.3 Tháp lên men trước và sau khi cấy giống vi khuẩn acid acetic Pha dịch cấy giống theo bảng 3.1. Sau đó, đem khử trùng và tiến hành lên men theo phương pháp chậm trong 7 ngày. Kiểm tra nồng độ acid acetic 2% là được và cho tưới dịch qua tháp đã có sẵn chất mang vi khuẩn giấm (hình) với lưu lượng dòng lỏng không đổi 80ml/ph, tháp được thông khí tự nhiên. Tiếp tục tuần hoàn dịch với chế độ trên, theo dõi nhiệt độ trong và ngoài tháp (nhiệt kế được cắm trực tiếp vào tâm tháp như sơ đồ hệ thống lên men hình 3.4). Khi thấy nhiệt độ trong và ngoài tháp chênh lệch từ 2÷5 0 C, nồng độ acid ở đầu vào và đầu ra có biến đổi và có màng mỏng màu trắng đục của vi khuẩn (a) (b) (a). Chưa có màng vi khuẩn (b). Màng vi khuẩn đã phát triển 46 giấm bám trên bề mặt chất mang, đó là những dấu hiệu cho thấy vi khuẩn đã bám vào chất mang, đang sinh trưởng và phát triển. Lúc này, có thể tiến hành thí nghiệm lên men. Thời gian cấy trong vòng 04 ngày – đêm. 3.3.2 Lên men Pha dịch lên men theo bảng 3.1 rồi đem khử trùng. Sau đó, dịch lên men được tưới vào tháp lên men theo sơ đồ hệ thống thí nghiệm (hinh 3.4). 47 3 4 5 6 7 8 9 10 2 1 Chu thich: 1. Luu luong ke 2.quat 3. Thung c ao vi 4.thung phan phoi long 5. Lo lay mau 6. Nhiet ke 7. Cot c hem 8. Ong thong khi 9. Thung chua san pham 10. Bom hoan luu Hình 3.4 Sơ đồ hệ thống thiết bị thí nghiệm lên men acid acetic bằng phương pháp nhanh Chú thích: 1. Lưu lượng kế 2. Quạt 3. Thùng cao vị 4. Thùng phân phối lỏng 5. Lổ lấy mẫu 6. Nhiệt kế 7. Cột chêm 8. Bộ phận thông khí 9. Thùng chứa sản phẩm 10. B ơ m hoàn l ư u 48 Với sơ đồ hình 3.4, dịch lên men được cho vào bình mariot (3) và chảy xuống bộ phận phân phối lỏng (4) theo cơ cấu máng lật, dịch được tưới đều vào khối đệm trong tháp lên men (7) theo một chu kỳ thích hợp. Dịch lên men chảy từ đỉnh tháp xuống tiếp xúc với màng vi khuẩn giấm bám trên các đệm tre. Tại đây, quá trình lên men sẽ diễn ra. Tùy vào chế độ khảo sát mà không khí được thông tự nhiên bởi ống thông khí (8) hay cưỡng bức nhờ quạt thổi (2) qua lưu lượng kế (1) từ dưới đáy tháp lên. Dịch lên men sau khi qua tháp, chảy vào bình chứa sản phẩm (9), một phần sẽ được hoàn lưu lên đỉnh tháp nhờ bơm hoàn lưu (10) (khi cần khảo sát dòng hoàn lưu). Trong quá trình lên men, nhiệt độ được theo dõi nhờ nhiệt kế (6). Mỗi chế độ thí nghiệm, cho hệ thống chảy ổn định khoảng một giờ để vi khuẩn giấm có thời gian thích ứng với điều kiện thí nghiệm. Sau đó mới lấy mẫu đem chuẩn độ, ở đây chọn chế độ thí nghiệm thông khí tự nhiên. 3.3.3 Cách lấy mẫu Mỗi thí nghiệm giữ nguyên cố định lưu lượng lỏng là 80ml/phút. Tùy theo yêu cầu của mỗi chế độ thí nghiệm thực nghiệm mà mẫu được lấy ra theo các vị trí khác nhau trên tháp. Tháp lên men được chia thành các vị trí lấy mẫu khác nhau như sau: 49 3 4 5 6 2 1 0 Hình 3.5 Sơ đồ vị trí lấy mẫu trên thân tháp Nhưng trong quá trình thí nghiệm thực nghiệm này chúng ta chỉ lấy mẫu ở vị trí 0 và 6 tức là đầu vào và đầu ra của hệ thống lên men. Để tránh sai số ở mỗi thí nghiệm, lấy 3 mẫu cách nhau 15 phút đem phân tích bằng phương pháp chuẩn độ. Vào Ra 50 3.3.4 Khảo sát thí nghiệm của thành phần môi trường lên tốc độ lên men 3.3.4.1 Trên thành phần môi trưòng nước dừa 3.3.4.1.1 Thay đổi nồng độ phần trăm môi trường nước dừa A Thí nghiệm thăm dò bằng lên men chậm Mục đích: tìm thành phần môi trường lên men đạt hiệu quả cao nhất khi thay đổi hàm lượng nước dừa trong môi trường. Thành phần môi trường: tổng thể tích 1 lít Nước máy: 0,79 l Cồn: 40 ml Acid acetic: 20 ml Đường: 10 g Nước dừa già: 100 ml (10%- thay đổi theo từng môi trường) Dịch giống 50 ml Chỉ thay đổi hàm lượng nước dừa và nước máy trong môi trường để tổng thể tích là 1lít. Khi đó ta thay đổi thành phần môi trường bằng việc tăng hàm lượng phần trăm nước dừa: 10%, 20%, 30%, 40%, 50%. Sau đó tiến hành lên men thử nghiệm bằng phương pháp lên men chậm. Sau khi pha môi trường, mỗi môi trường cho vào một bình riêng, đậy kín và để ở nơi yên tĩnh. Mỗi ngày lấy 5ml dịch lên men ở từng môi trường lên men khác nhau đem chuẩn độ acid bằng dung dịch NaOH 0.1N. B Thí nghiệm chính bằng lên men nhanh Mục đích: kiểm tra bằng thực nghiệm lên men nhanh các môi trường với thành phần môi trường đã thay đổi nồng độ nước dừa, để đánh giá chính xác hiệu quả lên men nhanh của thành phần môi trường đem thí nghiệm. Ở từng thành phần môi trường khác nhau: 10%, 20%, 30%. Pha 20l môi trường nước dừa. Sau đó cho lên men nhanh từng môi trường ở cùng điều kiện thí nghiệm. . 5ml dịch lên men ở từng môi trường lên men khác nhau đem chuẩn độ acid bằng dung dịch NaOH 0.1N. B Thí nghiệm chính bằng lên men nhanh Mục đích: kiểm tra bằng thực nghiệm lên men nhanh các. hành thí nghiệm lên men. Thời gian cấy trong vòng 04 ngày – đêm. 3.3.2 Lên men Pha dịch lên men theo bảng 3.1 rồi đem khử trùng. Sau đó, dịch lên men được tưới vào tháp lên men theo sơ đồ hệ. thống thiết bị thí nghiệm lên men acid acetic bằng phương pháp nhanh Chú thích: 1. Lưu lượng kế 2. Quạt 3. Thùng cao vị 4. Thùng phân phối lỏng 5. Lổ lấy mẫu 6. Nhiệt kế 7. Cột chêm 8.