40 TÌM HIỂU VỀ NẤM SỢI 2.9. NẤM SỢI (NẤM MỐC) [5], [33] Nấm mốc (molds, moulds) là tên chung để chỉ tất cả các nhóm nấm không phải là nấm men mà cũng không phải là các nấm lớn có mũ nấm (như nấm rơm, nấm gỗ,…). Nấm mốc bao gồm nhiều loài nấm thuộc các nhóm phân loại khác nhau. Nấm mốc phân bố rộng rãi trong tự nhiên (trong đất, trong phân chuồng, trong nước, trong không khí, trên các loại nguyên vật liệu, lương thực, thực phẩm, hoa quả,…). Nấm mốc góp phần quan trọng trong việc đảm bảo các vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Chúng có khả năng phân giải mạnh mẽ các hợp chất hữu cơ phức tạp (như pectin, cellulose, protein, lipid,…). Từ lâu nhân dân ta đã biết sử dụng các quá trình lên men truyền thống nhờ nấm mốc, ví dụ như chế tạo tương. Trong những năm gần đây, nấm mốc đã được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp lên men ở hầu hết các nước trên thế giới. Nhiều loài nấm mốc được dùng trong công nghiệp sản xuất các chế phẩm men (amylase, protease, lipase, pectinase, cellulase,…) hoặc được dùng để chế biến các loại thực phẩm (đường hóa tinh bột, chế tạo nước chấm, thức ăn gia súc,…). Nhiều loại nấm mốc được sử dụng để tổng hợp ở quy mô công nghiệp các loại acid hữu cơ (acid citric, acid lactic, acid oxalic, acid malic,…). Các loại acid này đều là những mặt hàng có giá trị trong công nghiệp hóa chất, công nghiệp thực phẩm, công nghiệp in nhuộm, công nghiệp dược phẩm,… Một số nấm mốc có khả năng tích lũy vitamin (B 2 , -caroten) hoặc các chất sinh trưởng (gibberelin, heterauxin,…). Một số nấm mốc có khả năng sản sinh nhiều loại alkaloid có giá trị chữa bệnh cao (amanitin, bufofein, muscarin,…). Nấm mốc còn được sử dụng như những tác nhân hóa học để chuyển hóa một cách tinh vi và chính xác từng gốc hợp chất xác định trong phân tử các chất thuộc loại steroid. Nhờ tác dụng này mà càng ngày người ta càng có thêm nhiều dược phẩm quý giá. Gần đây, nhiều loại nấm mốc đã được nghiên cứu sử dụng để sản xuất một số acid amin hoặc một số nucleotide và nucleozide (dùng trong công nghiệp thực phẩm 41 hoặc trong y dược). Có loại nấm mốc đang được nghiên cứu để tổng hợp cả cao su nhân tạo. Một số nấm mốc được sử dụng như những vi sinh vật chỉ thị trong việc định lượng vitamin, định lượng acid amin, định lượng nguyên tố vi lượng, kiểm tra hàm lượng N và P dễ tiêu trong đất, và nhất là kiểm tra hiệu quả tác dụng của các chất chống ung thư. Nấm mốc còn là nguồn của hàng loạt chất kháng sinh có giá trị như Penicillin, Cephalosporin, Fuzidin, Eniatin, Fungisporin, Verucarin,… Có thể nói khả năng ứng dụng nấm mốc đang tăng lên hàng ngày, hàng giờ trên thế giới. Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích nhiều mặt, nấm mốc cũng là nguyên nhân gây ra nhiều tổn thất hết sức to lớn cho việc bảo vệ mùa màng, bảo quản lương thực, thực phẩm, hàng hóa, vải vóc, phim ảnh, sách vở,… Nhiều loại nấm mốc còn gây nên những bệnh khá phổ biến và khó điều trị ở người, gia súc và cây trồng. Các bệnh nấm ở người (như hắc lào, nấm vẩy rồng, nấm kẽ chân, nấm tóc, nấm toàn thân,…) rất hay gặp ở nước ta và đã gây ra những ảnh hưởng không nhỏ đối với sức khỏe và năng suất lao động.  Nấm mốc có cấu tạo hình sợi phân nhánh, những sợi này sinh trưởng ở đỉnh và phát triển rất nhanh, tạo thành một đám chằng chịt các sợi. Từng sợi được gọi là khuẩn ti hay sợi nấm. Còn cả đám sợi thì được gọi là khuẩn ti thể hay hệ sợi nấm. Nấm mốc là loại thực vật không có diệp lục, do đó không có khả năng tiến hành quang hợp như các loại cây xanh. Chúng sống nhờ các loại thức ăn hữu cơ có sẵn bằng khả năng hấp thụ của khuẩn ti. Đó là các cơ thể kí sinh hay hoại sinh. Một số khuẩn ti phát triển sâu vào cơ chất, giúp nấm mốc bám chặt vào cơ chất và hấp thụ các loại thức ăn chứa trong đó (khuẩn ti cơ chất hoặc khuẩn ti dinh dưỡng). Một số khuẩn ti khác phát triển trên bề mặt cơ chất (khuẩn ti khí sinh). Mỗi đoạn khuẩn ti khi rơi vào môi trường thích hợp sẽ phát triển nhanh chóng thành một đám nấm mốc mới. Ở một số loài, khuẩn ti được phân hóa thành những sợi bám trông giống như rễ cây, chúng được gọi là rễ giả. 42  Hai loại cơ quan dinh dưỡng thường gặp là thể đệm và hạch nấm. Thể đệm trông giống như cái đệm ghế, cấu tạo bởi nhiều khuẩn ti kết chặt lại với nhau. Cơ quan sinh sản thường được sinh ra bên trên hoặc bên trong thể đệm. Hạch nấm thường có hình hơi tròn hoặc hình không đều, bên ngoài thường có màu tối, bên trong là tổ chức sợi xốp hơn và thường có màu trắng. Kích thước của hạch nấm thay đổi tùy theo từng loài nấm (từ vài phần của mm đến vài cm, thậm chí ở một số nấm nhiệt đới, hạch nấm có đường kính lớn đến vài dm). Hạch nấm có thể giúp cho cơ thể nấm sống qua những điều kiện ngoại cảnh bất lợi trong một thời gian khá dài. Khi điều kiện sống trở lại thuận lợi, hạch nấm sẽ nẩy mầm và phát triển thành những khuẩn ti hoặc những thể sinh sản mới.  Nấm mốc có thể sinh sản theo nhiều hình thức khác nhau: Phát triển bằng khuẩn ti: một đoạn khuẩn ti riêng rẽ  phát triển thành một khuẩn ti thể  khuẩn ti và đất bụi theo gió bay khắp nơi  gặp điều kiện thuận lợi  phát triển thành cơ thể mới. Một số loài nấm mốc có khả năng hình thành những bào tử màng dày gọi là bào tử áo. Một số có thể phát triển bằng các hạch nấm. Những cách trên được gọi là sinh sản sinh dƣỡng. Về sinh sản vô tính của nấm mốc, người ta thấy có 2 hình thức: Bào tử kín được sinh ra ở trong các nang  nang vỡ  các bào tử kín được phóng thích ra ngoài, mỗi bào tử lại phát triển thành một khuẩn ti thể mới. Sinh sản vô tính bằng các bào tử trần, các bào tử trần do các tế bào sinh bào tử là các thể bình tạo thành. Ngoài ra, nhiều loài nấm mốc còn có thể sinh sản theo hình thức hữu tính. Cũng giống như các sinh vật bậc cao, sinh sản hữu tính ở nấm cũng xảy ra quá trình chất giao, nhân giao và quá trình phân bào giảm nhiễm. 43 2.10. ASPERGILLUS NIGER [33], [34], [42] Vị trí phân loại của Aspergillus niger được xếp như sau: Lớp: Deuteromyces Bộ: Moniliales Họ: Moniliaceace Giống: Aspergillus Nhóm: Aspergillus niger Hình 2.12: Aspergillus niger dƣới kính hiển vi (độ phóng đại x400) Khuẩn lạc Aspergillus niger trên môi trường cao nấm men Czapek (CYA) có dạng lông nhung, khi còn non có màu trắng, khi già có màu nâu đen, mặt trái của petri thường có màu vàng nhạt đến vàng sáng. Cuống sinh bào tử được sinh ra từ khuẩn ti khí sinh, có chiều dài 1 – 3 mm, có vách tế bào trơn bóng và trong suốt. Đỉnh cuống phình ra có dạng hình cầu được gọi là bọng, có đường kính từ 50 – 75 m, sinh ra 2 lớp thể bình: lớp thứ nhất hình tam giác cân ngược; lớp thứ hai hình chai, sinh ra bào tử đính hình cầu, bào tử đính có đường kính 4 – 5 m, có màu nâu đen, vách bào tử đính có dạng xù xì. Đặc tính sinh lý: Aspergillus niger sinh trưởng ở nhiệt độ tối thiểu 6 – 8 o C, tối đa 45 – 47 o C, tối ưu 35 – 37 o C (Panasenko, 1967). Độc tố: Aspergillus niger được xem là nấm sợi không sinh độc tố và được sử dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm. Các enzyme thủy phân thu nhận được từ chủng này không gây đột biến vi khuẩn và các mô của chuột. 44 Sinh thái: Aspergillus niger chiếm ưu thế ở vùng khí hậu nhiệt đới. Bào tử đính màu đen nên không bị ảnh hưởng bởi tia mặt trời và tia cực tím. Aspergillus niger thường được phân lập từ các sản phẩm phơi nắng: cá, cây gia vị,… Aspergillus niger làm thối rữa trái cây (táo, cam, quýt dâu,…) và hoa màu (hành, tỏi, cà chua,…) 2.11. TRICHODERMA REESEI [4], [26], [33], [41] Trichoderma reesei được phân loại như sau: Lớp: Deuteromycetes Bộ: Moniliales Họ: Moniliaceae Giống: Trichoderma Nhóm: Trichoderma reesei Hình 2.13: Trichoderma reesei dƣới kính hiển vi (độ phóng đại x400) Khuẩn lạc ban đầu trong suốt, sau đó có màu xanh lục do hình thành bào tử. Cuống sinh bào tử có dạng chùm, phân nhánh liên tục, sinh ra các thể bình có dạng hình tam giác, mỗi nhánh kết thúc bởi một thể bình. Đính bào tử hình cầu, đường kính 3,6 – 4,5 m, có màu xanh lục, có vách xù xì. Đặc tính sinh lý: Sinh trưởng ở nhiệt độ tối thiểu 0 o C, tối đa 30 – 37 o C, tối ưu 20 – 28 o C. Độc tố: Trichoderma reesei không sinh ra các chất kháng sinh và không gây bệnh cho động – thực vật, chế phẩm enzyme thô từ Trichoderma reesei không gây đột biến vi khuẩn và các mô, cũng như không gây quái thai cho chuột. 45 Sinh thái: Trichoderma reesei phân bố ở vùng cực Bắc, vùng núi, vùng nhiệt đới. Trichoderma reesei là nấm sợi sinh sản vô tính, phân lập được trên các đảo Solomon trong chiến tranh Thế giới thứ II từ các mảnh vải cotton. Chủng này có khả năng sinh ra một lượng lớn cellulase và là tổ tiên của nhiều biến chủng được sử dụng hiện nay. Trichoderma reesei có khả năng phân giải hoàn toàn cellulose tự nhiên với hiệu suất cao vì hệ enzyme cellulase của Trichoderma reesei đầy đủ 3 thành phần (endocellulase, exocellulase và -glucosidase) và được tiết ra môi trường nuôi cấy với một lượng lớn (có thể đạt 40 g/l). Vì vậy, đây là loại nấm có nhiều tiềm năng trong công nghiệp sản xuất enzyme cellulase. Cellulase của Trichoderma reesei có pH tối thích là 5,0 và nhiệt độ tối thích là 50 o C. Sinh tổng hợp cellulase từ Trichoderma reesei cũng như từ các chủng vi sinh vật khác đòi hỏi phải bổ sung chất cảm ứng vào môi trường nuôi cấy như cám, rơm, bã mía, mùn cưa,… 46 PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Hình 3.1: Cà phê Bi Hình 3.2: Cà phê Sẻ mua từ thị trƣờng mua từ thị trƣờng Hình 3.3: Cà phê Mokka mua từ thị trƣờng 47 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM 3.1.1. Thời gian Từ 1 – 3 – 2005 đến 1 – 8 – 2005. 3.1.2. Địa điểm o Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh. Địa chỉ: 268 Lý Thường Kiệt – Quận 10 – Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2. VẬT LIỆU 3.2.1. Cà phê nhân 3.2.1.1. Giống Chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên 3 loại cà phê với tên gọi trên thị trường là: o Cà phê Bi o Cà phê Sẻ o Cà phê Mokka 3.2.1.2. Nguồn gốc Nguồn mua từ cửa hàng mua bán cà phê tươi Thuận Hiệp Địa chỉ: 36A Nguyễn Thị Nhỏ – Phường 14 – Quận 5 – Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2.2. Nấm sợi Các chủng được sử dụng là Aspergillus niger và Trichoderma reesei nhận từ Bộ môn Công nghệ sinh học – thuộc khoa Công nghệ Hóa học và Dầu khí – trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh. 3.2.3. Cơ chất o Malt o Cám gạo o Bột cà rốt o Trấu o Khoai tây o Bột mì o Bột sắn o CMC (Sodium carboxymethyl cellulose) 48 3.2.4. Môi trƣờng sử dụng 3.2.4.1. Môi trƣờng nuôi cấy nấm mốc Sử dụng môi trường thạch malt. 3.2.4.2. Môi trƣờng nhân giống Sử dụng môi trường cám gạo. 3.2.4.3. Môi trƣờng giữ giống Sử dụng môi trường PGA. 3.2.5. Hóa chất 3.2.5.1. Hóa chất sử dụng cho môi trƣờng o (NH 4 ) 2 SO 4 o Glucose o Agar o Nước cất 3.2.5.2. Hóa chất sử dụng cho phƣơng pháp xác định hoạt tính o Thuốc thử DNS (3,5-dinitrosalicylic acid) C 7 H 4 N 2 O 7  DNS  NaOH  Muối potassium sodium tartrate tetrahydrate C 4 H 4 O 6 KNa o Thuốc thử antron 0.2% (gồm antron và H 2 SO 4 đậm đặc) o Dung dịch CMC 1%  CMC  Dung dịch CH 3 COOH 1M  Dung dịch NaOH 1N o Dung dịch pectin 1% o Dung dịch NH 3 10% o Dung dịch ZnSO 4 15% o Glucose, lactose o Nước cất 3.2.5.3. Hóa chất sử dụng cho các phƣơng pháp xác định thành phần o Dung dịch HNO 3 đậm đặc o Dung dịch H 2 SO 4 đậm đặc o Dung dịch CH 3 COOH đậm đặc 49 o Dung dịch H 2 O 2 30% o Dung dịch H 2 SO 4 0,1N o Dung dịch NaOH 0,1N o Dung dịch NaOH 5% o Dung dịch CH 3 COOH 1N o Dung dịch HCl 5% o Dung dịch chì acetate 10% o Dung dịch Na 2 HPO 4 bão hòa o Dung dịch CaCl 2 2N o Dung dịch AgNO 3 1% o Acid perchloric (HClO 4 ) o Cồn 90 o , cồn 80 o o Rượu etylic 96% o Ete etylic o Thuốc thử DNS, antron o Phenolphtalein o Glucose o Nước cất 3.2.6. Thiết bị - Dụng cụ  Thiết bị o Máy đo quang phổ SPECTRO 2000RS (LaboMed,inc.) o Máy đo pH o Máy ly tâm o Máy xay o Máy cất đạm bán tự động GERHARDT (Đức) o Dụng cụ đo độ Brix Hand-held Refractometer (ATAGO) o Nồi hấp, tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh o Tủ hút o Ống làm lạnh hồi lưu o Cân điện tử, cân phân tích o Nhiệt kế [...]... trường cám gạo Đảo đều Cho vào tủ ấm 3.3.1.3 Phƣơng pháp cấy giống từ môi trƣờng nhân giống sang môi trƣờng chế phẩm Dùng đũa thủy tinh vô trùng trộn đều môi trường nhân giống Cho tất cả vào môi trường chế phẩm Trộn đều Cho vào tủ ấm 3.3.1 .4 Phƣơng pháp lên men Cà phê sau khi ngâm nước để đạt độ ẩm cần thiết, trộn đều với chế phẩm, cho vào rổ nhựa, phủ vải mùng lên và ủ (tỉ lệ chế phẩm, thời gian ủ tùy... đựng mẫu (được sấy khô đến trọng lượng không đổi) Cho vào tủ sấy (100 – 105oC trong 6 – 8 giờ đến khi trọng lượng không đổi) Làm nguội trong bình hút ẩm (20 – 30 phút) Đem cân Tính kết quả W(%) m1 m2 m 100 Trong đ : W: Độ ẩm của mẫu (%) m 1: Trọng lượng chén và trọng lượng mẫu trước khi sấy (g) m 2: Trọng lượng chén và trọng lượng mẫu sau khi sấy (g) m: Trọng lượng mẫu phân tích (g) ... Phƣơng pháp xác định độ ẩm Nguyên tắc Dựa trên nguyên lý làm khô mẫu ở nhiệt độ 100 – 105oC đến trọng lượng không đổi Lượng mẫu mất khi sấy mẫu đến trọng lượng không đổi là lượng nước có trong mẫu Phương pháp này loại trừ được các sai số do các phản ứng xảy ra khi sấy mẫu ở nhiệt độ cao 52 Cách thực hiện Mẫu cần xác định độ ẩm Nghiền nhỏ Cân chính xác một lượng nhất định (5 – 10 g) Cho vào chén đựng... 1000ml o Ống đong các loại o Bình định mức các loại o Pipette các loại o Đèn cồn, que cấy, đũa thủy tinh o Phễu lọc, giấy lọc o Bếp điện, chảo rang o Rổ nhựa, vải mùng 3.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.3.1 Phƣơng pháp vi sinh vật [22] 3.3.1.1 Phƣơng pháp cấy chuyền và giữ giống (trong điều kiện vô trùng) a Phƣơng pháp cấy chuyền Pha chế môi trường nuôi cấy (môi trường thạch malt) Cho vào 1/3 ống nghiệm... ở 121oC trong 15 phút Để nghiêng 45 o đến khi thạch đông cứng lại Ống giống Dùng que cấy vòng đã thanh trùng cấy ria theo đường zic zắc Cho vào tủ ấm b Phƣơng pháp giữ giống Cấy chuyền giữ giống nấm sợi từ môi trường thạch malt sang môi trường giữ giống (môi trường PGA) 51 3.3.1.2 Phƣơng pháp nhân giống (trong điều kiện vô trùng) Ống nghiệm giống Cho vào 10 ml nước cất hấp vô trùng Khuấy Cho vào môi . thị trường l : o Cà phê Bi o Cà phê Sẻ o Cà phê Mokka 3.2.1.2. Nguồn gốc Nguồn mua từ cửa hàng mua bán cà phê tươi Thuận Hiệp Địa ch : 36A Nguyễn Thị Nhỏ – Phường 14 – Quận 5 – Thành phố Hồ. và được sử dụng rộng rãi trong chế biến thực phẩm. Các enzyme thủy phân thu nhận được từ chủng này không gây đột biến vi khuẩn và các mô của chuột. 44 Sinh thái: Aspergillus niger chiếm. cellulose tự nhiên với hiệu suất cao vì hệ enzyme cellulase của Trichoderma reesei đầy đủ 3 thành phần (endocellulase, exocellulase và -glucosidase) và được tiết ra môi trường nuôi cấy với một lượng