19 thì 11 kiểu huyết thanh trên đã chiếm 80% các chủng Salmonella phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm [5]. Trong khi đó, sự hiện diện của Salmonella trong môi trường và trong thực phẩm là rất cao, chúng phân bố ở mọi nơi khắp thế giới. Theo nhiều cuộc điều tra ở Anh, Mỹ cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella trong phân khoảng 9 – 14,4%, manh tràng nhiễm 44,8%, hạch màng treo ruột 27%, xúc xích 28 – 29,7% và thịt heo tươi nhiễm 4,15% [15]. Salmonella hiện diện trong 65% mẫu nước được phân lập ở dọc theo Peavine Creek ở Decatur [3]. Trong một cuộc khảo sát sự hiện diện của Salmonella tại các sông ở Địa Trung Hải, các nhà nghiên cứu cũng phân lập được hơn 574 chủng Salmonella thuộc hơn 40 kiểu huyết thanh khác nhau [5]. Tại Việt Nam, trong cuộc điều tra về sự ô nhiễm Salmonella trong thực phẩm trên thị trường Hà Nội, kết quả cho thấy: tỷ lệ nhiễm Salmonella trong thịt lợn vào khoảng 33,33%, thịt bò khoảng 40%, thịt gà khoảng 39,29% và giò sống khoảng 46,67% [13]. Theo Nguyễn Thị Oanh và Tiêu Quang An (2003), tỷ lệ nhiễm Salmonella ở trâu, bò tại Đắc Lắc vào khoảng 45,36% và 41,25% [9]. Tại hội thảo 2004 về vệ sinh an toàn thực phẩm, chi cục Thú y Tp.HCM cho biết kết quả xét nghiệm năm 2003 với 299 mẫu thịt tươi tại các chợ cho thấy khoảng 18% nhiễm Salmonella [20]. Các tỷ lệ nhiễm Salmonella trong môi trường và thực phẩm cao như trên cho thấy khả năng hiện diện Salmonella trong thành phẩm chế biến có ít hay nhiều là không tránh khỏi. Tuy nhiên, vấn đề đặt ra có phải tất cả Salmonella hiện diện trong thực phẩm, môi trường đều gây nguy hại cho người. Theo AFSSA, số kiểu huyết thanh Salmonella phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm chỉ chiếm dưới 4,4% số kiểu huyết thanh phân lập được từ môi trường [5]. Đồng thời, các nghiên cứu của Reilly et al., 1992 tại xứ Wales và Australia cho thấy S. weltevreden là kiểu huyết thanh thường xuyên phát hiện trong các hồ nuôi tôm nhưng kết quả thống kê của CDC Hoa Kỳ cho thấy kiểu huyết thanh này rất hiếm khi được phân lập từ mẫu bệnh phẩm của người [5]. Điều đó có nghĩa là khả năng gây bệnh của các kiểu huyết thanh này là rất thấp. Một nghiên cứu khác, xác định độc lực trên chuột của các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm và thực phẩm cho thấy 20/20 chủng có nguồn gốc từ thực phẩm đều không có khả năng gây bệnh và gây chết cho chuột [3, 5]. Như vậy, chúng ta có thể nói rằng chỉ có một số ít trong khoảng 2500 kiểu huyết thanh Salmonella thì có khả năng gây bệnh. 20 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN Thời gian thực hiện: từ tháng 3/2005 – 7/2005. Địa điểm: thí nghiệm được thực hiện tại Trạm xá Thú Y- Khoa Chăn Nuôi Thú Y và Phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Môi trường- Khoa Công Nghệ Môi Trường- Trường ĐH Nông Lâm TP. HCM. 3.2. DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ - Đĩa petri - Ống nghiệm - Erlen các loại - Ống đong các loại - Becher các loại - Pipetman các loại 100 µl, 1000 µl - Pipet 10 ml - Đèn cồn - Que cấy vòng, thẳng, trang - Bao PE vô trùng - Khay mổ - Kéo mổ - Kẹp gắp - Máy lắc - Tủ ấm - Tủ sấy - Cân 3.3. HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƢỜNG 3.3.1. Hóa chất - NaCl 0,85% vô trùng - Cồn 60 – 70 o - Nước cất. 3.3.2. Môi trƣờng - Môi trường BHI (Brain Heart Infusion Broth): Dùng để phục hồi và tăng sinh các chủng Salmonella trong quá trình nghiên cứu. Thành phần môi trường gồm: Dịch não bê 200g, Dịch tim bê 250g, Proteose peptone 10g, NaCl 5g, Na 2 HPO 4 2,5g, Dextrose 2g, Nước cất 1lít. - Môi trường TSA (Trypticase Soy Agar): Môi trường thạch dùng để giữ giống. Thành phần môi trường gồm: Tripticase peptone 15g, Phytone peptone 5g, NaCl 5g, Agar 15g, Nước cất 1lít. 21 - Môi trường XLD (Xylose Lysine Desoxycholate Agar): Môi trường dùng để định lượng Salmonella. Thành phần môi trường gồm: Cao nấm men 3g, L- lysine 5g, Xylose 3,75g, Lactose 7,5g, Sucrose 7,5g, Sodium desoxycholate 2,5g, Ferric ammonium citrate 0,8g, NaCl 5g, Agar 15g, Phenol red 0,08g, Nước cất 1lít. Môi trường XLD tổng hợp được pha chế trong nước cất vô trùng, đun sôi cho tan đều, để nguội đến 50 – 60 o C và sau đó đổ vào đĩa petri. Tất cả các môi trường trên (trừ XLD) đều được hấp khử trùng ở 121 o C trong 15 phút. 3.4. NGUYÊN VẬT LIỆU 3.4.1. Chủng vi sinh vật Bảng 3.1. Các chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu STT CHỦNG NGUỒN GỐC NGUỒN PHÂN LẬP 1 Salmonella enteritidis 99.303 Viện Pasteur (1) Bệnh phẩm người 2 S.enteritidis 02.158 Viện Pasteur Bệnh phẩm heo 3 S. typhimurium Viện Pasteur Bệnh phẩm heo 4 S.typhimurium 02.157 Viện Pasteur Bệnh phẩm heo 5 Salmonella SP 1b TT.CL,ATVS 4 (2) Thịt heo 6 Salmonella SP 2a TT.CL,ATVS 4 Thịt heo 7 Salmonella SP1a TT.CL,ATVS 4 Thịt heo 8 Salmonella SB 10 TT.CL,ATVS 4 Thịt bò 9 Salmonella SB11 TT. CL,ATVS 4 Thịt bò 10 Salmonella Ô13 CNSHMT (3) Ốc 11 Salmonella B34 CNSHMT Thịt bò 12 Salmonella M14 CNSHMT Mực 13 Salmonella VTr11 CNSHMT Vỏ trứng 14 Salmonella H51 CNSHMT Thịt heo (1) Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh, (2) Trung Tâm Chất lượng, An toàn vệ sinh và Thú y thủy sản vùng 4, TP. Hồ Chí Minh, (3) Phòng Công Nghệ Sinh Học Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm, TP. Hồ Chí Minh. 22 3.4.2. Chuột Thuộc loài chuột bạch Mus musculus trọng lượng khoảng 18 – 20 g, được mua tại Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh. Chuột thí nghiệm khỏe mạnh, sạch bệnh. 3.5. PHƢƠNG PHÁP Nguyên tắc chung: Mọi thao tác thí nghiệm phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng. Mọi dụng cụ thí nghiệm, môi trường dinh dưỡng phải được vô trùng trước khi sử dụng. 3.5.1. Phƣơng pháp pha loãng vi sinh vật Chủng vi khuẩn được hoạt hóa trên môi trường BHI, ủ ở 37 o C trong khoảng 18 – 24 giờ. Hút 1 ml dịch sau tăng sinh cho vào ống nghiệm chứa 9 ml NaCl vô trùng để được độ pha loãng 10 -1 , lắc đều, hút 1 ml từ nồng độ này cho vào một ống nghiệm khác chứa 9 ml NaCl để được độ pha loãng 10 -2 , cứ tiếp tục tương tự ta được các độ pha loãng tiếp theo. Các thí nghiệm trong nghiên cứu này sử dụng đến độ pha loãng 10 -8 . 3.5.2. Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào bằng cách đếm khuẩn lạc Hút 0,1 ml dịch vi khuẩn sau khi pha loãng cho vào đĩa môi trường XLD đã được chuẩn bị trước. Dùng que tam giác trải đều dịch trên môi trường. Mỗi độ pha loãng được trải ít nhất trên 2 đĩa. Ủ ở 37 o C trong 18 - 24 giờ. Chọn các đĩa có số đếm từ 25 – 250 khuẩn lạc để tính kết quả. Số lượng vi sinh vật trong 1 ml mẫu được tính theo công thức sau: [2, 3, 4] Trong đó: C: Số lượng Salmonella trong 1 ml mẫu (CFU/ml) N: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn n i : Số lượng đĩa được đếm tại độ pha loãng thứ i V i : Thể tích dịch mẫu cấy vào trong một đĩa f i : Độ pha loãng tương ứng. N n 1 x V 1 x f 1 + … + n i x V i x f i (cfu/ml) C = 23 3.5.3. Phƣơng pháp gây nhiễm trên chuột Khử trùng sạch bề mặt khu vực tiến hành gây nhiễm bằng cồn. Người tiến hành gây nhiễm phải đeo găng tay cao su. Chuẩn bị một cái khay sạch. Dùng xy-lanh hút lượng dịch vi khuẩn cần cho chuột uống. Cách gây nhiễm vi khuẩn vào chuột qua đường miệng được tiến hành như sau: Đặt chuột bò trên bề mặt lồng, tay phải nắm lấy đuôi, ngón tay trỏ và ngón tay cái bên trái nắm lấy hai tai và gáy chuột, ngón tay út trái kẹp lấy đuôi của chuột. Lật ngửa chuột lên và để theo chiều thẳng đứng. Tay phải lấy xy-lanh có dịch vi khuẩn và cho chuột uống. Thao tác được tiến hành nhẹ nhàng để tránh làm tổn thương chuột. Chuột sau khi được gây nhiễm, theo dõi biểu hiện bệnh hằng ngày. Quá trình theo dõi được thực hiện liên tục trong 14 ngày. 3.5.4. Phƣơng pháp khảo sát sự hiện diện của Salmonella trong gan, lách, dạ dày, ruột non và ruột già Chuột bị chết sau khi gây nhiễm hoặc sau thời gian theo dõi được tiến hành giải phẫu để xác định sự hiện diện của Salmonella trong gan, lách, dạ dày, ruột non và ruột già. Cách tiến hành: Sau khi chuột chết, dùng kim ghim bốn chân của chuột trên mảnh cao su được đặt trên khay mổ. Dùng kéo cắt da theo đường thẳng dọc theo chiều dài chuột và mở ra hai bên. Dùng kéo vô khuẩn để mở cơ hoành và lật ra hai bên để quan sát nội tạng, gan, lách. Cắt lấy gan, lách, dạ dày, ruột non và ruột già cho một bao PE vô trùng. Cho một thể tích xác định nước muối NaCl 0,85% tùy theo khối lượng gan, lách, dạ dày, ruột non và ruột già thu được vào bao PE. Dùng vật nặng có bề mặt nhẵn để nghiền nát các bộ phận đó. Toàn bộ dịch trong bao PE được cho vào bình tam giác vô trùng có nắp đậy (mỗi bộ phận được cho vào những bình khác nhau), bình này được lắc trên máy lắc khoảng 1 giờ. Dịch đồng nhất sau khi lắc được đem trải đều trên môi trường XLD để định lượng mật độ Salmonella trong gan, lách, dạ dày, ruột non và ruột già. 24 Hình 3.1. Dụng cụ mổ chuột Hình 3.2. Các bộ phận dạ dày, gan, lách, ruột non và ruột già trong đĩa a. b. Hình 3.3. Khuẩn lạc Salmonella trên môi trƣờng XLD a. Môi trƣờng trƣớc khi cấy; b. Khuẩn lạc đặc trƣng của Salmonella trên XLD 25 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KHẢ NĂNG GÂY BỆNH, GÂY CHẾT Ở CHUỘT DO CÁC CHỦNG SALMONELLA 4.1.1. Khả năng gây bệnh và gây chết chuột do các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm Thí nghiệm được tiến hành trên 4 chủng Salmonella được phân lập từ các nguồn bệnh phẩm nhận từ Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh. Các chủng Salmonella được gây nhiễm vào chuột qua đường miệng sau khi được phục hồi trên môi trường BHI trong 18 – 24 giờ ở 37 o C, theo dõi diễn biến bệnh lý ở chuột gây nhiễm trong thời gian 14 ngày. Mỗi chủng được gây nhiễm trên 4 chuột, mỗi chuột gây nhiễm 0,3 ml canh khuẩn, mật độ vi sinh vật trong canh khuẩn đã được xác định trước bằng phương pháp đếm khuẩn lạc, thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Kết quả thí nghiệm thu được sau 14 ngày gây nhiễm được thể hiện ở Bảng 4.1. Bảng 4.1. Kết quả thí nghiệm khả năng gây bệnh, gây chết cho chuột ở các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm STT Chủng Mật độ gây nhiễm (CFU/ml) Biểu hiện bệnh Số lƣợng chuột chết Thời gian gây chết 1 S.enteritidis 99.303 2,8 x 10 9 + 1/2 4 ngày 2,5 x 10 8 - 0/2 > 14 ngày 2 S.enteritidis 02.158 1,4 x 10 8 + 0/2 > 14 ngày 9,0 x 10 7 - 0/2 > 14 ngày 3 S. typhimurium 1,5 x 10 8 + 0/2 > 14 ngày 1,3 x 10 8 + 0/2 > 14 ngày 4 S. typhimurium 02.157 1,4 x 10 7 + 0/2 > 14 ngày 1,8 x 10 8 + 0/2 > 14 ngày Ghi chú: (+): có biểu hiện bệnh, (-): không biểu hiện bệnh 26 Kết quả ở Bảng 4.1 cho thấy hầu hết các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm đều có khả năng gây bệnh cho chuột. Nhưng chỉ có chủng S. enteritidis 99.303 có nguồn gốc từ bệnh phẩm người là chủng duy nhất có khả năng gây chết 1/2 chuột thí nghiệm sau 4 ngày gây nhiễm. Mật độ để Salmonella gây nhiễm vào chuột ở chủng S. enteritidis 99.303 là rất cao, khoảng 2,8 x 10 9 CFU/ml. Các chủng bệnh phẩm còn lại không có khả năng gây chết chuột nhưng hầu như đều làm cho chuột bệnh. Biểu hiện bệnh của chuột là xù lông, biếng ăn, gầy và ít chuyển động. Đối với chủng S. enteritidis 99.303 và chủng S. enteritidis 02.158 với mật độ gây nhiễm tương ứng là 2,5 x 10 8 CFU/ml và 9,0 x 10 7 CFU/ml thì biểu hiện bệnh lý của chuột không rõ ràng. So sánh với các nghiên cứu khác về khả năng gây bệnh, gây chết chuột ở các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm trên thì trong khảo sát này cho thấy mật độ gây bệnh gây chết chuột cao hơn rất nhiều so với các khảo sát trước đó. Theo Lu và cộng sự (1999), mật độ gây chết 50% chuột thí nghiệm của các chủng S. enteritidis và S. typhimurium trung bình vào khoảng 10 4 – 10 5 tế bào, một số chủng có độc lực mạnh có khả năng gây chết chuột với mật độ dưới 100 tế bào [3]. Theo Nguyễn Tiến Dũng và cộng sự (2004), các chủng S. enteritidis 99.303 và S. enteritidis 02.158 đều có khả năng gây chết chuột sau 14 ngày gây nhiễm, với mật độ gây nhiễm tương ứng là 9,5 x 10 7 CFU/ml và 2,4 x 10 8 CFU/ml [5]. Trong khảo sát này, có sự khác biệt như vậy có thể do các lý do sau: (1) Các chủng Salmonella bị giảm hay mất độc lực do quá trình bảo quản và cấy chuyền nhiều lần, (2) Các chủng phân lập từ các nguồn khác nhau nên có độc lực khác nhau… 4.1.2. Khả năng gây bệnh, gây chết ở chuột do các chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm Đối với các chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm thì cũng được tiến hành thí nghiệm tương tự như trong các chủng từ bệnh phẩm trên. Thí nghiệm được tiến hành trên 10 chủng có nguồn gốc từ những mẫu thực phẩm khác nhau. Kết quả thí nghiệm thu được sau 14 ngày gây nhiễm được thể hiện ở Bảng 4.2. 27 Bảng 4.2. Khả năng gây bệnh, gây chết chuột ở các chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm Kết quả ở Bảng 4.2 cho thấy, trong số các chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm thì chỉ có 2/10 chủng là có khả năng gây bệnh cho chuột nhưng có biểu hiện nhẹ, không có khả năng gây chết chuột, mật độ gây nhiễm khoảng 4,8 x 10 8 – 5,9 x 10 10 CFU/ml. Các chủng còn lại sau khi gây nhiễm vào chuột, qua theo dõi trong suốt quá trình thí nghiệm cho thấy các chuột này đều không có biểu hiện bệnh hay giảm cân. Trái lại, các chuột sau khi gây nhiễm này đều khỏe mạnh, nhanh nhẹn và tăng trọng sau 14 ngày gây nhiễm. 4.1.3. So sánh khả năng gây bệnh gây chết ở chuột giữa các chủng Salmonella từ bệnh phẩm và từ thực phẩm Kết hợp kết quả được thể hiện trên Bảng 4.1 và Bảng 4.2 cho thấy có sự khác biệt rõ ràng về khả năng gây bệnh gây chết chuột ở những chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm và từ thực phẩm. Các chủng Salmonella từ bệnh phẩm thì có độc lực cao như có thể gây bệnh, gây chết chuột sau 14 ngày gây nhiễm. Những chuột không chết trong khoảng thời gian này thì đều có biểu hiện bệnh như xù lông, giảm cân… Ngược lại, các chủng Salmonella từ thực phẩm thì chỉ có 2/10 chủng là có khả năng gây bệnh chuột nhưng với biểu hiện nhẹ, còn 8 chủng còn lại đều không có khả năng STT Chủng Mật độ gây nhiễm (CFU/ml) Biểu hiện bệnh Số lƣợng chuột chết Thời gian gây chết 1 Salmonella SP 1b 1,1 x 10 8 - 0/2 / 2 Salmonella SP 2a 6,6 x 10 10 - 0/2 / 3 Salmonella SP 1a 4,8 x 10 9 - 0/2 / 4 Salmonella SB 10 5,9 x 10 10 + 0/2 > 14 ngày 5 Salmonella SB11 2,5 x 10 8 - 0/2 / 6 Salmonella Ô13 1,5 x 10 9 - 0/2 / 7 Salmonella B34 2,4 x 10 11 - 0/2 / 8 Salmonella M14 1,5 x 10 8 - 0/2 / 9 Salmonella VTr11 5,7 x 10 7 - 0/2 / 10 Salmonella H51 4,8 x 10 8 + 0/2 > 14 ngày . Khả năng gây bệnh, gây chết chuột ở các chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm Kết quả ở Bảng 4.2 cho thấy, trong số các chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm thì chỉ có 2/10 chủng. năng gây bệnh gây chết chuột ở những chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm và từ thực phẩm. Các chủng Salmonella từ bệnh phẩm thì có độc lực cao như có thể gây bệnh, gây chết chuột sau. ch : (+ ): có biểu hiện bệnh, (- ): không biểu hiện bệnh 26 Kết quả ở Bảng 4.1 cho thấy hầu hết các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm đều có khả năng gây bệnh cho chuột. Nhưng chỉ có