1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC *************** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TÁC DỤNG CỦA MỘT VÀI HỢP CHẤT TỰ NHIÊN CHIẾT XUẤT TỪ THẢO MỘC TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH PHÁT SÁNG DO Vibrio harveyi TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2001 – 2005 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐÌNH NGHI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 2 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ********** ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TÁC DỤNG CỦA MỘT VÀI HỢP CHẤT TỰ NHIÊN CHIẾT XUẤT TỪ THẢO MỘC TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH PHÁT SÁNG DO Vibrio harveyi TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: TS. LÝ THỊ THANH LOAN NGUYỄN ĐÌNH NGHI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9/2005 iii LỜI CẢM TẠ Đầu tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô trong trường Đại học Nông Lâm đã trang bị cho tôi những kiến thức quý giá trong suốt bốn năm đại học giúp tôi có đủ khả năng để hoàn thành khóa luận này. Tiếp theo, tôi vô cùng cảm ơn cô Lý Thị Thanh Loan đã hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn chị Uyên cán bộ nghiên cứu trong phòng Vi khuẩn của Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II đã tận tình hướng dẫn tôi trong phần tiến hành các thí nghiệm. Đồng thời, tôi xin cảm ơn các anh chị trong phòng Vi khuẩn đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực hiện khoá luận. Sau cùng, tôi xin cảm ơn các bạn của lớp CNSH K27 đã chia xẻ cùng tôi những vui buồn trong thời gian học cũng như đã động viên, khuyến khích tôi rất nhiều trong thời gian thực hiện khóa luận. iv TÓM TẮT NGUYỄN ĐÌNH NGHI, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 7/2005. “ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TÁC DỤNG CỦA MỘT VÀI HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CHIẾT SUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH PHÁT SÁNG DO Vibrio harveyi TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon).” Hội đồng hướng dẫn: TS. LÝ THỊ THANH LOAN Đề tài được thực hiện trên đối tượng là vi khuẩn Vibrio harveyi, được xem là một mầm bệnh gây thiệt hại nghiêm trọng ở tôm. Chúng thường gây ra tỷ lệ chết cao đặc biệt là ở giai đoạn ấu trùng của tôm, có thể lên đến 100%. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng phương pháp làm kháng sinh đồ để sàng lọc, tìm ra một hợp chất thảo dược có hiệu quả chống lại V. harveyi trong phòng thí nghiệm, kết hợp với việc bố trí thí nghiệm để kiểm tra tính hiệu quả thực tế của các loại hợp chất thảo dược này ngay trên tôm nuôi. Những kết quả đạt được: - Sàng lọc và chọn ra được một hợp chất có hiệu quả chống lại V. harveyi tốt nhất trong bốn hợp chất thảo dược thử nghiệm (B 2 , L, L 2 và M) là M. - Hợp chất M cho hiệu quả tốt kháng được V. harveyi và giúp giảm tỷ lệ chết ở tôm khi cho tôm bệnh ăn thức ăn có trộn với hợp chất M ở nồng độ 500 và 750 mg/kg trọng lượng cơ thể/ngày. Quan sát kết quả bước đầu cho thấy hợp chất này không ảnh hưởng xấu tới sự phát triển của tôm. v ABSTRACT NGUYEN DINH NGHI, Nong Lam University, Ho Chi Minh City, July/2005. “EVALUATE THE EFFECT OF NATURAL SUBSTANCES EXTRACTED FROM HERBS IN CURING VIBRIOSIS (Vibrio harveyi) ON BLACK TIGER SHRIMP (Penaeus monodon). Guiding council: Dr. LY THI THANH LOAN The subject was studied on V. harveyi, has recognized as a devastating pathogen of shrimp. V. harveyi usually result in up to 100% mortality in larvae and postlarvae of Penaeus shrimp. In this research, A antibiogram method was used to screen herbal compounds possess antimicrobial activity against V. harveyi in vitro, combine with disposing experiments to test effectivity of herbal compounds on shrimp in vivo. Results: - M compound was found out a highest effective compound against V. harveyi among 4 herbal compounds (L, L 2 , M and B 2 compounds). - M herbal compound showed activity against V. harveyi and decreased mortality of shrimp when shrimp fed on diets supplemented with 500 and 750 mg/kg body weight/day of M compound. And this compound didn’t have any damaging effect to the growing of shrimp. vi MỤC LỤC TRANG TRANG TỰA LỜI CẢM TẠ iii TÓM TẮT iv ABSTRACT v MỤC LỤC vi, vii, viii DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix DANH SÁCH CÁC BẢNG x DANH SÁCH CÁC HÌNH xi Phần 1. MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề 1 1.2. Mục tiêu đề tài 2 1.3. Nội dung 2 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Tình hình nuôi tôm 3 2.1.1. Tình hình nuôi tôm trên thế giới 3 2.1.2. Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam 6 2.1.3. Tình hình và thiệt hại của bệnh do Vibrio gây ra 9 ở tôm trên thế giới và tại Việt Nam 2.2. Bệnh phát sáng do Vibrio harveyi gây ra trên tôm 10 2.2.1. Đặc điểm của Vibrio harveyi 10 2.2.2. Dấu hiệu bệnh 13 2.2.3. Điều kiện phát sinh bệnh 14 2.2.4. Khu vực phân bố bệnh 14 2.3. Các phương pháp chẩn đoán bệnh phát sáng trên tôm 15 2.3.1. Phương pháp vi khuẩn học 15 2.3.2. Phương pháp mô học 15 2.3.3. Phương pháp miễn dịch học 15 2.3.4. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) .…… 15 vii 2.4. Một số loài thảo dược có tiềm năng trong việc điều trị 16 bệnh phát sáng trên tôm 2.4.1. Nhục đậu khấu 17 2.4.2. Cây Neem 18 2.4.3. Hương nhu tía 18 2.4.4. Cây sả 19 2.4.5. Cây ổi 20 2.5. Các hướng ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc 21 ngăn chặn dịch bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm trong tương lai 2.5.1. Ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc chẩn 22 đoán phát hiện bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm 2.5.2. Ứng dụng của công nghệ sinh học trong việc tạo 22 ra các chế phẩm dùng trong ngăn chặn và điều trị bệnh phát sáng do Vibrio trên tôm Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Thời gian và địa điểm 26 3.1.1. Thời gian 26 3.1.2. Địa điểm 26 3.2. Vật liệu và đối tượng nghiên cứu 26 3.2.1. Vật liệu 26 3.2.2. Đối tượng nghiên cứu 26 3.2.3. Dụng cụ và hóa chất 26 3.2.3.1. Dụng cụ 26 3.2.3.2. Môi trường và hóa chất 27 3.3. Phương pháp tiến hành 27 3.3.1. Thử nghiệm trong phạm vi phòng thí nghiệm 27 3.3.1.1. Phân lập dòng thuần Vibrio harveyi 28 3.3.1.2. Phương pháp kháng sinh đồ 29 theo phương pháp Mc Farland 3.3.2. Thử nghiệm trong phòng ướt Wet-lab 30 3.3.2.1. Phương pháp kiểm tra các tính chất hoá 32 lý của nước nuôi viii 3.3.2.5. Tiến hành thu mẫu và kiểm tra vi khuẩn 33 3.3.3. Phương pháp phân tích số liệu thống kê 34 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thử nghiệm trong phòng thí nghiệm 36 4.1.1 Kết quả phân lập dòng thuần Vibrio harveyi 36 4.1.2. Kết quả thí nghiệm kháng sinh đồ 37 4.1.3. Kết quả thử nghiệm hợp chất M 37 4.2. Kết quả thử nghiệm trong phòng Wet-lab 40 4.2.1. Kết quả kiểm tra tính chất hoá lý của nước nuôi 40 4.2.2. Kết quả bố trí thí nghiệm 40 Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận 43 5.2. Đề nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC 50 ix DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT BHIA: Brain Heart Infusion Agar COD: Chemical Oxygen Demand Ctv: cộng tác viên DMSO: Dimethyl Sulphoxide DNA: Deoxyribonucleic acid DO: Dissolved Oxygen ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assays FAO: Food and Agriculture Organization MBV: Penaeus monodon Baculovirus MHA: Mueller Hinton Agar O/F: Oxidation/Fermentation test PCR: Polymerase Chain Reaction TCBS: Thiosulfate Citrate Bile salts Sucrose agar TSB: Tryptone Soya Broth VP: Voges Proskauer WSSV: White Spot Syndrome Virus YHV: Yellow Head Virus LD: Lethal Dose x DANH SÁCH CÁC BẢNG TRANG Bảng 2.1. Đặc điểm sinh hóa học của V. harveyi 12 Bảng 3.1. Thành phần dung dịch của các ống nghiệm trong thí 29 nghiệm Mc Farland Bảng 4.1. Kết quả các phản ứng sinh hoá định danh Vibrio harveyi 36 Bảng 4.2. Kết quả tác dụng của các hợp chất ở các khoảng thời gian 37 Bảng 4.3. So sánh hiệu quả của hợp chất M qua các khoảng thời 38 gian ở từng nồng độ thử nghiệm Bảng 4.4. So sánh hiệu quả giữa các nồng độ sau các khoảng thời 39 gian đối với V. harveyi Bảng 4.5. Kết quả kiểm tra các tính chất hóa lý của nước nuôi tôm 40 Bảng 4.6. Tỷ lệ tôm chết (%) ở các lô thử nghiệm 41 Bảng 4.7. Kết quả kiểm tra mẫu nước và mẫu tôm của các bể thí 42 nghiệm [...]... TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH PHÁT SÁNG DO Vibrio harveyi TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon). ” 1. 2 Mục tiêu đề tài Đánh giá hiệu quả tác dụng của hợp chất chiết xuất từ thảo dược trong việc điều trị bệnh nhiễm khuẩn do Vibrio harveyi gây ra trên tôm sú (Penaeus monodon) 1. 3 Nội dung - Phân lập dòng V harveyi thuần trên mẫu tôm có dấu hiệu nhiễm khuẩn - Thử nghiệm tác dụng của các hợp chất chiết suất từ thảo dược đối... ra một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược có nhiều tiềm năng trong việc điều trị bệnh phát sáng trên tôm Bước tiếp theo trong nghiên cứu là đánh giá hiệu quả tác dụng của hợp chất đó trong việc điều trị trước khi đưa ra ứng dụng thực tế trong sản xuất Đây cũng chính là nội dung thực hiện đề tài khóa luận, “ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TÁC DỤNG CỦA MỘT VÀI HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN CHIẾT SUẤT TỪ THẢO DƯỢC TRONG ĐIỀU... chặn bệnh phát sáng đã được tiến hành, trong đó người ta đã tìm ra được nhiều chất có nguồn gốc sinh học hứa hẹn nhiều tiềm năng trong việc điều trị bệnh phát sáng trên tôm Tuy nhiên các hợp chất này vẫn đang còn trong giai đoạn nghiên cứu trong phòng thí nghiệm Để có thể đưa vào ứng dụng trong sản xuất cần phải tiến hành nhiều thí nghiệm kiểm tra hiệu quả của chúng trong việc điều trị bệnh trên tôm. .. là 14 /30 (46,67%), sau đó đến V parahaemolyticus 6/30, chiếm 20% Ngoài ra còn gặp V vulnificus 3/30 (10 %), đây cũng chính là những loài vi khuẩn đã được nhiều tài liệu thông báo là tác nhân gây bệnh phát sáng ở tôm sú ấu trùng (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 2002) 2.2 Bệnh phát sáng do Vibrio harveyi gây ra trên tôm 2.2 .1 Đặc điểm của Vibrio harveyi Nhóm Vibrio phát sáng là 1 phần của hệ vi sinh vật tự nhiên. .. CÁC HÌNH TRANG Hình 2 .1 Khuẩn lạc V harveyi phát sáng trong tối 11 Hình 2.2 Lá và hạt cây Neem 18 Hình 2.3 Cây sả 19 Hình 2.4 Cành và quả ổi 20 Hình 4 .1 Kết quả kháng sinh đồ của hợp chất M 40 xi 1 Phần 1 MỞ ĐẦU 1. 1 Đặt vấn đề Nghề nuôi tôm trên thế giới đã có từ rất lâu nhưng nghề nuôi tôm hiện đại chỉ thực sự ra đời kể từ những năm 19 30, khi các nhà khoa... trọng cho nghề nuôi tôm Một trong các bệnh đáng quan tâm hiện nay đó là bệnh do vi khuẩn phát sáng thuộc nhóm Vibrio, trong đó đáng chú ý là Vibrio harveyi Chúng có thể gây bệnh qua tất cả các giai đoạn của tôm nuôi và được xem là nguồn gốc gây thiệt hại nghiêm trọng trên tôm giống ở các trại sản xuất Nhiều trường hợp nhiễm bệnh đã được phát hiện ở Australia, Ecuador, Ấn Độ, Indonesia, Philippines,... bờ, được tìm thấy trên bề mặt và cả bên trong ruột của các động vật sống ở biển V harveyi và V splendidus là 2 loài vi khuẩn phân lập được từ các mẫu tôm ấu trùng và hậu ấu trùng bị bệnh phát sáng Tuy nhiên V harveyi mới được xem là loài vi khuẩn chủ yếu gây bệnh phát sáng trên tôm (Lý Thị Thanh Loan, 19 99) V harveyi thuộc giống Vibrio, họ Vibrionaceae Đặc điểm chung của V harveyi l : vi khuẩn gram âm,... 0,3 – 0,5 x 1, 4 – 2,6 µm, gây ra hiện tượng phát sáng sinh học trên tôm trong môi trường biển V harveyi không có mối quan hệ cộng sinh với bất kỳ sinh vật biển nào, nó di chuyển bằng roi (Sung và ctv, 20 01) 11 Quan sát trong bóng tối các đĩa cấy V harveyi trên môi trường BHIA thấy khuẩn lạc phát ra các ánh sáng xanh nhạt Hình 2 .1 Khuẩn lạc V harveyi phát sáng trong tối (Zhang, 20 01) V harveyi có khả... của các hợp chất chiết suất từ thảo dược đối với vi khuẩn V harveyi bằng phương pháp kháng sinh đồ - Bố trí thí nghiệm đánh giá hiệu quả tác dụng của hợp chất thử nghiệm đối với V harveyi gây bệnh trên tôm 3 Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 .1 Tình hình nuôi tôm 2 .1. 1 Tình hình nuôi tôm trên thế giới Lịch sử nuôi cá và các loại thủy sản đã có từ rất lâu Những tài liệu sớm nhất ghi chép về hoạt động nuôi... tạo môi trường lý tưởng cho V harveyi và gây ra tỷ lệ chết cao có thể lên đến 10 0% (Fraser, 2005) Hiện nay có nhiều cách để ngăn chặn bệnh phát sáng trên tôm như sử dụng kháng sinh, dùng hoá chất để xử lý ao nuôi và sử dụng chế phẩm sinh học Tuy nhiên 2 do các mặt hạn chế và hiệu quả sử dụng của chúng không cao nên để giảm thiệt hại của bệnh phát sáng, người nuôi vẫn sử dụng các biện pháp phòng ngừa . ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ TÁC DỤNG CỦA MỘT VÀI HỢP CHẤT TỰ NHIÊN CHIẾT XUẤT TỪ THẢO MỘC TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH PHÁT SÁNG DO Vibrio harveyi TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) Giáo viên. THẢO DƯỢC TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH PHÁT SÁNG DO Vibrio harveyi TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon). ” 1. 2. Mục tiêu đề tài Đánh giá hiệu quả tác dụng của hợp chất chiết xuất từ thảo dược trong việc điều. ra một số hợp chất chiết xuất từ thảo dược có nhiều tiềm năng trong việc điều trị bệnh phát sáng trên tôm. Bước tiếp theo trong nghiên cứu là đánh giá hiệu quả tác dụng của hợp chất đó trong