BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. NGUYỄN ANH KHOA PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Tp. HCM, 8/2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNHCẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Tp. HCM, 8/2006 Sinh viên thực hiện NGUYỄN ANH KHOA Niên khóa: 2002 - 2006 Giáo viên hƣớng dẫn PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING NONG LAM UNIVERSITY, HCMC FACULTY OF BIOTECHNOLOGY SURVEYING SUGARCANE MOSAIC DISEASE BY ELISA AND THE FIRST STEP TO RESEARCH AND DETECT RATOON STUNTING DISEASE BY PCR Graduation thesis Major: Biotechnology HCMC, 9/2006 Professor BUI CACH TUYEN Student NGUYEN ANH KHOA Term: 2002- 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2002 – 2006 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ANH KHOA Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 / 2006 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ….  …. PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 9 / 2006 Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ANH KHOA Giáo viên hƣớng dẫn: PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN iii LỜI CẢM ƠN  Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:  PGS. TS. Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn tất khóa luận tốt nghiệp này.  TS. Bùi Minh Trí đã chỉ bảo cho tôi nhiều kiến thức trong thời gian thực hiện đề tài.  ThS. Nguyễn Văn Cƣờng cùng các anh chị trong Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa Sinh – trƣờng Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.  ThS. Hà Đình Tuấn, Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng Bến Cát đã giúp đỡ tôi trong quá trình thu mẫu tại đây.  Xin chân thành cảm ơn đến quí Thầy Cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã nhiệt tình chỉ dạy cũng nhƣ đóng góp ý kiến chân thành cho tôi trong suốt thời gian làm khóa luận này.  Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 28 đã luôn ủng hộ, động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này. Sinh viên thực hiện Nguyễn Anh Khoa iv TÓM TẮT NGUYỄN ANH KHOA, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8 năm 2006. “PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KĨ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KĨ THUẬT PCR” Giáo viên hƣớng dẫn: PGS. TS. Bùi Cách Tuyến. Đề tài khảo sát sự nhiễm bệnh khảm lá mía (Sugarcane Mosaic) và cằn mía gốc (Ratoon stunting disease) đƣợc thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng (TTNCMĐ) tỉnh Bình Dƣơng và nông trƣờng Thọ Vực tỉnh Đồng Nai. Đây là nghiên cứu nhằm góp phần thống kê tình hình nhiễm bệnh khảm lá mía và cằn mía gốc trên một số giống mía sản xuất và nhập nội tại 2 vùng trồng mía này. Đặc biệt đề tài là bƣớc đi đầu tiên trong nghiên cứu, phát hiện bệnh cằn mía gốc do vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) gây ra trên cây mía ở nƣớc ta bằng kỹ thuật PCR. Nghiên cứu góp phần quan trọng trong công tác tuyển chọn giống sạch bệnh cũng nhƣ công tác phòng chống và kiểm soát dịch bệnh trên cây có mía hiệu quả hơn. Kết quả đạt đƣợc - Các giống mía sản xuất và nhập nội đƣợc khảo sát đều không bị nhiễm bệnh khảm lá mía thông qua kết quả chẩn đoán bằng ELISA. - Phát hiện đƣợc bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và nhuộm mô mẫu. Kết quả: tỉ lệ mô khoẻ mạnh trên các giống mía khảo sát tại TTNCMĐ là 70,5%, tại nông trƣờng Thọ vực là 75,18%. - Xác định sơ bộ các nhân tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn Lxx. - Đề xuất phƣơng pháp nuôi cấy vi khuẩn Lxx và hoàn thiện quy trình phát hiện vi khuẩn Lxx bằng kỹ thuật PCR. v SUMMARY This is Nguyen Anh Khoa studying at Nong Lam University and finishing the thesis on 9 th 2006. The thesis entiled “Surveying sugarcane mosaic disease by ELISA and the first step to research and detect ratoon stunting disease by PCR ”. Surveying sugarcane mosaic disease and ratoon stunting disease (RSD) on some sugarcane species produced and imported at sugarcane researching center at Binh Duong and at Tho Vuc farm at Dong Nai. That is basic to contribute statistics to situation of sugarcane mosaic disease at the areas. Specially, the thesis is the first step to research and detect RSD caused by bacteria Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) on sugarcane in our country. The researching is an important contribution to select pathogenic free species, to prevent and to control epidemic diseases on sugarcane effectively. The results of this research are as follows: - DAS-ELISA result data show that all investigatived sugarcane species produced and imported at sugarcane researching center at Binh Duong, is not found SCMV. - Detecting Lxx by microscopy and STM stainning. Results: 70,5% of phloem vessel do not infected by Lxx on sugarcane species at Binh Duong provine and 75,18% phloem of vessel do not infected by Lxx on sugarcane at Tho Vuc farm. - Preliminary defining factors effecting the Lxx bacteria culturing process. - Proposing the method to culture Lxx bacteria and to perfect Lxx bacteria detecting process by PCR. vi MỤC LỤC Nội dung Trang LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT iv MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ix DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ HÌNH CHỤP x DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi Phần 1. MỞ ĐẦU 1 1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu 1 1.2. Mục tiêu nghiên cứu 2 1.3. Giới hạn đề tài 2 Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Sơ lƣợc về cây mía 3 2.1.1. Lịch sử phát hiện 3 2.1.2. Phân loại 3 2.1.3. Nguồn gốc và phân bố 3 2.1.4. Nhân giống 4 2.1.5. Sản lƣợng 4 2.1.6. Chế biến và sử dụng 5 2.2. Bệnh trên cây mía 5 2.3. Bệnh khảm lá mía 7 2.3.1. Nguồn gốc và phân bố 7 2.3.2. Triệu chứng 7 2.3.3. Tác nhân gây bệnh 8 2.3.4. Các chủng virus gây bệnh khảm lá mía 9 2.3.5. Qui luật phát sinh phát triển bệnh 9 2.3.6. Tầm quan trọng kinh tế 9 2.3.7. Phòng trừ 10 2.3.8. Các phƣơng pháp xác định bệnh khảm lá mía 10 vii 2.3.8.1. Dựa vào trạng thái dấu vết bệnh 10 2.3.8.2. Phƣơng pháp chẩn đoán dùng kính hiển vi 10 2.3.8.3. Phƣơng pháp ELISA (Enzym-link immunosorbent assay) 10 2.3.8.4. Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 12 2.4. Bệnh cằn mía gốc 14 2.4.1. Nguồn gốc và phân bố 14 2.4.2. Triệu chứng 14 2.4.2.1. Triệu chứng bên ngoài 14 2.4.2.2. Triệu chứng bên trong cây 15 2.4.3. Tác nhân gây bệnh 16 2.4.4. Quy luật phát sinh phát triển bệnh 16 2.4.5. Tầm quan trọng kinh tế 17 2.4.6. Kiểm soát bệnh 17 2.4.7. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cằn mía gốc trên cây mía 17 2.4.7.1. Phƣơng pháp chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi 17 2.4.7.2. Phƣơng pháp huyết thanh học 17 2.4.7.3. Phƣơng pháp nhuộm STM (dựa vào đáp ứng của kí chủ) 19 2.4.7.4. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử 19 2.5. Tình hình nghiên cứu về bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc 19 2.5.1. Trên thế giới 19 2.5.2. Trong nƣớc 20 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1. Nội dung nghiên cứu 22 3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22 3.3. Vật liệu nghiên cứu 22 3.3.1. Các giống mía nghiên cứu 22 3.3.2. Virus gây bệnh 22 3.3.3. Vi khuẩn gây bệnh 22 3.3.4. Hóa chất thí nghiệm 23 3.3.5. Thiết bị và dụng cụ 23 3.4. Phƣơng pháp tiến hành 23 3.4.1. Phƣơng pháp điều tra lấy mẫu 23 [...]... pyrocarbonate dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate p-NPP: p - nitrophenol phosphate PVP: Polyvinylpyrrolidone BSA: Bovine serum albumin PBS: Dung dch cha PVP, BSA, Tween20 v sodium azide RNA: Ribonucleic acid bp: Base pair EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid mRNA: Messenger RNA PCR: Polymerase chain reaction RNase: Ribonuclease SCMV: Sugarcane Mosaic Virus RSD: Ratoon stunting disease Lxx: Leifsonia... PL9 ,10 Vt i mu bờn trong thõn xvii xi DANH SCH CC CH VIT TT ELISA: enzym linked immunosorbent assay DAS -ELISA: double antibody sandwich-enzyme linked immunosorbent assay TTNCM: Trung tõm nghiờn cu mớa ng RT -PCR: Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction cDNA: Complementary Deoxyribonucleotide acid ctv: Cng tỏc viờn NCM: Mng nitrocellulose ddNTP: Dideoxyribonucleoside triphosphate DEPC:... 35 Bng 4.3 So sỏnh kt qu chn oỏn ca hai phng phỏp: dựng kớnh hin vi v nhum STM 36 S 2 .1 Tin trỡnh thc hin ELISA Sandwich trc tip 11 S 2.2 S tng quỏt ca k thut RT - PCR 13 S 3 .1 S iu tra 24 S 3.2 S tỏch chit mu lỏ cho ELISA 25 S 3.3 S b trớ ging trờn a ELISA 25 x DANH SCH CC HèNH HèNH TRANG Hỡnh 2 .1 Cõy mớa 3 Hỡnh 2.2 Bnh hi ph bin trờn... PCR phỏt hin vi khun Lxx 37 Phn 5 KT LUN V NGH 41 5 .1 Kt lun 41 5.2 ngh 41 TI LIU THAM KHO 43 PH LC xii ix DANH SCH CC BNG V S BNG TRANG Bng 1. 1 Thng kờ v nhúm tỏc nhõn gõy bnh v s lng bnh 6 Bng 3 .1 Thnh phn cỏc cht trong phn ng PCR v chu k nhit 30 Bng 4 .1 Kt qu chn oỏn bnh cn mớa gc bng phng phỏp quan sỏt di kớnh hin vi... disease) v bnh sc (Red stripe) Hỡnh 2.2 Bnh hi ph bin trờn mớa cõy mớa (Philippe Rott, 2000) Chỳ thớch: A: Bnh khm lỏ mớa; B: Bnh vng gõn lỏ (YLSD); C: Bnh thi ; D: Bnh than (Smut); E: Bnh gụm (Gumming disease); F: Bnh cn mớa gc 7 2.3 Bnh khm lỏ mớa 2.3 .1 Ngun gc v phõn b Bnh khm c cụng nhn u tiờn vo nm 18 92, c xem nh l mt c tớnh bt thng trờn mớa bi Musschenbrock Java ễng ó t tờn cho nú l bnh m sc vng... 2 .1) Cõy mớa n Persia vo th k th 6 v ngi Rp ó mang cõy mớa n Ai Cp vo nm 6 41 sau Cụng Nguyờn trong quỏ trỡnh chinh phc cỏc min t ca h Cõy mớa cng c m rng phõn b bng cỏch ny n Syria, Cyprus, Crete, v n Tõy Ban Nha vo khong nhng nm 714 sau cụng Hỡnh 2 .1 Cõy mớa nguyờn Vo nhng nm 11 50 ngnh cụng nghip mớa ng (Ngun: Tõy Ban Nha rt phỏt trin vi khong 30000 ha mớa c Rott, 2000) Philipe trng Vo khong nm 14 20... ng i mu trong DAS- ELISA 12 Hỡnh 2.6 Lxx gõy nhng vt chuyn mu thõn mớa 15 Hỡnh 2.7 Vi khun Leifsonia xyli subsp xyli di kớnh hin vi in t (x30.000 ln) (K E Damann, 2002) 16 Hỡnh 4 .1 Kt qu chn oỏn SCMV qua quan sỏt s i mu trờn a ELISA 32 Hỡnh 4.2 Vi khun Lxx di kớnh hin vi ( phúng i 10 00 ln) 34 Hỡnh 4.3 Mu thõn nhum safranin di kớnh hin vi (x 40 ln (A) v x 10 0 ln (B)) ... virus trong t bo cõy cú dng hỡnh tr Ngng pha loóng l 10 -2 - 10 -5 Nhng phõn t virus c sp xp ngu nhiờn trong t bo cht, trong khi nhng siờu th vựi vi lp mng mng xut hin gia cht nguyờn sinh v thnh t bo Nhiu c tớnh ca virus SCMV cng c nghiờn cu H s lng ng l 17 6 5S v mt l lng l 1, 3327 ca SCMV-D, v giỏ tr 14 8 2 17 0 5S tng ng vi 1, 285 1, 34 21 ca SCMV J 9 2.3.4 Cỏc chng virus gõy bnh khm lỏ mớa Cú nhiu... Messenger RNA PCR: Polymerase chain reaction RNase: Ribonuclease SCMV: Sugarcane Mosaic Virus RSD: Ratoon stunting disease Lxx: Leifsonia xyli subsp xyli STM: Stainning transpiration TTPT: Trung tõm phõn tớch Taq: Thermus aquaticus 1 Phn 1 M U 1. 1 C s tin hnh v ý ngha ca nghiờn cu Hin nay cõy mớa (Saccharum spp.) ang l mt trong nhng loi cõy cụng nghip cho hiu qu kinh t cao nc ta cng nh nhiu nc trờn... LUN 31 4 .1 Phỏt hin bnh khm lỏ mớa bng k thut ELISA . 31 4.2 Nghiờn cu phỏt hin bnh cn mớa gc bng k thut PCR 32 4.2 .1 iu tra s nhim bnh cn mớa gc da vo triu chng Phỏt hin vi khun Lxx bng phng phỏp quan sỏt di kớnh hin vi v phng phỏp nhum STM 32 4.2.2 Kho sỏt mt s yu t nh hng n quỏ trỡnh nuụi cy vi khun Lxx v nhn dng khun lc ca nú trờn mụi trng nuụi cy .36 4.2.3 PCR phỏt hin . VÀ THẢO LUẬN 31 4 .1. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA 31 4.2. Nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR 32 4.2 .1. Điều tra sự nhiễm bệnh cằn mía gốc dựa vào triệu. …. PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNHCẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR Luận văn kỹ sƣ Chuyên ngành: Công nghệ sinh học. Tuyến và sự hỗ trợ từ TTNCMĐ tỉnh Bình Dƣơng chúng tôi đã thực hiện đề tài Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA và bƣớc đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR .