27 Tôm mẹ 10 Trại Thực Nghiệm TĐ Tôm mẹ 8 ĐBSCL PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR PHÁT HIỆN MrNV, XSV TỪ MẪU TÔM BỆNH ĐUÔI TRẮNG ĐƢỢC CUNG CẤP TỪ ẤN ĐỘ Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR phát hiện hai loài virus MrNV, XSV trên mẫu tôm thịt đƣợc cung cấp từ Ấn Độ. Chúng tôi tiến hành thực hiện đồng thời mẫu chứng âm (đầy đủ các thành phần trừ RNA bản mẫu) và 1 mẫu tôm bình thƣờng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp mô học, để xác định mức độ đặc hiệu của mồi và kiểm tra mức độ ngoại nhiễm khi tiến hành trong phòng thí nghiệm của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II. Sau 3 lần lặp lại thí nghiệm, kết quả tƣơng đối giống nhau cho mẫu chứng dƣơng, không có sự thay đổi. Hình 4.1 là hình đại diện cho lần lặp lại thứ 3. Hình 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm khuếch đại từ mẫu tôm càng xanh nhiễm MrNV, XSV. Giếng 1: mẫu chứng âm. Giếng 2: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm bình thƣờng không nhiễm XSV. Giếng 3: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm nhiễm XSV. MrNV XSV 500 bp 681 bp 1 2 3 M 4 5 5 6 5 6 28 Giếng 4: sản phẩm từ RT - PCR từ mẫu tôm bệnh nhiễm MrNV. Giếng 5: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm bình thƣờng không nhiễm MrNV. Giếng 6: mẫu chứng âm. Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III. Mẫu tôm thịt bệnh đƣợc cung cấp từ Ấn Độ đƣợc tách chiết bằng bộ Kit có 1 vạch sản phẩm có kích thƣớc 500 bp là XSV (giếng 3) và 1 vạch sản phẩm có kích thƣớc 681 bp là MrNV (giếng 4), các kết quả này đúng với Widada, Sahul Hameed và cộng sự. Để kiểm tra tính đặc hiệu của mồi chúng tôi thực hiện một mẫu tôm bình thƣờng. RNA của tôm không nhiễm MrNV, XSV (giếng 2, 5). Ở các giếng (2, 5) không thấy có sản phẩm khuếch đại chứng tỏ mồi sử dụng trong phản ứng Single - Step RT - PCR rất đặc hiệu. Để kiểm tra vấn đề ngoại nhiễm chúng tôi tiến hành làm hai mẫu chứng âm (giếng 1, 6), mẫu này có đầy đủ các thành phần của phản ứng chỉ trừ RNA bản mẫu. Mẫu này không cho sản phẩm khuếch đại nào chứng tỏ phản ứng Single - Step RT - PCR mà chúng tôi thực hiện không bị ngoại nhiễm. Kết luận: từ kết quả hình 4.1 cho thấy qui trình mà chúng tôi ứng dụng cho kết quả tốt phù hợp với những nghiên cứu từ trƣớc. 4.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN CỦA QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR 4.2.1. Kết quả so sánh hai qui trình tách chiết Trong phản ứng RT - PCR công đoạn tách chiết RNA đƣợc xem là một trong những bƣớc quyết định. Do đó chúng tôi tiến hành hai phƣơng pháp tách chiết khác nhau trên 1 mẫu tôm thịt bệnh trắng đuôi đƣợc cung cấp từ Ấn Độ theo bộ Kit và theo phƣơng pháp Trizol để có thể đánh giá đƣợc hiệu quả của hai phƣơng pháp tách chiết này. Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần. 29 Hình 4.2: Kết quả điện di các sản phẩm khuếch đại RT-PCR từ mẫu chứng dƣơng đƣợc tách chiết bộ Kit và Trizol. Phần A, C: sản phẩm khuếch đại RNA tách chiết bằng bộ Kit. Phần B, D: sản phẩm khuếch đại RNA tách chiết bằng Trizol. Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm nhiễm MrNV. Giếng 8, 9, 10, 11, 12, 13: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm nhiễm XSV. Giếng 7, 14: mẫu chứng âm. Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III. Bảng 4.1: Kết quả điện di các sản phẩm RT - PCR đƣợc tách chiết bộ Kit và Trizol Tách chiết Virus Lần 1 Lần 2 Lần 3 Kết quả Bộ Kit MrNV giếng 1 giếng 2 giếng 3 ++++ XSV giếng 8 giếng 9 giếng 10 ++ Trizol MrNV giếng 4 giếng 5 giếng 6 +++ XSV giếng 11 giếng 12 giếng 13 + (+): biểu hiện mức độ sáng của sản phẩm. Qua 3 lần thử nghiệm trên mẫu chứng dƣơng, chúng tôi nhận thấy vạch sản phẩm từ RNA tách chiết bằng bộ Kit có độ sáng đậm hơn vạch sản phẩm của RNA tách chiết theo phƣơng pháp Trizol. Nhìn chung cả hai qui trình tách chiết đều đạt yêu cầu. Tuy nhiên mỗi phƣơng pháp có ƣu và nhƣợc điểm riêng: MrNV 1 2 3 M 4 5 6 7 XSV 8 9 10 M 11 12 13 14 A B C D 30  Phƣơng pháp Trizol là phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số phƣơng pháp này đơn giản ít tốn thời gian, hoá chất có thể tƣ pha. Lƣợng RNA thu đƣợc dễ bị lẫn phenol và các tạp chất khác trong quá trình tách chiết nếu thao tác không cẩn thận, phƣơng pháp Trizol sử dụng phenol và chloroform, hai chất này rất độc đối với ngƣời tách chiết. Hoá chất Trizol có thể tự pha nên có thể sai sót trong quá trình pha, nhƣ việc hút phenol không đúng cách, không đủ thể tích, cân không đủ lƣợng, dễ nhiễm RNAase, các vi sinh vật. Các yếu tố đó ảnh hƣởng lớn đến quá trình tách chiết.  Phƣơng pháp tách chiết theo bộ Kit đòi hỏi theo điều kiện tách chiết của bộ Kit, hoá chất sử dụng trong bộ Kit tuân theo qui trình sản xuất nghiêm ngặt, không nhiễm RNAase, các vi sinh vật nên lƣợng RNA thu đƣợc sẽ rất nhiều và không gãy vụn, không có sử dụng phenol và chloroform nên không độc đối với ngƣời tách chiết. Trong quá trình tách chiết không bị lẫn tạp chất nhiều. Tuy nhiên tách chiết phải ủ trên đá trong suốt quá trình tách chiết. Nếu thực hiện trong thời gian dài thì lƣợng đá phải đƣợc bổ sung, công việc này làm ngắt quảng quá trình tách chiết và làm mất thời gian. Nhƣ vậy, qua hai quá trình tách chiết từ mẫu tôm bệnh đƣợc cung cấp từ Ấn Độ. Chúng tôi nhận thấy rằng trong dịch tách chiết của mẫu tôm thịt bị nhiễm bệnh luôn tồn tại hai virus MrNV và XSV. 4.2.2. Kết quả khảo sát nồng độ mồi Tiến hành pha loãng mồi từ ống gốc có nồng độ là 30 mol theo dãy sau: 10 mol, 15 mol, 20 mol, 25 mol, 30 mol. Sau 3 lần lặp lại thí nghiệm, kết quả tƣơng đối giống nhau, không có sự thay đổi đáng kể. Hình 4.3 là hình đại diện cho lần lặp lại thứ 3. Tiến hành 10 phản ứng Single - Step RT - PCR trên bản mẫu RNA của mẫu chứng dƣơng ở các nồng độ pha loãng khác nhau với kết quả nhƣ sau: 31 Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm RT - PCR từ mẫu chứng dƣơng ở các nồng độ mồi khác nhau Hình A: dãy khảo sát nồng độ của MrNV. Hình B: dãy khảo sát nồng độ của XSV. (-): mẫu chứng âm. Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III. Ở Hình A, chúng tôi nhận thấy ở nồng độ 20 mol vạch sản phẩm có độ sáng rõ và khá đậm và gần tƣơng đồng với nồng độ 25 mol, ở nồng độ 30 mol các vạch sản phẩm này có hiện tƣợng smear khá nhiều chứng tỏ lƣợng mồi thừa cho nên để tiết kiệm mồi mà có thể phát hiện đƣợc MrNV nên chúng tôi chọn ở nồng độ 20 mol. Ở Hình B, nồng độ 20 mol có vạch sản phẩm gần bằng nồng 25 mol nhƣng yếu hơn 30 mol. Vậy để tiết kiệm lƣợng mồi mà vẫn có thể phát hiện đƣợc XSV nên chúng tôi chọn nồng độ 20 mol. 4.2.3. Kết quả khảo sát nhiệt lai của mồi Trƣớc khi tiến hành khảo sát hai dãy nhiệt độ của MrNV, XSV chúng tôi lựa chọn ra mẫu chứng dƣơng đã tách chiết theo bộ Kit để khảo sát. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau: 10 15 20 25 30 M 9 10 10 15 20 25 30 M 11 12 A B 32 Hình 4.4: Kết quả điện di khảo sát nhiệt lai của mồi trên hai virus MrNV, XSV. Phần A: dãy khảo sát nhiệt độ của XSV. Phần B: dãy khảo sát nhiệt độ của MrNV. (-): mẫu chứng âm. (+): biểu hiện mức độ sáng của sản phẩm. Để dễ đánh giá mức độ sáng của sản phẩm, chúng tôi dùng ký hiệu dấu cộng, quan sát từ bản điện di ta thấy tín hiệu sản phẩm tối ƣu của MrNV ở nhiệt độ 55 0 C có độ sáng cao hơn tín hiệu sản phẩm tối ƣu của XSV ở nhiệt độ 55 0 C , nên chúng tôi cho ký hiệu năm dấu cộng để biểu hiện mức độ sáng tối ƣu của MrNV và bốn dấu cộng để biểu hiện mức độ sáng tối ƣu của XSV. Cứ lần lƣợt nhƣ thế, tùy theo mức độ sáng của sản phẩm mà ta ký hiệu dấu cộng nhiều hay ít. Ở đây chúng tôi chỉ dựa vào độ sáng tƣơng đồng để ký hiệu theo bảng trên. Dựa vào kết quả khảo sát dãy nhiệt độ của MrNV, chúng tôi nhận thấy không có sự thay đổi lớn về tín hiệu sáng của sản phẩm, từ nhiệt độ 54 0 C -> 58 0 C, ngoài nhiệt độ 55 0 C là tối ƣu nhất, thì thấy ở nhiệt độ 56 0 C là sáng nhất so với các nhiệt độ còn lại. Ngƣợc lại với dãy nhiệt độ của MrNV thì trong dãy nhiệt độ của XSV có sự thay đổi lớn về tín hiệu sáng của sản phẩm giữa các nhiệt độ, từ 54 0 C -> 58 0 C, ngoài nhiệt độ Nhiệt độ 54 0 C 55 0 C 56 0 C 57 0 C 58 0 C Tín hiệu sản phẩm (MrNV) ++ +++++ +++ ++ ++ Tín hiệu sản phẩm (XSV) ++ ++++ + + +++ 54 0 55 0 56 0 57 0 58 0 M 54 0 55 0 56 0 57 0 58 0 XSV MrNV A B Bảng 4.2: Kết quả biểu hiện tín hiệu của sản phẩm của hai dãy nhiệt độ 33 55 0 C là tối ƣu nhất, thì thấy ở nhiệt độ 58 0 C sáng nhất so với các nhiệt độ còn lại. Từ những nhận xét đó, ta thấy từ nhiệt độ tối ƣu 55 0 C chỉ tăng 1 0 C (55 0 C - 56 0 C) trong dãy khảo sát của MrNV thì tín hiệu sản phẩm sáng nhất ở 56 0 C so với các nhiệt độ còn lại , trong khi dãy nhiệt độ của XSV tăng lên đến 3 0 C (55 0 C - 58 0 C) thì mới thấy ở 58 0 C là sáng nhất so với các nhiệt độ còn lại trừ nhiệt độ 55 0 C. Điều đó cho thấy hai dãy nhiệt độ của MrNV và XSV tỷ lệ nghịch nhau về tín hiệu sáng của sản phẩm. Điều này rất thuận lợi để phát triển kỹ thuật multiplex. So sánh hai dãy nhiệt độ của MrNV và XSV ở cặp nhiệt độ 56 0 C, ta thấy có sự tƣơng quan ngƣợc rõ rệt của hai tín hiệu sản phẩm ở nhiệt độ 56 0 C, tín hiệu sản phẩm của MrNV sáng hơn rất nhiều so tín hiệu sản phẩm của XSV. Ngoài trừ cặp nhiệt độ 55 0 C là tối ƣu nhất thì tất cả các cặp nhiệt độ đều không cho sản phẩm tối ƣu. Điều này rất thuận lợi để phát triển kỹ thuật multiplex. Nhƣ vậy, ở nhiệt độ 55 0 C theo qui trình Single - Step RT - PCR là tối ƣu nhất cho hai mồi MrNV và XSV. 4.3. KẾT QUẢ ỨNG DỤNG QUI TRÌNH SINGLE - STEP RT - PCR KHẢO SÁT ĐƢỢC PHÁT HIỆN MrNV, XSV TỪ NHỮNG MẪU TÔM THU THỰC ĐỊA. Dựa qui trình đã khảo sát đƣợc, chúng tôi tiến hành khảo sát 50 mẫu tôm càng xanh thu từ Trại Thực nghiệm Thủ Đức và các mẫu tôm mẹ thu tại ĐBSCL. Chúng tôi tiến hành khảo sát trên 8 mẫu tôm mẹ thu tại ĐBSCL và 1 mẫu tôm postlarvae nghi là bệnh trắng đuôi trƣớc. Kết quả ở hình 4.5. 34 4.5: Kết quả điện di phát hiện MrNV và XSV trên một số mẫu tôm càng xanh. Hình A: kết quả điện di phát hiện MrNV. Hình B: Kết quả điện di phát hiện XSV. Giếng 1, 2 , 4, 6, 7, 8: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm mẹ nhiễm MrNV và XSV. Giếng 9: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm postlarvae nhiễm MrNV và XSV. Giếng 5: âm tính. Giếng 3: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm mẹ nhiễm MrNV. Giếng 10: mẫu chứng dƣơng. Giếng 11: mẫu chứng âm (H 2 0 - DEPC). Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III. Kết quả thu đƣợc 7 mẫu tôm mẹ dƣơng tính thu ở ĐBSCL và 1 mẫu postlarvae dƣơng tính thu tại Trại Thực Nghiệm Thủ Đức. Trong đó có 5 mẫu bệnh rất nặng nhiễm đồng thời 2 virus MrNV và XSV ở các giếng 1, 2, 4, 7, 9. 2 mẫu bệnh ở mức độ trung bình nhiễm đồng thời MrNV và XSV ở các giếng 6, 8. 1 mẫu bệnh ở mức độ nhẹ nhiễm MrNV ở giếng 3. MrNV XSV 1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 10 11 A B 1 2 3 4 M 5 6 7 8 9 10 11 35 Tiếp tục khảo sát 40 mẫu tôm càng xanh còn lại. Các mẫu này không thấy có biểu hiện của bệnh trắng đuôi. 4.6: Kết quả điện di mẫu tôm mẹ thu tại Trại Thực Nghiệm Thủ Đức (hình đại diện 10 mẫu). Giếng :1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 âm tính. Giếng 11: mẫu chứng dƣơng. Giếng 12: mẫu chứng âm (H 2 0 - DEPC). Giếng M: Thang DNA X174 RF Hae III. Kết quả điện di 40 mẫu đều âm tính tuy nhiên trong 10 mẫu tôm mẹ mà chúng tôi thu không có mẫu tôm mẹ sinh ra đàn postlarvae bệnh trắng đuôi, nên chƣa thể xác định có sự lây bệnh từ tôm mẹ cho đàn ấu trùng hay không. Chúng tôi đã tiến hành phản ứng Single - Step PCR trên 50 mẫu tôm càng xanh ở các giai đoạn ấu trùng, tôm postlarvae, tôm mẹ có đƣợc kết quả nhƣ sau: 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 MrNV XSV 1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 12 36 Bản g 4.3: Kết quả thực hiện phản ứng RT- PCR trên 50 mẫu tôm càng xanh (+) : biểu hiện mức độ nhiễm bệnh trắng đuôi Ký hiệu mẫu Giai đoạn Địa điểm thu Kết quả MrNV XSV 1 -> 30 Ấu trùng Trại Thực Nghiệm TĐ - - 31 Postlarvae Trại Thực Nghiệm TĐ - - 32 Postlarvae Trại Thực Nghiệm TĐ +++ +++ 33-> 42 Tôm mẹ Trại Thực Nghiệm TĐ - - 43 Tôm mẹ ĐBSCL +++ +++ 44 Tôm mẹ ĐBSCL +++ +++ 45 Tôm mẹ ĐBSCL + - 46 Tôm mẹ ĐBSCL +++ +++ 47 Tôm mẹ ĐBSCL - - 48 Tôm mẹ ĐBSCL ++ + 49 Tôm mẹ ĐBSCL +++ + 50 Tôm mẹ ĐBSCL ++ ++ [...]... Freshwater Prawns 20 03, International Symposium, Cochin , 20 - 23 August 20 03 33 Sahul Hameed A.S , Yoganandhan K , Widada J.S and Bonami J.S , 2004a Studies on the occurrence of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus - like (XSV) associated with white tail disease (WTD) of Macrobrachium rosenbergii in India by RT - PCR detection Aquaculture 23 8: 127 - 133 34 Schaefer B.C , 1995... Symposium, Cochin, 20 - 23 August 20 03 31 Sahul Hameed A.S ,Yoganandhan K , Widada J.S , Bonami J.R , 2004 Experimental transmission and tissue tropsim of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus like-particles in Macrobrachium rosenbergii Dis Aquat Org 6 2: 191 - 196 32 Salin K.R and Nair C.M , 20 03 Emerging diseases of giant freshwater prawn in India - a potential threat to... Richard V , Bonami J.R , 20 03 Genome - based detection methods of Macrobrachium rosenbergii nodavirus, a pathogen of the giant freshwater prawn, Macrobrachium rosenbergii: dot - blot, in situ hybridization and RT PCR Jounal of Fish Diseases 26 : 5 83 - 590 47 Widada J.S , Richard V , Shi Z , Qian D and Bonami J.R , 2004 Dot lot hybridization and RT - PCR detection of extra small virus (XSV) associated with... nhiễm trên tôm càng xanh ở các giai đoạn khác nhau để xem sự hiện của virus xuất hiện nhiều ở giai đoạn nào  Cảm nhiễm trên tôm mẹ, sau lấy chân bơi tôm mẹ để kiểm tra bằng qui trình Single - Step RT - PCR để xác định có sự hiện diện của virus hay không, nếu tôm mẹ bị nhiễm, ta cho tôm mẹ đẻ ra đàn ấu trùng, sau đó kiểm tra đàn ấu trùng xem có sự hiện diện của virus hay không  Cần tách riêng hai virus. .. (XSV) associated with white tail disease of prawn Macrobrachium rosenbergii Disease of Aquatic Organism 5 8: 83 - 87 48 Yoganandhan K , Widada J.S , Bonami J.R and Sahul Hameed A.S , 2005 Simultaneous detection of Macrobrachium rosenbergii nodavirus and extra small virus by a single tube, one - step multiplex RT - PCR assay Journal of Fish Disease 2 8: 65 - 69 ... RT - PCR chúng tôi phát hiện tần xuất hiện diện MrNV và XSV trong những mẫu tôm bệnh trắng đuôi là rất cao Có thể khẳng định có sự hiện của hai virus gây bệnh trắng đuôi trên tôm càng đã xuất hiện tại Việt Nam 5.2 Tồn tại Chƣa xác định đƣợc có hay không sự lây nhiễm từ tôm mẹ bị bệnh trắng đuôi cho đàn ấu trùng Chƣa phát hiện đƣợc sự hiện diện của hai virus MrNV và XSV trên giai đoạn ấu trùng của tôm. .. , Cambournac I and Bonami J R , 20 03 Extra small virus- like particles (XSV) and nodavirus associated with whitish muscle disease in the giant fresh water prawn Macrobrachium rosenbergii Journal of Fish Disease 2 6:5 21 - 527 27 Roegge M.A , Rutle W.P and Guest W.C , 1979 Chemical control of Zoothamnium on larval Macrobrachium acanthurus In: Proceedings of the Second 43 28 Biennial Crustacean Health Workshop... Mariculture Society 8: 31 1 - 32 6 13 Arcier J.M., Herman F., Lightner D.V., Redman R , Mari J , Bonami, J.R , 1999 A viral disease associated with mortalities in the hatchery - reared postlarvae of the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii Dis Aquat Org 3 8: 177 - 181 14 Ban N , Larson S B and McPherson A (1995) Structural comparison of the plant satellite viruses Virology 21 4: 571 - 5 83 15 Bespalova... thành con giống tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii de man ở Đồng Bằng Sông Cửu Long BCKH 50 trang 4 Nguyễn Thị Thanh Thủy, 2000 Kỹ thuật sản xuất giống tôm càng xanh NXB Nông nghiệp 67 trang 5 Nguyễn Việt Thắng, 19 93 Một số đặc điểm sinh học và ứng dụng quy trình sản xuất giống tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii de man (1879) ở đồng bằng Nam Bộ Luận án PTS khoa học Nông Nghiệp.Trƣờng Đại... MrNV và XSV, sau đó thực hai lô thí nghiệm, một lô cảm nhiễm MrNV và một lô cảm nhiễm đồng thời cả hai virus MrNV và XSV, các thí nghiệm này đƣợc tiến hành trên tôm thịt Việc tiến hành thí nghiệm này với mục đích xác định vai trò của XSV nhƣ thế nào trong bệnh trắng đuôi  Cần có bƣớc giải trình tự của hai virus MrNV và XSV từ sản phẩm PCR để so sánh với mẫu chứng dƣơng từ Ấn Độ, để xác định hai virus . tropsim of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) and extra small virus like-particles in Macrobrachium rosenbergii. Dis Aquat Org 6 2: 191 - 196. 32 . Salin K.R . and Nair C.M ., 20 03. Emerging. nhiễm MrNV và XSV. Giếng 9: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm postlarvae nhiễm MrNV và XSV. Giếng 5: âm tính. Giếng 3: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm mẹ nhiễm MrNV. Giếng 1 0: mẫu chứng dƣơng khuếch đại từ mẫu tôm càng xanh nhiễm MrNV, XSV. Giếng 1: mẫu chứng âm. Giếng 2: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm bình thƣờng không nhiễm XSV. Giếng 3: sản phẩm RT - PCR từ mẫu tôm nhiễm XSV.