32 Ly trích bằng SDS, NaOH và sốc nhiệt Tinh sạch bằng Instagene Matrix Chuẩn bị hỗn hợp Real - time PCR Mẫu tôm Sơ đồ 3.1 Quy trình thực hiện Real - time PCR Chạy Real - time PCR i i Q Q Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ Phân tích kết quả 33 3.4.4. Thực hiện Non Stop Nested PCR 3.4.4.1. Chuẩn bị hỗn hợp để thực hiện phản ứng Non Stop PCR - Sử dụng micropipette hút 2 µl dung dịch tách chiết ADN của mẫu cần phân tích cho vào ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Non Stop Nested PCR để đạt thể tích phản ứng sau cùng là 50 l. - Đối chứng âm: cho 2 µl đối chứng âm vào ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Non Stop Nested PCR. - Đối chứng dương: cho 2 µl đối chứng dương vào ống eppendorf có chứa sẵn 48 µl hỗn hợp Non Stop Nested PCR. 3.4.4.2. Thiết lập chƣơng trình thực hiện Non Stop Nested PCR trên phần mềm của máy iCycler Chương trình luân nhiệt như sau: Chu kỳ 1: lặp lại 1 lần Bước 1: 40 o C 10 phút Chu kỳ 2: lặp lại 1 lần Bước 1: 95 o C 5 phút Chu kỳ 3: lặp lại 20 lần Bước 1: 94 o C 30 giây Bước 2: 58 o C 30 giây Bước 3: 72 o C 1 phút Chu kỳ 4: lặp lại 40 lần Bước 1: 94 o C 30 giây Bước 2: 51 o C 30 giây Bước 3: 72 o C 1 phút Chu kỳ 5: lặp lại 1 lần Bước 1: 72 o C 7 phút Giữ ở 4 o C cho đến khi phân tích 3.4.4.3. Chạy Non Stop Nested PCR Kiểm tra lại các thông số đã thiết lập trên máy iCycler, sau đó thực hiện Non Stop Nested PCR. 34 3.4.4.4. Điện di và phân tích kết quả Sản phẩm sau khi khuếch đại xong được điện di ngay trên thạch agarose 2% có chứa ethidium bromide. - Nguyên tắc của điện di: nguyên tắc này dựa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Các đại phân tử này tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Dựa vào kích thước các đoạn khuếch đại, các đoạn ADN khác nhau tách nhau ra sau khi điện di. Đoạn khuếch đại càng dài, băng thể hiện trên bản điện di càng gần vị trí giếng nạp mẫu. - Chuẩn bị gel agarose 2%: cho 4 gram agarose vào 200 ml dung dịch TBE 0,5X, đun chảy hoàn toàn, để nguội khoảng 60 0 C rồi thêm 10 µl ethidium bromide (10 mg/ ml), trộn đều, đổ khuôn, để gel nguội trong khoảng 30 phút. Sau đó đưa vào khay điện di có chứa dung dịch TBE 0,5X để tiến hành điện di. - Nạp (load) mẫu: chuẩn bị mẫu thử bằng cách cho 12 µl dung dịch nạp mẫu (loading buffer) (có glycerol và bromophenol blue) vào trong mỗi mẫu thử. Dùng micropipette cho 15 µl mẫu và 15 µl thang ADN chuẩn vào giếng theo thứ tự. - Điện di trên gel agarose: điện di trong thời gian 30 phút ở 100 V và 50 mA. Sau khi điện di hoàn tất (khi thấy vệt màu xanh cách mép gel agarose khoảng 2 – 2,5 cm) lấy khuôn ra khỏi máng và đẩy nhẹ gel lên bàn đọc UV. Xem các băng ADN dưới tia sáng của đèn UV hay bằng máy phân tích điện di GelDoc iQ của Bio – Rad. Phân tích kết quả điện di dựa trên kích thước đoạn ADN đặc hiệu được xác định dựa trên thang ADN chuẩn (chi tiết ở mục 3.4.5.2). Quy trình thực hiện Non Stop Nested PCR được tóm tắt qua Sơ đồ 3.2. 35 Chạy Non Stop Nested PCR Sơ đồ 3.2 Quy trình thực hiện Non Stop Nested PCR Chuẩn bị hỗn hợp Non Stop Nested PCR Chạy điện di Mẫu tôm Ly trích bằng SDS, NaOH và sốc nhiệt Tinh sạch bằng Instagene Matrix 633bp 221bp Phân tích kết quả 36 3.4.5. Cách đọc kết quả 3.4.5.1. Real - time PCR Kết quả sau khi thực hiện Real - time PCR được xử lý trên phần mềm iQ version 3.1 của máy iCycler iQ và phần mềm excel. Kết quả kiểm tra mẫu qua Real - time PCR được phân tích qua đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ, đồ thị biểu diễn đường chuẩn, bảng kết quả chạy mẫu. Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ Trong suốt thời gian chạy chương trình Real - time PCR, ta có thể nhận biết sự biểu hiện nồng độ ADN của WSSV trong các mẫu thử bằng cách quan sát các đường biểu diễn nồng độ huỳnh quang trên màn hình vi tính. Sau khi kết thúc chương trình, phân tích trên biểu đồ biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ để biết mẫu dương tính và mẫu âm tính. Có hai cách thể hiện đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ: dạng log (log view) – đơn vị huỳnh quang ở trục Y được tính ở dạng log và ▲: các chuẩn : mẫu dương tính : mẫu âm tính : đối chứng âm Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang Baseline subtracted (đường đã trừ đi tín hiệu nền) Chu kỳ ngưỡng (Ct) 37 dạng biểu diễn thường (normal view) – đơn vị huỳnh quang ở trục Y được tính ở dạng số thường, không quy đổi ra log. Trong đề tài này tôi chọn cách phân tích kết quả ở dạng log (Hình 3.5). Đồ thị thể hiện các mẫu dương tính là các mẫu có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang vượt qua đường baseline subtracted (đường đã trừ đi tín hiệu nền). Các mẫu âm tính là các mẫu có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang nằm dưới đường baseline subtracted. Đồ thị ở Hình 3.5 sẽ giúp người phân tích xác định được chu kỳ ngưỡng. Chu kỳ ngưỡng được xác định khi đường baseline subtracted cắt tất cả các đường biểu diễn nồng độ huỳnh quang của mẫu kiểm tra trong giai đoạn tuyến tính giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ (pha log). Sau đó phân tích đường chuẩn và bảng kết quả để biết được hàm lượng WSSV có ban đầu trong 2 µl mẫu thử. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn Đường chuẩn được dựng nên từ 5 chuẩn ở Hình 3.6 với trục tung: chu kỳ ngưỡng - Ct (threshold cycle) và trục hoành: giá trị logarit của số lượng bản sao ban đầu (Log Starting Quantity) có đơn vị là số bản sao (copy number). Đường chuẩn thể hiện mối quan hệ giữa log số bản sao ban đầu (X) và chu kỳ ngưỡng (Y). Thông qua chu kỳ ngưỡng được thể hiện qua Hình 3.5, giá trị log số bản sao ban đầu được xác định theo phương trình Y = a.X + b. Đồ thị này còn thể hiện các mẫu dương tính qua các unknown (mẫu cần kiểm tra) - các hiển thị tương ứng với chu kỳ ngưỡng và log số bản sao ban đầu trên đường chuẩn. Theo Too H. P. (2001), số bản sao trình tự đích ban đầu càng nhiều tương ứng với số chu kỳ ngưỡng càng thấp. Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn đƣờng chuẩn 38 Các thông số cần phân tích thể hiện trên đường chuẩn bao gồm: hệ số tương quan (r 2 ) (correlation coefficient), hiệu quả phản ứng (PCR efficiency) và độ nghiêng (slope).  Hệ số tương quan (correlation coefficient) Hệ số tương quan càng cao tương ứng với các thông số thí nghiệm càng chính xác và phù hợp với giá trị mong đợi. Hệ số tương quan có giá trị giữa 0 và 1. Nếu không có sự tương quan giữa giá trị dự đoán (predicted values) và giá trị thực sự, hệ số tương quan là 0 hay rất thấp. Sự tương quan giữa giá trị dự đoán và giá trị thực sự cao thì hệ số tương quan tiến gần đến 1. Sự phù hợp hoàn hảo tương ứng với hệ số tương quan bằng 1 (Bio – Rad, 2004).  Hiệu quả phản ứng và độ nghiêng Độ nghiêng của đường chuẩn tương quan chặt chẽ với hiệu quả phản ứng. Hiệu quả phản ứng sẽ cho biết các thông tin có giá trị về hóa chất phản ứng. Độ nghiêng của đường chuẩn tương quan với hiệu quả phản ứng qua phương trình sau: Hiệu quả (efficiency) = [10 (-1/slope) ] – 1 (slope: độ nghiêng) (3.1) Độ nghiêng – 3,322 cho hiệu quả 100%. Khi đó số lượng mạch khuôn mẫu (template) tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ khi sự khuếch đại tăng theo cấp số (exponential amplification). Độ nghiêng thấp hơn – 3,322 cho thấy hiệu quả phản ứng thấp hơn 100%. Hầu hết các phản ứng đều không đạt tới 100% do các giới hạn thí nghiệm. Độ nghiêng cao hơn – 3,322 cho hiệu quả phản ứng Real - time PCR cao hơn 100%. Điều này do các giá trị được đo ở giai đoạn không có sự tuyến tính giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ hay do sự hiện diện của các chất ức chế trong phản ứng (Qiagen, 2004). Bảng kết quả chạy mẫu Bảng kết quả xuất ra từ máy có dạng như sau: 39 Kết quả kiểm tra mẫu qua Real - time PCR sẽ được phân tích chủ yếu dựa trên: số bản sao ban đầu (SQ), giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct). Nếu có sự lặp lại các mẫu, kết quả còn được phân tích qua số bản sao trung bình (SQ Mean), giá trị chu kỳ ngưỡng trung bình (Ct Mean), độ lệch chuẩn của số bản sao ban đầu (SQ SD), độ lệch chuẩn của chu kỳ ngưỡng (Ct SD). Các cột còn lại ở Bảng 3.1 nhằm thể hiện vị trí đặt mẫu, loại mẫu,…giúp người phân tích biết rõ thông tin về mẫu cần kiểm tra. 3.4.5.2. Non Stop Nested PCR Kết quả sau khi thực hiện Non Stop Nested PCR được phân tích dựa trên kích thước đoạn khuếch đại đặc hiệu và thang ADN chuẩn qua quan sát các băng ADN dưới tia sáng của đèn UV hay bằng máy phân tích điện di GelDoc iQ của Bio – Rad. Sản phẩm khuếch đại đặc hiệu của WSSV khi chạy Non Stop Nested PCR là đoạn có kích thước 633 bp và 221 bp. Dựa vào thang ADN chuẩn, xác định sự hiện diện băng điện di của đoạn 633 và 221 bp ở đối chứng dương. Sau đó so sánh băng điện di của mẫu với hai băng đặc hiệu trên để xác định mẫu dương tính hay âm tính với WSSV. Well Type Identifier Rep Ct Log SQ SQ SQ Ct Ct SQ Mean SD Mean SD A01 A03 A05 A07 A09 Bảng 3.1 Bảng kết quả kiểm tra mẫu qua Real - time PCR Well: vị trí giếng Type: loại mẫu Identifier: định tên mẫu Rep: vị trí mẫu trên 96 giếng Ct: chu kỳ ngưỡng SQ: starting quantity: số bản sao ban dầu SD: standard deviation: độ lệch chuẩn Mean: trung bình 40 3.5. Bố trí thí nghiệm 3.5.1. Thí nghiệm 1: thử nghiệm hai quy trình ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt và ly trích sử dụng SDS, NaOH, sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix Để ly trích ADN, có hai quy trình đã được thử nghiệm: - Quy trình 1: ly trích ADN sử dụng SDS, NaOH, và sốc nhiệt. - Quy trình 2: ly trích ADN sử dụng Instagene Matrix sau khi đã ly trích bằng SDS, NaOH, và sốc nhiệt. Mục đích Khảo sát hai quy trình ly trích nhằm tìm ra quy trình ly trích tối ưu. Tiến hành Sử dụng mẫu tôm nhiễm WSSV với mức độ nặng (đã qua xét nghiệm) được lưu trữ tại công ty Nam Khoa để tiến hành tách chiết ADN theo hai quy trình ly trích (chi tiết ở mục 3.4.2). Sau khi ly trích xong, dịch tách chiết ADN được pha loãng theo hệ số pha loãng bậc 10. Dùng micropipette hút 5 µl dịch tách chiết ADN cho vào 45 µl dung dịch TE 1X (Tris EDTA), tiến hành trộn mẫu trên máy vortex, sau đó hút 5 µl mẫu từ ống eppendorf vừa vortex ở trên chuyển sang ống eppendorf thứ hai có chứa sẵn 45 µl TE 1X, trộn đều. Quá trình cứ lặp lại, cuối cùng ta thu được một dãy các nồng độ ADN theo chiều giảm dần từ 10 0 đến 10 -6 (Hình 3.8). Tiến hành thực hiện phản ứng Real - time PCR cho tất cả các nồng độ từ 10 -1 đến 10 -6 của cả hai quy trình ly trích. 633bp 221bp Hình 3.7 Kết quả điện di qua Non Stop Nested PCR MK: thang ADN chuẩn 41 Dựa vào kết quả so sánh chu kỳ ngưỡng của mẫu ở từng nồng độ pha loãng theo hai quy trình ly trích để xác định mẫu ly trích theo quy trình nào sẽ có ADN đích nhiều và tinh sạch hơn (mẫu có ADN đích nhiều và tinh sạch hơn sẽ có chu kỳ ngưỡng thấp hơn). 3.5.2. Thí nghiệm 2: sử dụng phƣơng pháp Real - time PCR kiểm tra phát hiện và định lƣợng virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) trên 15 mẫu đã xác định dƣơng tính, âm tính với WSSV Mục đích Thử nghiệm khả năng phát hiện và định lượng WSSV bằng phương pháp Real - time PCR. Tiến hành 15 mẫu tôm (8 mẫu dương tính và 7 mẫu âm tính với WSSV) đã qua kiểm tra PCR và Semi – Nested PCR được tiến hành ly trích theo quy trình xác định từ thí nghiệm 1. Các mẫu này được thử nghiệm lặp lại hai lần qua Real - time PCR và đồng thời một lần qua Non Stop Nested PCR. Các mẫu tôm sau khi ly trích này được chạy kèm với 5 chuẩn. Sau khi ly trích xong, dùng micropipette hút 2 µl dịch tách chiết chứa ADN của WSSV cho vào từng hỗn hợp 48 µl Real - time PCR và hỗn hợp 48 µl Non Stop Nested PCR. Đối với chuẩn, hút 2 µl mỗi chuẩn cho vào 48 µl hỗn hợp Real - time PCR. Tiến hành thực hiện phản ứng Real - time PCR và Non Stop Nested PCR (chi tiết ở mục 3.4.3 và 3.4.4). Mẫu nào có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang vượt qua đường baseline subtracted được xác định là dương tính với WSSV. Mẫu nào có đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang nằm dưới đường baseline subtracted được xác định là âm tính với 5 µl mẫu 45 µl TE 10 0 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -1 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl 5 µl Hình 3.7 : Cách pha loãng mẫu theo hệ số pha loãng bậc 10 Hình 3.8 Cách pha loãng mẫu theo hệ số pha loãng bậc 10 10 0 10 -1 10 -4 10 -3 10 -2 10 -5 10 -6 [...]... pháp Real - time PCR để kiểm tra mầm bệnh WSSV trên 30 mẫu tôm thu từ thực tế Qua các kết quả thu nhận từ các thí nghiệm trên, tôi nhận thấy phương pháp Real time PCR là phương pháp đáng tin cậy trong phát hiện và định lượng WSSV, tiến hành kiểm tra 30 mẫu tôm thu từ thực tế bằng phương pháp Real - time PCR, kết quả thu được như sau: 61 : 1 : 6 : 10 : 13 : 14 : 18 : 22 : 23 : 25 : 26 : các... + (PCR) + (PCR) + (PCR) + (PCR) + (Semi-Nested PCR) + (Semi-Nested PCR) + (Semi-Nested PCR) + (Semi-Nested PCR) - (PCR) - (PCR) - (Semi-Nested PCR) - (Semi-Nested PCR) Non Stop Nested PCR Real - time PCR + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Bảng 4.1 cho thấy kết quả kiểm tra mầm bệnh đốm trắng ở các mẫu 9, 10, 11, 12 bằng phương pháp Real - time PCR và Non Stop Nested PCR có sự khác biệt... pha loãng từ 1 0-1 đến 1 0-8 thể hiện qua Hình 4. 12 58 : 1 0-1 : 1 0 -2 : 1 0-3 : 1 0-4 : 1 0-5 : 1 0-6 : 1 0-7 : 1 0-8 : đối chứng âm Hình 4. 12 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của mẫu nhiễm WSSV pha loãng từ 1 0-1 đến 1 0-8 Sau hai lần chạy Real – time PCR ở các nồng độ pha loãng 1 0-1 đến 1 0-8 của mẫu, kết quả cho thấy ở các nồng độ pha loãng từ 1 0-1 đến 1 0-7 đều có đường... 1 0-1 đến 1 0-6 , và không có khả năng phát hiện mẫu tôm nhiễm WSSV có nồng độ pha loãng 1 0-7 và 1 0-8 Kết quả so sánh độ nhạy giữa hai phương pháp được tóm tắt qua Bảng 4.7 60 Bảng 4.7 Kết quả chạy Real - time PCR và Non Stop Nested PCR trên mẫu tôm nhiễm WSSV ở các nồng độ pha loãng từ 1 0-1 đến 1 0-8 Nồng độ Real - time PCR Non Stop Nested PCR 1 0-1 + + 1 0 -2 + + 1 0-3 + + 1 0-4 + + 1 0-5 + + 1 0-6 + + 1 0-7 ... pháp Real – time PCR có khả năng phát hiện các mẫu nhiễm WSSV mà các phương pháp khác không có khả năng phát hiện Như vậy, phương pháp Real – time PCR có thể sử dụng để kiểm tra phát hiện WSSV trên tôm sú nuôi và thậm chí cho kết quả phát hiện mầm bệnh còn tốt hơn so với các phương pháp khác Để định lượng số bản sao ban đầu của virus gây bệnh đốm trắng trên 12 mẫu tôm, tôi tiến hành định lượng dựa trên. .. time PCR trên 12 mẫu dương tính và âm tính thể hiện qua các đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang trên đồ thị ở Hình 4 .2 : 1 : 2 : 3 : 4 : 5 : 6 : 7 : 8 : 9 : 10 : 11 : 12 : đối chứng âm : các chuẩn Hình 4 .2 Đồ thị biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu kỳ của 12 mẫu tôm sú 47 Hình 4 .2 thể hiện rõ các đường cong biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ huỳnh quang và số chu... Nested PCR như sau: 59 633bp 22 1bp MK (-) (+) 1 0-1 1 0 -2 1 0-3 1 0-4 1 0-5 1 0-6 1 0-7 1 0-8 Hình 4.13 Kết quả kiểm tra Non Stop Nested PCR ở các nồng độ pha loãng của mẫu nhiễm WSSV Ở các nồng độ 1 0-1 , 1 0 -2 , 1 0-3 đều xuất hiện hai băng đặc hiệu 633 bp và 22 1 bp, cho kết quả nhiễm WSSV nặng (số lượng bản sao ban đầu lớn) Ở các nồng độ càng loãng: 1 0-4 , 1 0-5 , 1 0-6 số lượng ADN đích càng giảm nên chỉ hiện diện... nhiễm virus gây bệnh đốm trắng Từ các kết quả thử nghiệm trên cho thấy phương pháp Real - time PCR có khả năng phát hiện được mầm bệnh WSSV mà các phương pháp khác có thể phát hiện Ngoài ra Real - time PCR còn có khả năng phát hiện mầm bệnh WSSV ngay cả ở mức độ nhiễm rất nhẹ (1 bản sao) mà các phương pháp khác không có khả năng phát hiện 53 4.3 Kết quả khảo sát tính định lƣợng của phƣơng pháp Real - time. .. rất thấp thể hiện độ sai lệch nhỏ và độ lặp lại thí nghiệm cao Như vậy, kết quả thử nghiệm tính định lượng của Real - time PCR trên hai mẫu 1 và 7 thể hiện rõ tính tuyến tính và độ lặp lại cao về khả năng định lượng của hệ thống, có thể sử dụng để kiểm tra định lượng WSSV trên tôm sú 4.4 Kết quả khảo sát độ nhạy giữa phƣơng pháp Real - time PCR và Non Stop Nested PCR Kết quả Real – time PCR của các... xác định độ nhạy giữa Real - time PCR và Non Stop Nested PCR Phương pháp nào có độ nhạy cao hơn sẽ có khả năng phát hiện WSSV đến nồng độ pha loãng thấp hơn 3.5.5 Thí nghiệm 5: ứng dụng phƣơng pháp Real - time PCR để kiểm tra mầm bệnh WSSV trên 30 mẫu tôm thu từ thực tế Mục đích Ứng dụng phương pháp Real - time PCR để kiểm tra sơ khởi tỷ lệ nhiễm WSSV trên tôm sú giống, và kiểm tra mức độ nhiễm WSSV trên . quang và số chu kỳ của 12 mẫu tôm sú : 8 : 9 : 10 : 11 : 12 : đối chứng âm : các chuẩn : 1 : 2 : 3 : 4 : 5 : 6 : 7 47 Hình 4 .2 thể hiện rõ. chuẩn của 12 mẫu tôm sú Bảng 4 .2 Kết quả kiểm tra 3 mẫu tôm sú Mẫu Kết quả đã xét nghiệm bằng PCR Non Stop Nested PCR Real - time PCR 13 - - - 14 - - + 15 - - + 51. để định lượng số bản sao ban đầu của virus gây bệnh đốm trắng. Thí nghiệm này được lặp lại 2 lần qua Real - time PCR. Sau khi ly trích xong, 2 µl mẫu được cho vào 48 µl hỗn hợp Real - time PCR.