http://www.ebook.edu.vn 40 Hệ thống cytochrom thường hiện diện chỉ trong các loài vi sinh vật hiều khí hay kỵ khí tuỳ nghi. Các vi sinh vật kỵ khí bắt buộc không có hệ thống này. Có nhiều loại hệ thống cytochrom oxyadse khác nhau tuỳ thuộc vào từng loài vi sinh vật, một số loài chỉ có một oxydase trong khi một số loài khác có hai hay ba oxydase. Cytochrom oxydase là hệ enzym cuối cùng trong toàn bộ hệ thống cytochrom, ngoài ra còn có các cytochrom khác như b, c 1 ,c. Phát hiện hệ thống cytochrom oxydase nhờ thuốc thử p-phenylenediamin, đây là một dẫn xuất từ hợp chất phenol amin. Cytochrom oxydase không phản ứng trực tiếp với thuốc thử này mà phải qua trung gian oxyhoá cytochrom c. Quá trình này như sau: Cytochrom oxydase 2 cytochrom c khử + 2H + + ½ O 2 2 Cytochrom c oxy hoá + H 2 O oxy hoá 2 Cytochrom c oxy hoá + thuốc thử hợp chất có màu xanh Hợp chất có màu xanh này là một indolphenol blue, đây là một loại thuốc nhuộm có nhân quinon. Các tiến hành: Nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường nutrien agar qua đêm, lấy một ít sinh khối vi sinh vật bằng que cấy vòng được làm bằng nhựa hay gỗ đặt lên giấy lọc mày trằng, đánh dấu vò trí đặt sinh khối vi sinh vật. Nhỏ lên vò trí đáng dấu một giọt thuốc thừ N,N,N’,N’- tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD), quan sát sau vài phút. Phản ứng oxydase dương tính khi sinh khối vi sinh vật chuyển thành này xanh dương đậm. Phản ứng âm tính khi không có hiện tượng chuyển màu. http://www.ebook.edu.vn 41 http://www.ebook.edu.vn 39 Chương 4 PHƯƠNG PHÁP KHÔNG TRUYỀN THỐNG Phát hiện vi sinh vật bằng phương pháp nuôi cấy được xây dựng và phát triển trong thời gian dài, được nhiều nước công nhận và chúng đã trở thành những phương pháp tiêu chuẩn. Tuy vậy nhược điểm lớn nhất của phương pháp nuôi cấy là tốn nhiều thời gian, cho kết quả chậm, mất nhiều công sức, cồng kềnh và ngày càng tỏ ra không đáp ứng được các yêu cầu phân tích phục vụ nhu cầu thực tế hiện nay. Để khắc phục những nhược điểm trên của phương pháp nuôi cấy, nhiều phương pháp nhanh và tự động đã được hình thành và phát triển dựa trên nhiều nguyên tắc sinh học và vi sinh vật học khác nhau. Các phương pháp mới này nhằm mục đích rút ngắn thời gian phân tích, giảm thiểu sự phức tạp trong thao tác, dễ dàng thực hiện và có độ nhạy và độ chính xác cao. Các phương pháp nhanh và tự động hoá trong phân tích vi sinh vật thực phẩm đều dựa trên nguyên tắc của vi sinh học, sinh hoá học, hoá lý, miễn dòch học, sinh học phân tử học để phát hiện và đònh lượng vi sinh vật mục tiêu hay sản phẩm độc hại của chúng trong thực phẩm, môi trường. Tất cả các yêu cầu kỹ thuật liên quan đến việc thu và chuẩn bò mẫu, phân tích … đều được nghiên cứu cải tiến theo hướng tự động hoá, đơn giản hoá cho kết quả nhanh và chính xác. 1. Phương pháp phát quang sinh học ATP Phân tử Adenosine triphosphate (ATP) có mặt trong tất cả các tế bào sống, nên sự phát hiện ATP là dấu hiệu để nhận biết vật chất sống đang tồn tại. ATP có thể được phát hiện và đònh lượng thông qua cường độ ánh sáng phát ra do sự kết hợp với enzyme Luciferase. Kó thuật này có thể phát hiện được 1pg ATP, tương ứng với khoảng 1000 tế bào vi khuẩn (10 -15 g ATP/ tế bào). Quá trình phân tích chỉ diễn ra trong vài phút và vì thế phương pháp này được xem là nhanh hơn và thuận lợi hơn so với phương pháp đếm khuẩn lạc. Việc dùng phương pháp đo hàm lượng ATP để xác đònh rõ số vi sinh vật đang hiện diện đã được biết đến vào năm 1960. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi nhiều sự cải tiến trong việc thiết kế thiết bò đo cường độ ánh sáng phát ra và những hóa chất để ổn đònh sự phát sáng. Ngày nay phương pháp này được ứng dụng trong 3 lónh vực: giám sát vệ sinh, kiểm tra những loại chất lỏng như nước rửa làm sạch hệ thống, đánh giá chất lượng vi sinh của thực phẩm. Để đánh giá chất lượng vi sinh của thực phẩm thì lượng ATP của vi sinh vật phải được đo và điều này đòi hỏi những quy trình tách chiết ATP ra khỏi tế bào vi sinh vật. Phản ứng phát sáng sinh học trải qua hai giai đoạn : E + LH 2 + ATP E – LH 2 AMP + PP i (1) E – LH 2 AMP +O 2 Oxyluciferin + AMP + CO 2 + hv (2) Phản ứng phát sáng sinh học ở đom đóm có thể viết lại như sau: E + LH 2 + ATP +O 2 Oxyluciferin + AMP + CO 2 + hv +PP i E : luciferase LH 2 :luciferin nh sáng phát ra có bước sóng 562nm, có màu vàng. Mg 2+ Mg 2+ http://www.ebook.edu.vn 40 Mẫu được lấy bằng cách quét những vi sinh vật ở trên bề mặt dụng cụ và thiết bò, sau đó đo lượng ATP thông qua một loạt quá trình ly trích. Những thiết bò được chế tạo đầu tiên đòi hỏi người thực hiện quét mẫu trên một vò trí (thường là 10cm 2 ), sau đó nhúng hoàn toàn que quét mẫu vào trong dung dòch chứa những tác nhân làm phóng thích ATP, trộn với dung dòch luciferase – luciferin và đặt vào trong một cuvette để đọc trò số ánh sáng. Sơ đồ các bước đònh lượng nhanh vi sinh vật hiện diện trên bề mặt bằng phản ứng phát sáng 2. PHƯƠNG PHÁP ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) Những tiến bộ của khoa học trong những năm gần đây đã thúc đẩy sự phát triển của các kỹ thuật chẩn đoán bằng huyết thanh. Các phương pháp này tỏ ra rất hiệu quả trong việc chẩn đoán nhanh và chính xác các vi sinh vật gây bệnh. Ngày nay phương pháp này còn được phát triển để xác đònh các chất độc hại trong môi trường như độc tố, dư lượng kháng sinh… Nguyên tắc của phương pháp ELISA dựa trên phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên với một kháng thể đặc hiệu. Phản ứng miễn dòch xãy ra được phát hiện bằng cách sử dụng những kháng thể đã được đánh dấu (bằng chất nhuộm phát huỳnh quang, đồng vò phóng xạ, hay enzyme). Phương pháp ELISA là phương pháp hấp phụ miễn dòch liên kết enzyme (enzyme-linked immunosorbent assay). Nguyên tắc kỹ thuật ELISA là sử dụng kháng thể đơn dòng (kháng thể sơ cấy) phủ bên ngoài những giếng (well) nhỏ nhằm mục đích thu giữ những kháng nguyên mục tiêu. Những kháng nguyên thu giữ được phát hiện bằng cách sử dụng kháng thể thứ hai có gắn với enzyme phát tính hiệu (thường là horseradish peroxidase hay alkaline phosphatase). Khi cho vào hỗn hợp phản ứng một cơ chất đặc hiệu của enzyme, phản ứng xảy ra và tạo ra các sản phẩm làm đổi màu phản ứng. Như vậy, chúng ta có thể phát hiện được sự hiện diện của kháng nguyên . Kháng thể thu kháng nguyên Kháng nguyên Kháng thể mang enzyme đánh dấu “Sandwich” C ơ chất Phát quang http://www.ebook.edu.vn 41 Nguyên tắc phản ứng ELISA - S: cơ chất, E: ensyme, P: phát quang Qui trình thực hiện phân tích bằng ELISA có các chính như sau: đặc mẫu vào trong các giếng có chứa kháng thể sơ cấp, cho kháng thể thứ cấp có liên kết với enzym tạo màu vào để tạo sandwich, rửa để loạo bỏ các kháng thể mang enzym không tham gia phản ứng, cho cơ chất tạo màu với emzym liên kết quả hỗm hợp, đo cường độ màu tạo thành để xác đònh lượng kháng nguyên trong mẫu. Hiện nay ELISA đã được sử dụng rộng rãi để phân tích Salmonella, E. coli gây bệnh, Listeria, độc tố Staphylococus, thuốc trừ sâu, dư lượng khám sinh… đối với vi sinh vật, phương pháp ELISA có thể sử dụng phát hiện và đònh lượng vi sinh trong thực phẩm sau vài giờ tăng sinh nhằm tăng độ nhạy của phương pháp. 3. PHƯƠNG PHÁP MẪU DÒ (Gene probes) Vào những năm 1980, có nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học vào lónh vực thực phẩm, đặc biệt là trong chẩn đoán vi sinh. Phương pháp sử dụng mẫu dò (probe) trong việc phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm thông qua sự phát hiện một trình tự DNA đặc trưng. Các mẫu dò thường sử dụng RNA ribosome (rRNA) làm mục tiêu, do trong cơ thể số lượng bản sao rRNA lớn, đủ để làm tăng độ nhạy của phương pháp phân tích. Nguyên tắc của phương pháp mẫu dò là lai phân tử, đó là bắt cặp giữa hai trình tự DNA tương đồng. Một trong hai trình tự (thường là trình tự đích, tức là trình tự DNA của tế bào vi sinh vật) được cố đònh trên một giá thể rắn hoặc trên tế bào hay mô. Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự bổ sung gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn T m ít nhất vài độ. Sự lai phân tử còn có thể xảy ra giữa DNA và RNA. Quá trình lai phân tử chòu ảnh hưởng rất nhiều bởi các yếu tố: nồng độ DNA trong môi trường, nhiệt độ và thời gian phản ứng, kích thước các trình tự lai và lực ion của môi trường. Một ví dụ về hệ thống phát hiện bằng mẫu dò là thống Gentrak (Framingham, USA). Phương pháp phân tích này sử mẫu dò để phát hiện Listeria trong mẫu bơ sữa và mẫu môi trường. Mẫu dò là những đoạn oligomer DNA đánh dấu bằng hoá chất phát quang. Quy trình phân tích có thể được chia thành 6 bước: 1. Phá vỡ tế bào thu nhận rRNA, 2. mẫu dò DNA thu giữ có đuôi deoxyadenylic nucleotide (dA) và mẫu dò phát hiện (reporter probe) chứa fluorescein isothiocyanate (F) ở đầu 5’ và 3’ của phân tử, 3. Que thử được bao bọc bởi polydeoxythymidine (dT) được đạt vào với mục đích gắn những mẫu dò với với que thử, 4. que thử được đạt vào ống chứa enzyme liên kết với mẫu dò phát hiện, 5. Sau khi rửa loại phần enzyme thừa, que thử được đặt vào ống chứa cơ chất tạo màu, 6. Sau khi ủ để hiện màu, màu được phát hiện ở bước sóng 450 nm. http://www.ebook.edu.vn 42 Sơ đồ quy trình phát hiện Listeria với mẫu dò phát quang 4. PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase Chain Reaction) Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi chuyên biệt để tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khuôn thường là những những trình tự DNA của gen quy đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu hoặc các gen quy đònh việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn mồi này được nối dài để hình thành mạch mới. Khi cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, với điều kiện DNA polymerase hoạt động trong phản ứng PCR, một đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được tạo nên. Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNA xác đònh, ta phải có những thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt. Các mồi này gồm một mồi xuôi (sens primer) và một mồi ngược (antisens primer) so với chiều phiên mã của gen. Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba bước: biến tính (denaturation), lai (anealation), tổng hợp (elongation). Phân tích sản phẩm khuyếch đại bằng sự điện di trên gel agarose. Đặc trưng của phản ứng khuếch đại đối với từng vi sinh vật mục tiêu thông qua kích thước của sản phẩm khuếch đại. RNA mục tiêu Mẫu dò thu giữ Mẫu dò phát hiện Que thử Cơ chất phát quang http://www.ebook.edu.vn 43 Sơ đồ phản ứng PCR Sơ đồ phản ứng PCR Ưu điểm của phương pháp PCR: - Thời gian cho kết quả nhanh - Có thể nhận diện những vi sinh vật khó nuôi cấy. Việc nuôi cấy tăng sinh là đơn giản hơn và có khi không cần thiết. - Hóa chất cần cho phản ứng PCR sẵn có hơn và dễ tồn trữ hơn so với trường hợp huyết thanh học. Không cần dụng cụ và môi trường chẩn đoán phức tạp, có thể thực hiện ở hiện trường. - Ít tốn kém về mặt nhân sự. Có thể được tự động hóa để làm giảm chi phí phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm. Mặc dù vậy phương pháp PCR vẫn còn một số khuyết điểm cần khắc phục: - Sự ức chế hoạt tính của Taq DNA polymerase bởi thành phần của mẫu vật. Mẫu thực phẩm thường có những thành phần phức tạp. Việc chiết tách và tinh chế DNA từ http://www.ebook.edu.vn 44 thực phẩm hay môi trường trước khi thực hiện phương pháp PCR cho phép loại bỏ những hợp chất ức chế. Tuy nhiên, một vài quy trình phát hiện vi sinh vật gây bệnh thực phẩm bằng PCR không cần tách chiết, tinh chế DNA. - Mật độ vi sinh vật gây bệnh hiện diện trong mẫu thực phẩm thường thấp, nên trong đa số trường hợp cần có bước nuôi cấy làm giàu để có được mật độ đủ để phát hiện bằng PCR. - Phương pháp này không phân biệt được tế bào sống với tế bào chết. Do vậy có thể dẫn đến trường hợp dương tính giả do DNA từ tế bào chết. Ngược lại phương pháp này cho phép phát hiện bào tử, dạng tiềm sinh, hay tế bào đã chết của các vi sinh vật gây bệnh hoặc gây ngộ độc. 5. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP THỬ NHANH KHÁC 5.1. Kỹ thuật phân tách và tăng mật độ Trong quá trình đồng nhất mẫu, mẫu thường được pha loãng bậc 10 tạo một thể tích lớn nguyên liệu ban đầu (250ml). Nhưng có thể chỉ dùng vài mililite cho những bước tiếp theo trong quy trình phát hiện. Như vậy chúng ta có thể dùng bước tăng mật độ các vi sinh vật mục tiêu trong mẫu để rút ngắn thời gian và tăng hiệu quả phát hiện. Một kỹ thuật phân tách được sử dụng rộng rãi là miễn dòch phân tách (Immunomagnetic separation - IMS). Với phương pháp này, giai đoạn phân lập có thể được rút ngắn bằng cách thay thế môi trường tăng sinh chọn lọc bằng quy trình tương tự không cần nuôi cấy. IMS sử dụng những hạt siêu thuận từ được bao bọc bên ngoài bởi những kháng thể của vi sinh vật mục tiêu. Các hạt này có chức năng phân tách chọn lọc vi sinh vật mục tiêu này ra khỏi một hỗn hợp quần thể. Các vi sinh vật mục tiêu này có thể được phát hiện bằng các quy trình vi sinh truyền thống. Tính siêu thuận từ của các hạt chỉ được thể hiện khi chòu sự tác động của một lực từ tính bên ngoài tác động. Dynabeads ® (Dynal A/S, Oslo, Norway) là một sản phẩm dựa trên kỹ thuật IMS. Quy trình này sử dụng những hạt polystyren siêu thuật từ có đường kính 2,8μm (Dynabeads® M- 280) và 4.5μm (Dynabeads® M-450). Cả hai loại M-280 và M-450 đều có thể được bao bên ngoài bởi lớp kháng thể do người dùng lựa chọn. Một ví dụ về chất hấp thụ từ tính khác có thể được lựa chọn là BioMag (Metachem Diagnostics Ltd, Northampton). Các hạt từ tính oxide sắt (đường kính 0.5 - 1.5μm) được bao phủ bên ngoài bởi các nhóm amino-, carboxy- hoặc thiol Ngoài ra một số hệ thống khác còn có khả năng tạo từ tính cho các tế bào vi sinh vật bằng cách cho chúng hấp thu trực tiếp những hạt siêu hiển vi oxide sắt mang từ tính lên bề mặt tế bào (Safarík và cộng sự, 1995). 5.2. Kỹ thuật màng lọc phát huỳnh quang trực tiếp (Direct Epifluorscent Technique – DEFT) và màng lọc lưới kỵ nước (Hydrophobic Grid Membrane) Cơ sở của việc sử dụng phương pháp màng lọc là thu nhận tế bào từ một lượng lớn thể tích được lọc. Sau đó có thể kiểm tra bằng kính hiển vi hoặc bằng cách đếm khuẩn lạc. Phương pháp này thích hợp đối với mẫu có mật độ tế bào thấp. Màng lọc có thể được làm bằng nitrocellulose, cellulose acetate ester, nylon, polyvinyl chloride và polyester (Sharpe, 1994). Kích thước lổ sử dụng là 0,45μm (hoặc 0,22μm) đường kính 13mm đến 150mm. Tạo lực đẩy qua lọc bằng hút chân không hoặc lực ép.Màng lọc được sử dụng như một biến thể của kỹ thuật truyền thống với nhiều mục đích: tăng mật độ vi sinh vật http://www.ebook.edu.vn 45 mục tiêu trong một thể tích lớn nhằm tận dụng giới hạn phát hiện; loại bỏ tác nhân ức chế sự tăng trưởng. Độ nhạy của kỹ thuật phát huỳnh quang trực tiếp (DEFT) phụ thuộc vào mật độ tế bào trườc khi nhuộm được lọc bởi màng lọc. Có thể phân biệt tế bào sống và tế bào chết bằng cách nhuộm nhân với fluorochrome acridine orange. Màu sắc phát quang trong tế bào thay đổi trong suốt các quá trình tăng trưởng. Thuốc nhuộm phát màu đỏ với RNA và màu xanh với DNA. Thông thường thì tế bào sống cho màu đỏ da cam trong khi các tế bào chết cho màu cho màu xanh lục. Năm 1991, phương pháp ISO-GRID ® ứng dụng trên đối tượng Salmonella đã dược AOAC công nhận áp dụng cho mọi loại thực phẩm (Method 991.12). Hình 8: Hệ thống ISO-GRID ® 5.3. Kỹ thuật màng petri (Petrifilm) Môi trường dinh dưỡng dạng đông khô được cố đònh vào các màng mỏng gọi là Petrifilm. Khi sử dụng, lớp màng bảo vệ bên trên được nâng lên và nhỏ vào một 1ml dòch mẫu rồi đậy lại. Một đóa petri nhựa được đặt lên màng bào vệ để tạo một khuôn tròn. Môi trường dinh dưỡng sẽ hỗ trợ cho sự phát triển của vi sinh vật trong thời gian ủ. Có thể đếm trực tiếp số khuẩn lạc trên Petrifilm. Petrifilm đã được dùng để kiểm tra tổng số vi sinh vật hiếu khí, số coliform, coliform phân, nấm mốc, nấm men. Ưu điểm của kỹ thuật Petrifilm là dễ thao tác, tiết kiệm không gian ủ và bảo quản. Thời hạn sử dụng lâu do dùng môi trường đông khô và không cần xủ lý nhiệt như phương pháp thông thướng. Có thể dùng nước cất vô trùng để làm ướt lại môi trường đông khô. Sau khi môi trường đông lại, có thể dùng trực tiếp Petrifilm để đếm tạp khuẩn bề mặt. A B Đ ặt mẫu lên màng Petrifilm Dàn đều mẫu trên màng Ủ Petrifilm, đếm trực tiếp hoặc phân lập http://www.ebook.edu.vn 46 Cách sử dụng hệ thống Petrifilm của 3M Microbiology 5.4. Kỹ thuật Redigel Kỹ thuật này sử dụng các chất dinh dưỡng và pectin gel chứa trong một ống nghiệm. Có thể sử dụng ống nghiệm này bất cứ lúc nào mà không cần phải đun chảy thạch. Trước tiên nhỏ 1ml mẫu vào ống nghiệm, trộn đều. Sau đó đổ tất cả vào một đóa petri đặc biệt đã được tráng sẵn một lớp calci. Khi chất lỏng tiếp xúc với calci, gel Ca-pectate sẽ hình thành và phức chất này sẽ trương lên như môi trường thạch thông thường. Sau khi ủ ở chế độ thích hợp có thể đếm khuẩn lạc giống như phương pháp đếm đóa thông thường. Hình 10: Thao tác sử dụng hệ thống Redigen của 3M 5.3. Kỹ thuật trở kháng vi sinh vật (conductance / impedance) Vi sinh trở kháng dùng để phát hiện trực tiếp vi sinh vật thông qua tính ion trong sản phẩm của quá trình trao đổi chất hoặc trực tiếp từ sự giải phóng CO 2 (carbon dioxide). Những mô tả chi tiết về kỹ thuật này được công bố trong báo cáo của Kell & Davey (1990) và Silley & Forsythe (1996). Người ta sử dụng môi trường nuôi cấy chọn lọc làm dung dòch điện phân. Sự trao đổi chất của vi sinh vật tạo ra những sản phẩm mang tính ion trong môi trường nuôi cấy (acid hữu cơ và ion amonium) và vì vậy làm tăng tính dẫn điện của môi trường. Sự thay đổi về điện dẫn được ghi nhận bởi các thiết bò đo phản ánh sự hiện diện của vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy. Phương pháp này không thể áp dụng cho những môi trường có lực ion cao, như môi trường chọn lọc Listeria lỏng, vì trong môi trường này, ngay từ ban đầu, giá trò điện dẫn đã nằm ngoài giới hạn đo của thiết bò. Kỹ thuật giám sát trực tiếp độ dẫn phức tạp hơn do liên quan đến cầu KOH (potassium hydroxide). KOH được cố đònh trong môi trường (agar) và tạo thành cầu nối dẫn điện giữa hai đầu điện cực. Cầu nối này và mẫu phân tích được ngăn cách với nhau bằng một khoảng không gian nhất đònh. Khi quá trình phát triển, vi sinh vật sinh ra CO 2 và khí này làm phân rã cầu nối KOH. Kết quả của hiện tượng này là làm giảm tính dẫn điện và sự thay đổi này có thể quan sát được bằng thiết bò giám sát. Thời gian tính dẫn thay đổi được gọi là thời gian phát hiện. Thông thường thì các thiết bò giám sát bằng trở kháng đều có những chương trình tự động xác đònh sự hiện diện của vi sinh vật khi độ dẫn vượt qua một giá trò quy ước. Giới hạn phát hiện của phương pháp này là một tế bào sống. Bởi theo lý thuyết, từ một tế bào này sẽ sinh ra . cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học vào lónh vực thực phẩm, đặc biệt là trong chẩn đoán vi sinh. Phương pháp sử dụng mẫu dò (probe) trong vi c phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm thông qua sự phát. giá chất lượng vi sinh của thực phẩm thì lượng ATP của vi sinh vật phải được đo và điều này đòi hỏi những quy trình tách chiết ATP ra khỏi tế bào vi sinh vật. Phản ứng phát sáng sinh học trải. với vi sinh vật, phương pháp ELISA có thể sử dụng phát hiện và đònh lượng vi sinh trong thực phẩm sau vài giờ tăng sinh nhằm tăng độ nhạy của phương pháp. 3. PHƯƠNG PHÁP MẪU DÒ (Gene probes)