B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Đặc điểm của HPLC Pha tĩnh được nhồi trong cột Pha động ở trạng thái lỏng: Các dung môi, hỗn hợp dung môi hoặc nước Phân loại HPLC dựa vào vật liệu nhồi  Pha thông thường (Normal phase): vật liệu nhồi là silica đơn giản  Trao đổi ion: silica biến tính (mdified silica)  Pha đảo (reverse-phase): silica biến tính Phần lớn các HPLC là pha đảo  Chất phân tích được giữ trên pha tĩnh phân cực nhỏ hơn cho đến khi bị rữa trôi bởi pha động phân cực đủ lớn  Thao tác đơn giản  Hiệu quả cao  Cột làm việc ổn định Có thể phân tích cho cả hai loại cấu tử có đặc tính tương tự hoặc khác xa nhau B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Mặc dầu có nhiều lý thuyết nghiên cứu về việc sử dụng pha đảo nhưng phần lớn các chương trình HPLC pha đảo đều thu được từ phương pháp thử và sai (by trial and error). B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC)  Gốc R là C8 (n-octyl), C12 (n-octyl) hoặc C18 (n-octyldecyl).  Pha động là H2O + dung môi hòa tan (acetonitrile, methanol, ethanol, isopropanol).  Các cấu tử phân cực sẽ bị rửa ra nhanh nhất, tăng độ phân cực của pha động sẽ làm tăng thời gian chạy mẫu Pha tĩnh-Pha đảo (Stationary Phases for Reversed-Phase LC) Pha tĩnh bình thường của LC (Stationary Phases for Normal LC)  Pha động tương đối không phân cực: Hexane, Isopropyl eter, toluene…  Các cấu tử không phân cực sẽ bị rửa ra nhanh nhất, tăng độ phân cực của pha động sẽ giảm thời gian chạy mẫu B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Ảnh hưởng của bản chất pha tĩnh đến chất lượng tách Pha đảo B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Sơ đồ nguyên lý của HPLC B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Các yêu cầu đối với dung môi  Áp suất bơm: vài trăm atm (6000psi), lưu lượng 0,1 – 10 ml.min -1 với E<0,5%  Vật liệu bơm bền ăn mòn đối với nhiều loại dung môi khác nhau  Chế độ bơm piston  Cỡ hạt trong cột sắc ký: 3 - 10m  Một hoặc nhiều bình chứa dung môi (500 ml)  Loại bỏ hoàn toàn khí hòa tan và cặn trong dung môi giảm độ rộng của peak (band spreading) và ảnh hưởng đến chất lượng detector  Đuổi khí hòa tan trong dung môi bằng khí trơ (sparger)  Lựa chọn chế độ tách rửa (elution) cho dung môi  Trang bị các loại valves tỷ lệ (proportionating valves) cho phép đưa dung môi từ hai bình chứa với các lưu lượng thay đổi liên tục B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Hiệu quả tách bằng phương pháp gradient elution  Sử dụng một dung môi đơn giản có thành phần không đổi: isocratic  Sử dụng hai hay nhiều hơn các hệ dung môi có độ phân cực (polarity) khác nhau nhiều: gradient elution  Tỷ lệ các loại dung môi được chương trình hóa liên tục hoặc theo từng bậc  Gradient elution: tăng chất lượng của quá trình tách (improve seperation efficiency) Quá trình tách rửa (Elution) B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Polar Solvents Water > Methanol > Acetonitrile > Ethanol > Oxydipropionitrile Non-polar Solvents N-Decane > N-Hexane > N-Pentane > Cyclohexane Độ phân cực của một số dung môi sử dụng trong HPLC Lựa chọn pha động và pha tĩnh Chủ yếu dựa vào sự phân cực của cấu tử phân tích, pha động, pha tĩnh Quy tắc chung: độ phân cực (polarity) của cấu tử cần phân tích và pha tĩnh là tương đương còn pha động có độ phân cực sai biệt Khi độ phân cực của cấu tử và pha tĩnh quá giống nhau: thương tác mạnh giữa cấu tử cần phân tích và pha tĩnh  thời gian phân tích kéo dài B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Tính chất một số loại dung môi sử dụng trong HPLC . cấu tử có đặc tính tương tự hoặc khác xa nhau B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Mặc dầu có nhiều lý thuyết nghiên cứu về việc sử dụng pha đảo nhưng. giảm thời gian chạy mẫu B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Ảnh hưởng của bản chất pha tĩnh đến chất lượng tách Pha đảo B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance. Chromatography - HPLC) Sơ đồ nguyên lý của HPLC B. Sắc ký lỏng hiệu quả cao (Hight-Performance Liquid Chromatography - HPLC) Các yêu cầu đối với dung môi  Áp suất bơm: vài trăm atm (6000psi), lưu