1 ĐẶT VẤN ĐỀ H influenzae trước gọi trực khuẩn Pfeiffer hay trực khuẩn cúm [8] thành viên họ Pasteurellaceae Tên vi khuẩn ln gắn liền với tính chất sinh học đặc trưng yếu tố lịch sử nghiên cứu [35] H influenzae loài vi khuẩn nghiên cứu từ sớm đánh giá nguyên nhân hàng đầu gây bệnh nhiễm trùng nguy hiểm cho trẻ nhỏ, đặc biệt viêm màng não Trong đó, H influenzae typ b (Hib) biết thường gây bệnh cho trẻ tuổi không tiêm chủng vacxin Bệnh Hib phần nhiều xảy trẻ từ tháng đến tuổi, với trẻ lớn dường xuất đặc biệt xảy với đối tượng tuổi [19], [11], [16] Theo số nghiên cứu Mỹ nước phát triển, nửa (>50%) số trường hợp mắc bệnh Hib viêm màng não (với triệu chứng: sốt, đau đầu cứng gáy) Phần lại xuất với bệnh khác như: viờm mô tế bào, viêm khớp nhiễm khuẩn huyết… [24] Tại Việt Nam theo Phan Lê Thanh Hương tỷ lệ gây bệnh nhiễm trùng nguy hiểm cho trẻ nhỏ, đặc biệt viêm màng nóo Hib chiếm 50% tổng số nguyên nhân vi khuẩn Trong đó, lứa tuổi tháng chiếm tỷ lệ cao 43%; từ 7-12 tháng chiếm 30%; từ 13-18 tháng chiếm 14%; từ 19-24 tháng tuổi chiếm tỷ lệ 7%; từ 25-30 tháng tuổi chiếm 3% 59 tháng tuổi chiếm 2% [1], [5], [7] Ngoài ra, nghiên cứu Mỹ trước năm 1985 nhằm xác định tỷ lệ loại vi khuẩn thường gây viêm màng não là: H influenzae, N meningitidis S pneumoniae theo lứa tuổi cho thấy Hib nguyên nhân hàng đầu trẻ em tuổi đặc biệt trẻ tuổi [24] Xuất phát từ vấn đề trên, thực chuyên đề: “Vai trò gây bệnh viêm màng não mủ cho trẻ tuổi Haemophilus influenzae typ b phương pháp chẩn đoỏn phòng xét nghiệm” nhằm đưa thông tin đặc điểm gây bệnh viêm màng não mủ Hib cho trẻ tuổi phương pháp phát vi khuẩn chẩn đoán viêm màng não mủ phòng xét nghiệm sử dụng Đõy nội dung quan trọng góp phần nâng cao hiệu chẩn đoán, điều trị lâm sàng Chuyên đề thực với mục tiêu: Tìm hiểu vai trò gây viêm màng não mủ cho trẻ tuổi Haemophilus influenzae typ b Tìm hiểu số phương pháp phát Haemophilus influenzae typ b sử dụng chẩn đoán viêm màng não mủ phòng xét nghiệm Chương I VAI TRÒ GÂY VIÊM MÀNG NÃO MỦ CHO TRẺ DƯỚI TUỔI CỦA HAEMOPHILUS INFLUENZAE TYP B 1.1 Đặc điểm sinh bệnh học Hib bệnh viêm màng não mủ H influenzae typ b lây truyền qua tiếp xúc hít phải chất tiết bị nhiễm khuẩn đường hô hấp Sau định cư vùng mũi họng, vi khuẩn gõy nhiễm khuẩn đường hơ hấp, lan tổ chức lân cận xâm nhập vào dòng máu Người ta cho vi khuẩn từ mũi họng vào dòng máu kết vận chuyển thực bào từ niêm mạc vào mạch bạch huyết Trong máu, vi khuẩn H influenzae typ b có vỏ PRP kháng lại tượng đại thực bào hoạt tính bổ thể Ở trạng thái nhiễm khuẩn huyết, vi khuẩn lan tràn vượt qua hàng rào mỏu – não Vị trí mà vi khuẩn từ máu vào dịch não tủy đám rối màng mạch, nơi có phân bố mạch cao Viờm màng não xảy thường có tương quan trực tiếp tới thời gian tính chất nghiêm trọng nhiễm trùng huyết (> 10 đơn vị tạo khuẩn lạc: CFU – Colony Formed Unit) [9] 1.2 Đặc điểm lâm sàng bệnh viêm màng não mủ [9] Trên lâm sàng, viờm màng não H influenzae typ b tiến triển âm ỉ vài ngày, thường phối hợp với nhiễm trùng đường hô hấp đột ngột tiến triển vài Những dấu hiệu triệu chứng viêm màng não vi khuẩn giống hệt triệu chứng dấu hiệu gặp viêm màng não mủ vi khuẩn gây bệnh khác Những dấu hiệu không đặc hiệu, bao gồm: sốt, ngủ gà, kích thích, chán ăn, nơn, suy hô hấp rối loạn tõm thần Đối với trẻ lớn thường có nhức đầu, cứng gáy, sợ ánh sáng Các dấu hiệu Brudzinski, Kernig cứng gáy đặc trưng thấy trẻ 15 tháng tuổi Thêm vào đó, dấu hiệu khu trú xuất sớm, có đến 1/3 số bệnh nhõn bị co giật trước nhập viện Tỷ lệ tử vong viêm màng não H influenzae typ b khoảng 5% tỷ lệ mắc bệnh kéo dài 15 – 30% 1.3 Tỷ lệ Hib gõy bệnh viêm màng não mủ trẻ tuổi từ nghiên cứu nước H influenzae typ b xác định nguyên phổ biến gây bệnh nhiễm khuẩn trẻ em Viêm màng não chiếm 50% bệnh nhiễm trùng xâm hại H influenzae typ b, viêm phổi (12 – 17%), viờm mụ tế bào (6 – 15%) nhiễm trùng huyết riêng lẻ (2 – 11%) Viêm xương tủy, viêm khớp, viêm màng ngồi tim xảy phổ biến Người lớn khỏe mạnh mắc bệnh xâm hại Hib [9] H influenzae Viêm màng não (Hib) Viêm tai (Hi khơng có vỏ) Viêm xoang (Hi khơng có vỏ) Viêm nắp quản (Hib) Viêm khí quản (Hi khơng có vỏ) Nhiễm trùng huyết (Hib) Viêm phổi (Hib Hi khơng có vỏ) Hình 1.1: Phân bố vị trí nhiễm trùng Hib Hi khơng có vỏ số quan [35] Hầu hết tỷ lệ mắc bệnh tỷ lệ chết cao H influenzae typ b toàn giới xảy trẻ tuổi Vai trò Hib gây viêm màng não cần chứng minh có tầm quan trọng so với nhiễm trùng quan khác thể Vì vậy, tỷ lệ Hib gây viêm màng não cho trẻ tuổi dùng tiêu chuẩn đánh giá so sánh gánh nặng bệnh tật Hib nước [56] Theo tổ chức Y tế giới (WHO), sau phân tích kết 229 nghiên cứu điều tra thông tin viêm màng não Hib trẻ tuổi nhiều nước giới với 30.000 trẻ mắc viêm màng não 2.100 trường hợp tử vong Kết nghiên cứu xác định từ địa điểm Tổ chức y tế giới quan tâm (WHO regions), cụ thể 43 (19%) từ châu Phi, 44 (19%) từ châu Mỹ, 23 (10%) từ phía Đơng Địa Trung Hải, 72 (31%) từ châu Âu, 12 (15%) từ Đông Nam châu Á 35 (15%) từ Đơng Thái Bình Dương Trong đó, 62% 229 nghiên cứu thực nước phát triển [56] 1.3.1 Hib nguyên hàng đầu gây viêm màng não cho trẻ tuổi - Những nghiên cứu nước: Viêm màng não mủ bệnh nhiễm trùng hệ thần kinh trung ương hay gặp trẻ em Việt Nam Theo thống kê Viện Nhi Trung Ương 10 năm (1983-1992) có 1.958 bệnh nhân viờm màng não mủ vào viện, đứng hàng thứ sáu bệnh nhiễm trùng phải nhập viện Trên giới, bệnh có xu hướng giảm dần nước phát triển song không thay đổi nước phát triển, đặc biệt nước Châu Phi [1], [2], [5] Tại Việt Nam, viêm màng não nguyên vi khuẩn Hib quan tâm vào năm trước 2000 Vì vậy, nghiên cứu viêm màng não Hib Việt Nam chưa nhiều Tuy nhiên, nghiên cứu Phạm Nhật An cộng năm 2001 [2] với tất bệnh nhân từ đến 15 tuổi chẩn đoán viờm màng não mủ vào điều trị Viện Nhi Trung Ương từ tháng 12 năm 1998 đến tháng 12 năm 1999, cho thấy kết nguyên gây viêm màng não xác định trẻ em nói chung theo thứ tự hay gặp là: H influenzae (50%), S pneumoniae (22,06%), N meningitidis (11,76%), Streptococcus (5,88%), Klebsiella (4,22%), E coli, Staphylococcus, P aeruginosa Serratia spp (47%) cho dù chưa có điều kiện xác định chi tiết typ huyết loại vi khuẩn Như vậy, H influenzae, S pneumoniae, N meningitidis nguyên gây viờm màng não mủ hay gặp trẻ em (83,82%) Trong đó, hàng đầu H influenzae (50%) Gần đõy, số nghiên cứu khác Phan Lê Thanh Hương, Đặng Đức Anh cộng vai trò gây viêm màng não mủ Hib trẻ tuổi Hà Nội số tỉnh phía Bắc từ 2000 - 2002 cho thấy Hib đứng đầu nguyờn gõy viêm màng não mủ cho trẻ tuổi vi khuẩn, chiếm 48,8%[1], [5] - Những nghiên cứu nước ngoài: Tại nước châu Á, theo nghiên cứu nhiều nước Peltola H năm 1999 cho thấy Hib nguyên hàng đầu gây viờm màng não, cụ thể, Hib chiếm 34%, S pneumoniae chiếm 23%, N meningitidis chiếm 14%, Salmonella chiếm 4% 25% loại vi khuẩn khác Ngoài ra, nghiờn cứu Yang Y Hefei - Trung Quốc cho thấy viờm màng não Hib chiếm 51,7%; N meningitidis (Nm) 38,3%, S pneumoniae (Sp) 8,3% [41], [57]; Đài Loan Hib chiếm 42% tỷ lệ nguyên gây viờm màng não [33], [37] Những nước khỏc giới, hầu hếu nghiên cứu cho thấy Hib nguyên chủ yếu gây viờm màng não Điển nghiên cứu Mỹ năm 1990 cho thấy vi khuẩn hàng đầu gây viêm màng não mủ cho trẻ tuổi là: Hib, S pneumoniae, N meningitidis chiếm tỷ lệ 45%, 18% 14% [39]; Oman năm 2008 vi khuẩn Hib, S pneumoniae, N meningitidis gây viờm màng não chiếm tỷ lệ 22%, 15% 11% [36] Tuy nhiên, nước đưa vacxin phịng Hib vào chương trình tiêm chủng quốc gia tỷ lệ viờm màng não Hib trẻ tuổi giảm xuống thấp, xuống tới gần 0% [21] 1.3.2 Tỷ lệ mắc bệnh viêm màng não Hib trẻ tuổi: - Những nghiên cứu nước: Theo nghiên cứu dịch tễ học viêm màng não vi khuẩn dựa cộng đồng Hà Nội (Phan Lê Thanh Hương, Đặng Đức Anh), cho thấy viêm màng não Hib trẻ tuổi 10/100.000, lứa tuổi 1-23 tháng chiếm tỷ lệ 26/100.000 [1], [2], [7], [42] - Những nghiên cứu nước ngồi: Qua phân tích số liệu từ 229 nghiên cứu toàn giới viêm màng não Hib, kết tỷ lệ viêm màng não Hib trẻ tuổi trung bình 22,8/ 100.000 (với trung vị 18 dao động khoảng 0,9 – 94,6) [55] Trong đó, số nước phát triển giới thời kỳ trước sử dụng vacxin, tỷ lệ mắc viêm màng não Hib báo cáo chiếm khoảng 11 – 50/100.000 lứa tuổi – tuổi [33], [56] Ở nước châu Á, theo nghiên cứu nhiều nước Peltola H năm 1999 cho thấy tỷ lệ mắc viêm màng não Hib trẻ tuổi vào khoảng 25/100.000 Cụ thể, nước châu Á Trung Quốc, Thái Lan có nhiều nghiên cứu cho kết tương tự là: 19,2/100.000 (năm 1996) [57], 26,6/100.000 (2004) [43] Tuy nhiên, nghiên cứu năm 2000 Philippin Ấn Độ cho thấy tỷ lệ cao, 95/100.000 (1994 - 1996) [28], 86/100.000 (2008) [33] Tỷ lệ mắc bệnh viêm màng não Hib giảm cách đáng kể nước đưa vacxin phịng Hib vào chương trình tiêm chủng quốc gia Minh chứng cho vấn đề này, số nghiên cứu Isarel, Đài Loan cho thấy tỷ lệ mắc VMN Hib trẻ tuổi giảm xuống khoảng Số bệnh nhân 100.000 dân 5/100.000 sau sử dụng vacxin phòng Hib nước [37] Biểu đồ 1.1: Tỷ lệ viêm màng não theo lứa tuổi nguyên nhân H influenzae, N meningitidis S pneumoniae trước năm 1985 Mỹ [35] 1.3.3 Phân bố tỷ lệ viêm màng não Hib theo nhóm tuổi: - Những nghiên cứu nước: Tuổi trường Theo Phan Lê Thanh Hương, tất (Tháng) hợp viêm màng não mủ Hib tập trung lứa tuổi từ – 23 tháng (88%) [5], [7], [42] - Những nghiên cứu nước ngoài: Qua nghiên cứu tổng thể tỷ lệ viêm màng não Hib nhiều nước giới, nhỡn chung viêm màng não Hib trẻ tuổi có phân bố khác nhóm tuổi, sau: 1-5 tháng chiếm 22,6%; 6-11 tháng chiếm 35,6%; 12-23 tháng chiếm 23,8% Tuy nhiên, qua thống kê từ nghiên cứu cho thấy lứa tuổi từ 0-11 tháng có tỷ lệ viêm màng não Hib cao [56] Cụ thể, điều tra tiến cứu thực từ năm 1997-1999 Ấn Độ để đánh giá tỷ lệ mắc viêm màng não Hib, cho thấy: lứa tuổi từ – 15,9/100.000 (trong đó, lứa tuổi từ 24 – 59 tháng 7,1/100.000; lứa tuổi từ – 11 tháng 32/100.000 lứa tuổi từ 12 – 23 tháng 19/100.000) [34] 1.3.4 Tỷ lệ tử vong viêm màng não nguyên Hib trẻ tuổi: Tại Việt Nam, tác giả Phan Lê Thanh Hương cho thấy tỷ lệ tử vong viêm màng não Hib 3% di chứng nặng Hib (như: điếc-nghễnh ngóng, mự-giảm thị lực, chậm phát triển tâm thần, động kinh, não úng thủy trạng thái thực vật) chiếm 13% [5] Điều cho thấy gánh nặng bệnh tật Hib gây lớn cho gia đình bệnh nhân mà cịn cho tồn xã hội Trên giới, điều tra phân tích kết 229 nghiên cứu VMN Hib trẻ tuổi, cho thấy tỷ lệ tử vong trung bình 13,8% (với trung vị 10% dao động khoảng 0,0 – 65%) Trong đó, tỷ lệ chết trung bình 17,3% nước phát triển, so sánh với 3,2% nước cơng nghiệp Ngồi ra, tỷ lệ chết thấp châu Âu 4,1% cao châu Phi 27,6% [56] 1.4 Vai trò yếu tố miễn dịch ảnh hưởng đến tỷ lệ viêm màng não mủ Hib lứa tuổi 1.4.1 Yếu tố miễn dịch: [10] Sự cảm thụ với nhiễm khuẩn Hib gia tăng trẻ sơ sinh trẻ nhỏ, nguyên nhân trực tiếp thể khơng có đầy đủ kháng thể kháng PRP Nồng độ kháng thể kháng PRP huyết liên quan đến lứa tuổi, mức độ cảm thụ Hib tương quan trực tiếp với lứa tuổi Trẻ sơ sinh có kháng thể thu tạm thời IgG kháng PRP mẹ truyền qua rau thai, giảm dần sau tháng thứ Miễn dịch tự nhiên thu thường không xảy trước lứa tuổi từ đến tuổi Vì vậy, trẻ em lứa tuổi tháng đến tuổi có nguy cao dễ mắc bệnh xâm nhập Hib Cho nên, 10 thực tế, tỷ lệ viêm màng não Hib không đồng nhóm tuổi mà gặp nhiều lứa tuổi 23 tháng [5], [7], [38] Kháng thể kháng PRP thu kết định cư Hib bề mặt niêm mạc Nhiều trẻ em phát triển tự nhiên kháng thể kháng PRP không nhiễm chủng typ b Điều kết định cư vi khuẩn cú cỏc kháng nguyên vỏ gây phản ứng chéo, nhiễm vi khuẩn đường ruột Escherichia coli K100 Trẻ em tuổi có nồng độ kháng thể kháng PRP thấp không phát thấy đáp ứng với nhiễm khuẩn Hib vacxin vỏ PRP Những kháng thể kháng lại kháng nguyên thân (antisomatic) hay loại kháng nguyên protein đáp ứng lây nhiễm chủng Hi khơng có vỏ bị phản ứng chéo với chủng Hi có vỏ Miễn dịch thụ động kháng thể có tác dụng lên phần oligosaccharide Haemophilus có tác dụng bảo vệ gây bệnh thực nghiệm, diện chúng huyết giai đoạn cấp số trẻ sơ sinh bị nhiễm khuẩn H influenzae typ b khêu gợi chúng khơng có tác dụng bảo vệ bệnh cảnh lâm sàng [10] 1.4.2 Vai trò vacxin phòng Hib phòng bệnh viêm màng não mủ cho trẻ tuổi Hib Vacxin phòng Hib triển khai lần vào cuối năm 1985 nhằm để giải mối quan tâm chính, là: tỷ lệ tử vong cao bệnh nhiễm trùng Hib gây ra, di chứng nặng nề trẻ viêm màng não mủ Hib xảy với tỷ lệ cao gia tăng đề kháng vi khuẩn với kháng sinh thông dụng Kháng thể kháng PRP huyết biết yếu tố để bảo vệ thể trước nguy cơng Hib Vì vậy, nỗ lực thực để tăng nồng độ kháng thể máu cách sử dụng vacxin sản xuất từ vỏ polysaccharide tinh chế Trong vacxin PRP có hiệu bảo vệ trẻ từ 18 tháng tuổi trở lên chống lại bệnh 22 trực khuẩn, trực khuẩn mảnh dài sợi chỉ) đõy dấu hiệu gợi ý quan trọng định hướng chẩn đoán VMN Hib Thời gian vận chuyển phịng thí nghiệm >1h Thời gian vận chuyển phịng thí nghiệm ≤1h Dịch não tủy ≤1h >1h Ly tâm dịch não tủy 2000 vịng/ phút × 20 phút Cấy vào môi trường T-I Nước Cặn Ngưng kết hạt latex Nhuộm Cấy lên thạch Gram chocolate Ủ 35oC 5- 10% CO2 Cấy lên thạch chocolate 23 Sơ đồ 2.1: Quy trình xét nghiệm chẩn đốn bệnh phẩm dịch nóo tủy [15] Hình 2.5: Hình thể H influenzae typ b tiêu nhuộm gram dịch não tuỷ kính hiển vi quang học 2.1.1.3 Ni cấy (1) (2) Hình 2.6: Hình ảnh khuẩn lạc Streptococcus pneumoniae (1) Haemophilus influenzae typ b (2) 24 Lấy đầy ăng cặn bệnh phẩm nuôi cấy vào môi trường thạch chocolate có bổ sung IsoVitalex Ủ 37oC với khí trường 5% CO2 khoảng 1824 Nếu có khuẩn lạc mọc đĩa thạch chocolate sau ủ, quan sát hình thái, khuẩn lạc Hib thường có đặc điểm: khuẩn lạc có kích thước 1,0-1,5 mm sáng bóng, nhày ướt, óng ánh ánh sáng chiếu vào khụng gõy tan máu Ngồi ra, mơi trường ni cấy vi khuẩn thường có mùi hăng đặc biệt (hăng indole) 2.1.1.4 Xác định - Nhuộm gram: khuẩn lạc vi khuẩn nuôi cấy đĩa thạch chocolate từ dịch não tủy, nhận thấy tiêu có trực khuẩn gram (-) nhỏ, đa hình thái (có thể dạng cầu trực khuẩn, trực khuẩn mảnh dài sợi chỉ) - Tiến hành thử nghiệm xác định nhu cầu đòi hỏi yếu tố phát triển X V: + Thử nghiệm X, V dương tính + Hoặc thử nghiệm “Vệ tinh” với chủng S aureus ATCC cho kết dương tính 25 Hình 2.7: Thử nghiệm với khoanh giấy X, V XV, cho thấy vi khuẩn địi hỏi bắt buộc phải có yếu tố X V cho phát triển Hình 2.8: Thử nghiệm "vệ tinh" dương tớnh - Tiến hành định typ huyết để xác định Hib kháng huyết mẫu [14] (+) (-) 26 Hình 2.9: Phản ứng ngưng kết huyết định typ H influenzae - Tiến hành xác định typ sinh học chủng Hib phân lập xác định tớnh chất sinh vật hóa học Api 10s (bioMộrieux) [7] Hình 2.10: Thanh xác định tớnh chất sinh vật hóa học Api 10s 2.1.2 Phương pháp nuôi cấy phân lập xác định vi khuẩn Hib từ bệnh phẩm máu Trong chẩn đốn VMNM, ngồi bệnh phẩm dịch não tủy thường sử dụng chẩn đốn bệnh phẩm máu sử dụng với tỷ lệ dương tính cao [6], [15] Nhiễm trùng truyền từ bệnh nhân sang nhân viên y tế ngược lại trình lấy máu Trong đú, yếu tố virus xem mối nguy hiểm nhất, cụ thể virus gây viêm gan HIV Vì vậy, trình lấy máu phải đảm bảo ngun tắc vơ khuẩn 2.1.2.1 Quy trình cấy máu gồm bước sau: [15] - Chuẩn bị đầy đủ dụng cụ, bao gồm: găng tay, bơm kim tiêm vô khuẩn, dây garo, gạc vuụng, bụng vờ trũn vô khuẩn, băng vết thương nhỏ, môi trường cấy máu dung dịch sát khuẩn (cồn iod povidone-iodine, dùng cồn 70o) Kích thước kim phụ thuộc vào vị trí lấy bệnh phẩm 27 kích thước tĩnh mạch Kim cỡ 23, tức dài 20 – 25mm kim bướm thường dùng cho trẻ em - Chọn cánh tay buộc dây garo phía vị trí cần lấy máu để ngăn dòng chảy máu tĩnh mạch Tĩnh mạch lớn cẳng tay loại tĩnh mạch thường lựa chọn - Rửa vùng da định lấy máu cồn 70 o sau sát khuẩn cồn iod povidone-iodine Để khô Nếu cần phải bắt tĩnh mạch lại phải sát trùng nơi lấy bệnh phẩm lần - Sau sát trùng da để khô, chọc kim vào tĩnh mạch với mặt nghiêng mũi kim ngửa lên Khi kim vào tĩnh mạch, hút máu cách rút từ từ pittong, đặn Chú ý: không khơng khí lọt vào tĩnh mạch - Sau hút đủ lượng máu cần thiết (1-2 ml để cấy vào 20ml môi trường canh thang dinh dưỡng), tháo bỏ dây garo đặt viên bụng trịn vơ khuẩn tẩm cồn lên phía mũi kim Rút bơm kim tiêm đặt cố định viờn bụng trũn vị trí lấy máu khơng cịn chảy máu - Bơm máu vào môi trường dùng để cấy máu theo nguyên tắc vô trùng (thông thường nên sử dụng chai cấy máu có mơi trường pha chế sẵn Hãng Becton – Dickinson) [6] - Đặt băng nhỏ lên vết thương Ngay vận chuyển bình cấy máu phịng xét nghiệm vi sinh Bình cấy máu giữ nhiệt độ phòng (20o – 25oC) khoảng 4-6 trước ủ ấm 35o – 37oC, thông khí với khí trường – 10% CO2 Chú ý: Bình cấy máu khơng giữ tủ lạnh Ủ ấm q trình vật chuyển sử dụng nhiệt độ 25o – 35oC 28 - Trong số trường hợp cần lấy máu để thực phương pháp chẩn đoán khỏc, nờn lấy vào ống nghiệm chân khơng vơ trùng 2.1.2.2 Theo dõi chẩn đốn bình cấy máu [15] Bình cấy máu kiểm tra sau 14 – 17 ủ tủ ấm sau theo dõi hàng ngày cho hết ngày Bất có xuất đục hay tan máu mơi trường cho thấy cấy máu (+), lắc bình cấy máu cấy chuyển sang đĩa thạch chocolate Quá trình cấy chuyển thực sau: - Sát khuẩn nút cao su chai cấy máu cồn 70 o povidoneiodine - Hút 0,5 ml từ môi trường cấy máu bơm kim tiêm vô trùng nhỏ lờn gúc (gần rìa đĩa Petri) đĩa mơi trường chocolate Sử dụng que cấy vô trùng ria cấy theo phương pháp phân vùng Ủ đĩa thạch 37oC với khí trường 5% CO2 khoảng 18-24 Nếu đĩa thạch co khuẩn lạc Hib mọc, tiến hành xác định Hib typ sinh học (như phần 2.1.1.4) 2.2 Phương pháp phát kháng nguyên đặc hiệu Hib dịch não tủy phương pháp ngưng kết hạt latex [6], [15] 2.2.1 Nguyên lý: Phát kháng nguyên vỏ polysaccharide đặc hiệu Hib dịch não tủy kháng thể (đơn giá) kháng vỏ đặc hiệu với Hib gắn hạt latex Kết quả: phản ứng dương tính hỗn dịch làm phản ứng xuất hạt ngưng kết lam kính; phản ứng âm tính khơng có tượng ngưng kết xảy 2.2.2 Thực kỹ thuật: 2.2.2.1 Dụng cụ, hóa chất: - Pasteurex Meningitis Hib (KHT đa giá) 29 - Bio - Rad meningite KIT (HT đa giá) Hình 2.11: Bộ KIT chẩn đoán Pasteurex Meningitis 2.2.2.2 Tiến hành kỹ thuật - Tiến hành ly tâm dịch não tủy 20 phút với tốc độ 2000 vũng/ phỳt - Dùng pippett nhỏ giọt vô trùng hút nước chuyển sang ống nghiệm vơ trùng có nắp đậy - Đun nóng nước DNT nồi cách thủy nhiệt độ 100oC/5 phút - Lắc lọ kháng thể mẫu có gắn hạt latex có dung dịch - Nhỏ giọt loại kháng thể mẫu gắn hạt latex lên lam kính vịng trịn khoanh bút viết kính phiến giấy dùng lần để thực phản ứng ngưng kết - Nhỏ 30 – 50 àl dịch não tủy vào loại kháng thể mẫu nhỏ lên lam kính phiến giấy - Xoay trịn lam kính phiến giấy làm phản ứng – 10 phút (hoặc dựng mỏy lắc tròn với tần số 100 vũng/ phỳt) 2.2.2.3 Đọc kết 30 - Phản ứng âm tính: huyền dịch làm phản ứng đục sữa có màu sữa nhạt - Phản ứng dương tính: xuất hạt ngưng kết xảy vòng phút sau thực phản ứng (+) (-) Hình 2.12: Kết phản ứng ngưng kết sử dụng KIT chẩn đoán Pasteurex Meningitis 2.3 Phương pháp phát kháng nguyên đặc hiệu Hib dịch não tủy kỹ thuật điện di đối lưu [6] 2.3.1 Nguyên lý: Kháng nguyên tích điện âm từ giếng phía cực âm kháng thể tích điện dương từ giếng phía cực dương (các Ig pH 8,4 di chuyển cực âm hệ mao dẫn theo lực điện thẩm thấu nội) di chuyển ngược chiều nhau, gặp hình thành đường tủa đặc hiệu gel (thạch điện di) 2.3.2 Thực kỹ thuật: 2.3.2.1 Dụng cụ, hóa chất: - Dụng cụ: Phiến kính 7ì7cm, bàn mức phẳng ngang, đục lỗ thạch, máy điện di, nguồn cung cấp điện, lị vi sóng - Hóa chất + Kháng huyết thỏ kháng Hib 31 + Kháng nguyên chuẩn polysaccharide Hib (NIH – Mỹ) + Thạch điện di (Sigma); hóa chất pha thạch đệm điện di (đệm Bacbital – Sigma) / Thạch nền: agarose thường pha 3% nước cất / Thạch điện I (type I - Sigma): 1% đệm bacbital pH 8,4 2.3.2.2 Tiến hành kỹ thuật - Phủ lớp mỏng thạch lên phiến kính, phơi khơ - Đặt phiến kớnh lờn bàn mức ngang đổ thạch 1% lên (6ml cho phiến kớnh 7ì7cm) Để khơ, đục giếng thạch với kích thước sau: đường kính đĩa khoảng 2-3mm; khoảng cách từ giếng kháng thể đến giếng bệnh phẩm 5mm - Nhỏ hàng kháng thể (kháng huyết thanh) 5àl/ giếng; hàng nhỏ 5àl bệnh phẩm (dịch não tủy); chứng dương 5àl polysaccharide typ b Hib + 1àl thuốc nhuộm Bromophenol - Đặt vào bể điện di, chạy với tốc độ 8mA/30 phút - Đọc kết sau 1-3 dừng chạy điện di, dương tính thấy vạch tủa trắng gần phía giếng kháng thể (cực dương) 2.4 Phương pháp phát đoạn ADN đặc hiệu Hib dịch não tủy kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) PCR biết kỹ thuật chẩn đoán cho kết nhanh, nhạy đặc hiệu với Hib DNT Hơn nữa, nâng cao tối đa quản lý trường hợp viêm màng não để giảm tỷ lệ trầm trọng, tỷ lệ chết phức tạp điều trị bệnh nhiễm trùng xâm hại Hib Tại sở xét nghiệm lâm sàng, kỹ thuật PCR truyền thống thường dùng chẩn đoán Hib Tuy nhiên, kỹ thuật RT-PCR sử dụng phân loại xác định Hi nói chung Hib nói riêng với độ nhạy độ đặc hiệu cao [30], [31], [34] 32 2.4.1 Kỹ thuật PCR truyền thống [34] 2.4.1.1 Hóa chất sinh phẩm - Enzyme Taq ADN Polymerase 2.5U - dNTPs gồm : ATP, TTP, GTP, CTP - Cặp mồi (primer): Cặp mồi sử dụng để xác định Hib Haem Right: + Primer 1: 5’ CAGTAAATACACCTGTTGCCCCTG 3’ + Primer 2: 5’ GCCATTCATCAAATA 3’ Cặp mồi tương tự bổ sung với trình tự acid nucleic vùng bảo tồn gen “hpD” đặc hiệu cho typ huyết b Hi Cả hai mồi bao gồm khoảng 24 bases - Thang ADN mẫu dùng diện di gen - Đệm, nước khử ion MgCl2 25mM 2.4.1.2 Các bước chẩn đoán PCR: - Tách chiết ADN Hib dịch não tủy + Bằng kỹ thuật vô trùng lấy 100àl DNT cho vào ống ly tõm sạch, vô trùng + Cho ống nghiệm chứa DNT cho vào nồi cách thủy đun sôi 15 phút + Ly tõm ống nghiệm bệnh phẩm DNT (sau đun cách thủy) với tần số 10000 vịng/ phút ì phút + Lấy 10àl nước sau ly tõm sử dụng để làm mẫu ADN - Tiến hành kỹ thuật / Phản ứng PCR thực với tổng thể tích 50àL, chứa: 1,5 àL (1,5mM) MgCl2; àL (0,2 mM) dNTP; àL (1X) 10X PCR buffer (KCl, Tris-HCl, Mg); 0,5 àL (2,5U) Taq ADN polymerase; 10 àL ADN 33 mẫu Haemophilus influenzae (ATCC 35056 Difco làm chứng dương), 40 àL nước khử ion cặp mồi (mồi 1,2: àL 40pm) cho ống / Hỗn hợp phản ứng chạy theo chương trình cài đặt máy điều nhiệt (Ependorff, Germany) khoảng 35 chu kỳ, chu kỳ cú cỏc thông số đây: giai đoạn biến tính khoảng phút 94 oC; giai đoạn gắn mồi khoảng phút 56oC; giai đoạn kéo dài khoảng phút 72oC Trong đó, giai đoạn biến tính cần 10 phút 94 oC giai đoạn kéo dài cuối phút 72oC Sau kết thúc 35 chu kỳ, mẫu ADN sau khuếch đại giữ 4oC phân tích Sản phẩm phản ứng PCR để chẩn đoán Hib phát thạch điện di agarose 2.4.2 Kỹ thuật Real-time PCR [6][31] 2.4.2.1 Hóa chất sinh phẩm - QIAamp blood kit (Qiagen, Hilden, Germany) - Mồi (primer): + Mồi xuôi: 5’-CAAGATACCTTTGGTCGTCTGCTA-3’ (vị trí 5481 đến 5504) + Mồi ngược: 5’-TAGGCTCGAAGAATGAGAAGTTTTG-3’ (vị trí 5631 đến 5607) - Probe đặc hiệu: 5’-ATGATATGGGTACATCTGTT -3’ (vị trí 5563 đến 5582) 2.4.2.2 Các bước chẩn đốn RT-PCR [31] - Tách chiết ADN: Tách chiết ADN Hib từ dịch não tủy dựa vào QIAamp blood kit (Qiagen, Hilden, Germany) theo quy trình nhà sản xuất 34 - Tiến hành kỹ thuật Phản ứng khuếch đại thực với hỗn hợp phàn ứng tích tổng 25àL, chứa 2ìTaqMan universal master mix (Perkin-ElmerBiosystems), primer với nồng độ 400 nM, 200 nM probe, àl ADN tách chiết Quá trình khuếch đại PCR thực nhiều mẫu giống dựa hệ thống phát trình tự ABI PRISM 7700 Các thơng số chuẩn cho q trình khuếch đại: phút 50 oC, 10 phút 95oC cho 40 chu kỳ; với chu kỳ gồm 15 giây 95oC phút 60oC Kết phản ứng RT-PCR phân tích phần mềm cho hệ thống phát trình tự, phiên 1.7 2.5 Đánh giá kỹ thuật phát Hib chẩn đốn viêm màng nóo Giá trị chẩn đoán kỹ thuật phát Hib gây viêm màng nóo giới thiệu có số nghiên cứu, đánh giá cho thấy độ nhạy, độ đặc hiệu phương pháp - Phương pháp ni cấy chẩn đốn Hib thường có độ nhạy khơng cao phương pháp khác tuỳ thuộc vào trình độ, trang thiết bị kỹ thuật phịng xét nghiệm (trung bình khoảng 50 – 55%), độ đặc hiệu 100% Ngoài ra, phương pháp cũn giỳp cho nhà vi sinh xác định mức độ nhạy cảm với kháng sinh chủng Hib gây bệnh phân lập mà phương pháp khác thường không thực [6] - Phương pháp phát kháng nguyên đặc hiệu Hib dịch não tủy phương pháp ngưng kết hạt latex có độ nhạy 95%, độ đặc hiệu 99,6% [6] - Phương pháp phát kháng nguyên đặc hiệu Hib dịch não tủy kỹ thuật điện di đối lưu có độ nhạy 97%, độ đặc hiệu 100% [6] 35 - Phương pháp phát đoạn ADN đặc hiệu Hib dịch não tủy kỹ thuật PCR có độ nhạy 100%, độ đặc hiệu 99% [6], [31] KẾT LUẬN Tại Việt Nam số nước giới, chưa có điều kiện đưa vacxin phịng Hib vào chương trình tiêm chủng mở rộng vi khuẩn Hib xác định nguyên hàng đầu gây viêm màng não mủ cho trẻ tuổi Trong đó, lứa tuổi thường gặp 24 tháng Vi khuẩn Hib nhạy cảm (gần 100%) với kháng sinh sulbactam/ampicilin, ceftriaxon, cefaclor, cefotaxim, cefpodoxim, meropenem, levofloxacin, rifampicin, azithromycin, clarithromycin; trái lại đề kháng với tỷ lệ lớn với ampicillin, chloramphenicol cotrimoxazole Hiện nhiều kỹ thuật xét nghiệm áp dụng để chẩn đoán viêm màng nóo Hib phịng xét nghiệm Những kỹ thuật cho kết 36 nhanh có độ nhạy độ đặc hiệu cao chẩn đoán Hib phải nhắc đến phương pháp ngưng kết hạt latex, kỹ thuật điện di đối lưu tìm kháng nguyên đặc hiệu; kỹ thuật phát đoạn ADN đặc hiệu Hib dịch não tủy kỹ thuật PCR từ dịch não tủy Bên cạnh đó, phương pháp ni cấy xác định Hib truyền thống cũn có vai trị lớn chẩn đoán, đặc biệt giúp cho nhà vi sinh lâm sàng xác định mức độ nhạy cảm với kháng sinh vi khuẩn ... Tìm hiểu vai trò gây viêm màng não mủ cho trẻ tuổi Haemophilus influenzae typ b Tìm hiểu số phương pháp phát Haemophilus influenzae typ b sử dụng chẩn đoán viêm màng não mủ phịng xét nghiệm 3... xét nghiệm 3 Chương I VAI TRỊ GÂY VIÊM MÀNG NÃO MỦ CHO TRẺ DƯỚI TUỔI CỦA HAEMOPHILUS INFLUENZAE TYP B 1.1 Đặc điểm sinh b? ??nh học Hib b? ??nh viêm màng não mủ H influenzae typ b lây truyền qua tiếp... đặc điểm gây b? ??nh viêm màng não mủ Hib cho trẻ tuổi phương pháp phát vi khuẩn chẩn đoán viêm màng não mủ phòng xét nghiệm sử dụng Đõy nội dung quan trọng góp phần nâng cao hiệu chẩn đoán, điều