Nghiên cứu ni cấy, biệt hóa tế bào gốc sinh tinh từ bệnh nhân azoospermia TÓM TẮT: Các tế bào dòng tinh phân lập collagenase IV nuôi cấy môi trường Gamete bổ sung FSH với nồng độ 50 IU l -1 testosterone với nồng độ 1mmol l-1, nhiệt độ 320C, nồng độ CO2 5%, thời gian 24 Kết nghiên cứu cho thấy: - Collagenase IV có tác dụng tốt q trình phân lập tế bào dịng tinh - Số lượng tinh tử kéo dài, tinh tử kéo dài tinh trùng tăng, số lượng tinh tử trịn giảm sau 24h ni cấy - Tỷ lệ tinh trùng tinh tử kéo dài di động tăng đáng kể sau nuôi cấy - Có thể tạo phơi với tinh trùng thu sau nuôi cấy nhờ kỹ thuật vi tiêm SUMMARY: STUDY ON IN-VITRO CULTURE OF SPERMATOGENIC CELLS WERE ISOLATED BY COLLAGENASE IV FROM AZOOSPERMIC PATIENTS Spermatogenic cells were isolated by collagenase IV and cultured in Gamete medium supplemented with 50 IU l-1 of FSH plus 1mmol l-1 The medium were maintained in the culture at 320C with 5% CO2 in air for 24 hours The results showed that: It is effective in the treatment of azoospermic men - Collagenase IV is effective in the isolation of spermatogenic cells - The number of elongating spermatids, elongated spermatids and spermatozoa was increased But the number of round spermatids reduced during the first day of culture - Significant improvement of the rate of motile spermatozoa and motile elongated spermatids was observed after 24 hours - An embryo was created after micromanipulation-assisted fertilization with in- vitro-cultured testicular spermatozoa ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Azoospermia tình trạng khơng có tinh trùng tinh dịch Trong bệnh nhân azoospermia azoospermia không tắc chiếm tỷ lệ đáng kể, khoảng 50% Các bệnh nhân khơng thể có khơng có tinh trùng, tinh tử trưởng thành mào tinh hay ống sinh tinh Ngày nay, với tiến lĩnh vực khoa học nuôi cấy tế bào, kỹ thuật hỗ trợ sinh sản, việc nghiên cứu ni cấy tế bào dịng tinh có ý nghĩa vơ quan trọng, mở hướng điều trị cho bệnh nhân nhóm Chính vậy, chúng tơi tiến hành đề tài với mục tiêu: Xây dựng quy trình phân lập tế bào gốc sinh tinh từ mào tinh hoàn ống sinh tinh bệnh nhân nam giới vơ sinh khơng có tinh trùng Xây dựng quy trình ni cấy biệt hố tế bào gốc sinh tinh thành tinh trùng TỔNG QUAN TÀI LIỆU * Phân lập tế bào dòng tinh - Các nghiên cứu phân lập tế bào dòng tinh nghiên cứu từ lâu Các nghiên cứu tiến hành người động vật Anna cs, 1996 nghiên cứu thành cơng q trình phân lập tế bào dòng tinh, đặc biệt tinh nguyên bào loại A Quá trình tiến hành sau: Chuột Wistar ngày tuổi, trọng lượng thể từ 18-20g chọn để lấy tinh hoàn Tinh hoàn lấy đặt mơi trường MEM (minimum essential medium), có bổ sung glutamine (2nM), HEPES (15mM), số amino acid, penicillin (100IU/ml), streptomycin (100mg/ml), gentamycin (50mg/ml) Sau loại bỏ màng trắng tinh hồn, mơ tinh hồn đưa vào dung dịch ni cấy có khoảng 0,05% collagenase dispase 0,04mg/ml DNase, toàn sản phẩm đặt tủ ấm, nhiệt độ 320C Sau 10 phút thành phần mô liên kết loại bỏ Sản phẩm lại tiếp tục để tủ ấm 15 phút nhằm tách tế bào khỏi màng đáy Sản phẩm lại tiếp tục cho vào môi trường nuôi cấy 20 phút, có 0,5 U/ml heparinase III, 0,3 U/ml chondroitinase ABC, 0,5 mg/ml collagenase IV Sản phẩm thu lại lọc qua màng lọc có kích thước lỗ 70mm, sau 50mm Sau rửa lần, ly tâm 800 vòng/phút 30 phút, sản phẩm thu tế bào dòng tinh Tác giả nuôi cấy tế bào 320C, nồng độ CO2 5% - Hamra cs, 2008 tiến hành phân lập tế bào dòng tinh dựa vào nguyên tắc: tế bào thân tinh hoàn gắn chặt với collagen môi trường nuôi cấy Trong đó, tế bào dịng tinh, mơi trường ni cấy lại khơng có đặc tính * Ni cấy tế bào dịng tinh - Các nghiên cứu ni cấy tế bào dịng tinh có từ lâu, Steinberger, 1970; Matte, 1971; Ghatnekar, 1974; Curtis, 1981 tác giả tiến hành nuôi cấy tế bào dịng tinh - Tuy vậy, ni cấy tế bào dịng tinh thực có ý nghĩa từ sau năm 1990, kỹ thuật vi thao tác áp dụng - Ngày nuôi cấy tế bào dịng tinh với mục đích:  Biệt hóa tế bào dòng tinh  Lựa chọn tế bào khỏe mạnh + Đối với azoospermia không tắc: - Zhu, 1996; Liu, 1997; Balaban, 1999; Cremades, 1999 Sousa, 2002, ni cấy tế bào dịng tinh thu từ TESE nhận thấy: sau 24h nuôi cấy mơi trường có FSH tỷ lệ di động khả thụ tinh tinh trùng tăng lên - Aslam Fishel, 1998; Tesarik, 1998; Cremades, 1999 ni cấy tinh tử người có q trình sinh tinh bình thường Kết tinh tử phát triển nhanh với biểu hiện: nhân tụ đặc lại, hình thành phát triển - Terarik, 1998 nhận thấy có mặt FSH testosterone mơi trường nuôi cấy làm tăng nhanh tốc độ biệt hóa - Các nghiên cứu Tesarik vào năm 1999 2000 thu kết tương tự bệnh nhân azoospermia không tắc - Năm 1999, đứa trẻ đời từ tinh tử nuôi cấy (Tesarik) - Cho đến nay, có nhiều phương pháp ni cấy tế bào dòng tinh khác Tesarik, 2006 tiến hành ni cấy tế bào dịng tinh với tế bào Sertoli, điều kiện nhiệt độ từ 30-320C, với chất khác FSH, LH Sousa, 2006 tiến hành ni cấy tế bào dịng tinh sau phân lập chọn lựa dựa vào kỹ thuật vi thao tác Một số tác giả khác ni cấy tế bào dịng tinh với tế bào Vero - Huleihel cs, 2007 tiến hành nuôi cấy tinh nguyên bào với tế bào Sertoli, dung dịch ni cấy Mơi trường ni cấy ngồi nội tiết tố bổ sung chất GDNF (glial cell line derived neurotrophic factor), SCF (stem cell factor), LIF (leukemia inhibitory factor) Kết nghiên cứu cho thấy tế bào phân chia tốt - Perrard cs, 2007 tiến tới nuôi cấy tế bào dòng tinh Kết nghiên cứu cho thấy: betaNGF (beta nerve growth factor) có tác dụng trực tiếp đến lần thứ phân bào giảm nhiễm để hình thành tinh tử trịn Chính tác giả nhận thấy số lượng tinh tử tròn tăng nhanh trình ni cấy - Zhang, 2008 tiến hành ni cấy tinh nguyên bào chuột tế bào Sertoli Sau đến ngày nuôi cấy, mơi trường ni cấy thay Kết thí nghiệm cho thấy, sau 24 nuôi cấy phát phân chia tế bào Q trình ni cấy kéo dài 50 ngày - Mito Kanatsu cs, 2008 tiến hành nuôi cấy tinh nguyên bào chuột Hamster thời gian kéo dài Các tinh nguyên bào sau phân lập nuôi cấy mơi trường có NGF, kết nghiên cứu thu tinh tử tròn - Gần số tác giả tiến hành nghiên cứu biệt hoá tế bào mầm gốc phơi thành nỗn tinh trùng Lacham-Kaplan, 2008 Các tác giả thu số thành cơng, nhiên cịn nhiều tồn cần nghiên cứu + Đối với azoospermia tắc: - Các bệnh nhân nhóm có q trình sinh tinh xảy bình thường Thơng thường, bệnh nhân có kích thước tinh hồn, nồng độ FSH, LH testosterone máu bình thường, mào tinh căng, xác định rõ Đặc biệt, thu tinh trùng tinh tử trưởng thành mào tinh qua kỹ thuật PESA, MESA (Silber, 1994) - Tuy vậy, tế bào dòng tinh thu thường chưa trưởng thành hồn tồn, lại khó xác định tế bào sống để lựa chọn Một số tác giả tiến hành nuôi cấy tế bào đạt kết tốt đẹp như: tế bào biệt hóa, trưởng thành hơn, khả xác định tế bào sống cao tỷ lệ thụ tinh sau ICSI tăng đáng kể (Balaban, 1999) * Đặc điểm tế bào thu từ tinh hoàn bệnh nhân azoospermia: - Tinh trùng thường chưa biệt hóa hồn tồn khơng di động nên khó xác định tinh trùng sống việc chọn tinh trùng để làm ICSI - Theo Tesarik, 1998; Jurisicova, 1999; Gandini, 2000; Muratori, 2000, tỷ lệ đứt gãy ADN tinh tử thu từ tinh hồn, đặc biệt tinh tử trịn (round spermatid) cao, nguyên nhân làm giảm tỷ lệ thành công - Nguyên nhân tỷ lệ thụ tinh tinh tử thấp (Tesarik):  Sự chưa hoàn thiện trung thể  Sự chuyển tiếp protein nhân (từ histone thành protamine) chưa hoàn toàn: thiếu hụt protamine cản trở hình thành tiền nhân  Sự thiếu hụt chất kích hoạt nỗn Khơng có tinh trùng tinh dịch (azoospermia) chiếm tỷ lệ đáng kể nguyên nhân vô sinh nam nguyên nhân đáng quan tâm Nhóm azoospermia tắc, bệnh nhân điều trị phương pháp PESAICSI hay MESA-ICSI Nhóm thứ nhóm azoospermia khơng tắc, bệnh nhân khó có khả điều trị TESE-ICSI xin tinh trùng hướng giải cho bệnh nhân nhóm Đối với bệnh nhân azoospermia không tắc, hướng giải xin tinh trùng, giải pháp tình - Chính ni cấy tinh trùng, tinh tử tế bào gốc sinh tinh có ý nghĩa quan trọng việc nâng cao tỷ lệ thụ tinh mang lại hội làm cha cho bệnh nhân azoospermia ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY 3.1 Đối tượng nghiên cứu 3.1.1 Cỡ mẫu: bao gồm 30 bệnh nhân chẩn đoán azoospermia Trung tâm Công nghệ phôi - Học viện Quân y 3.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân: - Bệnh nhân có xét nghiệm nhiễm sắc thể bình thường - Sau tiến hành phương pháp PESA MESA, bệnh nhân xác định khơng có tinh trùng mào tinh - Không tiến hành nuôi cấy trường hợp có tế bào Sertoli ống sinh tinh (hội chứng có tế bào Sertoli) 3.2 Vật liệu phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Vật liệu nghiên cứu: + Kính hiển vi đảo ngược vi thao tác Olympus IX 70 có gắn kính Hoffman Nhật + Tủ ni cấy CO2 Forma, Mỹ + Giếng nuôi cấy Nunc, loại giếng + Các dụng cụ thuỷ tinh: bao gồm lam kính đồng hồ, lam kính thường, lamen + Các hố chất: bao gồm dung dịch Gamete 100, Puregon, testosterone collagenase IV 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu: 3.2.2.1 Phương pháp xét nghiệm tinh dịch đồ (theo WHO, 1999) [8] 3.2.2.2 Phương pháp sinh thiết tinh hoàn mở (theo Thomas Wheeler, 1995) [7] 3.2.2.3 Phương pháp TESE (Testicular Sperm Extraction) (theo Tesarik, 2001 có cải tiến) [6]: - Mẫu tinh hồn thu từ sinh thiết mở tinh hoàn nghiền lam kính vơ trùng - Sản phẩm thu cho vào dung dịch collagenase IV (1000IU/ml) 370C, 30 phút - Cặn lắng thu sau ly tâm rửa cho vào môi trường Gamete 100 3.2.2.4 Phương pháp nuôi cấy tế bào (theo Tesarik, 1998) [5]: - Ni cấy mơi trường Gamete, có bổ sung FSH (50IU/l), testosterone (1mmol/l) - Q trình ni cấy tiến hành bóng tối, nhiệt độ 320C, thời gian 24h 3.2.2.5 Phương pháp tiêm tinh trùng vào bào tương noãn – ICSI (theo Palermo, 1992) [3] 3.2.2.6 Đánh giá số lượng tế bào dịng tinh điều kiện ni cấy: - Xác định tế bào dòng tinh (theo Sousa, 2002) [4] - Xác định số lượng loại tế bào: thời điểm nuôi cấy, giếng nuôi cấy đếm 20 vi trường, vi trường đếm loại tế bào, sau tính số lượng trung bình loại tế bào KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 4.1 Đặc điểm bệnh nhân: Tuổi thời gian vô sinh trung bình bệnh nhân nghiên cứu thể bảng 4.1 Bảng 4.1 Tuổi Thời gian vô sinh (năm) X ± SD X ± SD 34,30 ± 6,52 6,21 ± 3,54 4.2 Kích thước tinh hồn bệnh nhân Bảng 3.2 Nhóm Bệnh nhân Người bình thường P X ± SD 6,03 X k ± 0.05 12 X k 0,05 Số lượng tinh bào II 9,05 ± 4,55 8,76 ± 5,21 >0,05 Số lượng tinh tử tròn 6,39 ± 5,68 3,28 ± 3,01