NGHIÊN CỨU SỰ ĐA HÌNH DI TRUYỀN CỦA MỘT SỐ LOÀI THỰC VẬT THU THẬP TỪ MÃ ĐÀ VÀ CÁT TIÊN (TỈNH ĐỒNG NAI) Hà Thị Phúc, Đặng Quang Hưng, Phạm Bảo Yên, Nguyễn Quang Huy, Nguyễn Vũ Minh Hạnh, Phan Tuấn Nghĩa Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội MỞ ĐẦU Lâm trường Mã Đà thuộc tỉnh Đồng Nai khu vực chịu nhiều tác động yếu tố môi trường khắc nghiệt, đặc biệt tác động chiến tranh hoá học Tuy vậy, cịn cơng trình nghiên cứu tác động lên sinh vật có mặt Trong cơng trình cơng bố gần [4], chúng tơi phát thấy có sai khác hoạt độ vài enzym bảo vệ oxy hoá phổ băng ADN mẫu ốc Bradybaena similaris thu thập từ khu vực so với mẫu ốc loài thu thập từ Vườn Quốc gia Cát Tiên (Tỉnh Đồng Nai) nơi có điều kiện sinh thái tương tự Mã Đà bị tác động chiến tranh hoá học Để tiếp tục đóng góp dẫn liệu cho việc sâu đánh giá tác động điều kiện môi trường lên hệ gen loài sinh vật vùng này, chúng tơi mở rộng nghiên cứu tìm hiểu khác biệt phổ băng ADN số loài thực vật thu thập từ hai vùng vừa nêu Bài báo giới thiệu phần kết thu NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.Nguyên liệu Các mẫu thực vật dùng cho nghiên cứu bao gồm lồi: Trung qn (Ancistocladus tectorius), Quế bì (Cinnamomum cassia), Săng mây (Segeraea elliptica) Lộc Vừng (Barringtonia acutangula) Mẫu thu thập thành cặp loài từ Lâm trường Mã Đà rừng Quốc gia Cát Tiên, TS Trần Đình Nghĩa giúp định tên khoa học Các oligonucleotide (mồi) mua Operon Technologies Inc (Mỹ), hố chất cịn lại dùng cho nghiên cứu đạt độ tinh khiết phân tích Bảng 1: Các mồi ngẫu nhiên sử dụng phản ứng RAPD 2.2.Phương pháp - Tách chiết ADN tổng số từ mẫu thực vật theo quy trình Stacey Isaac [7] có cải tiến - Định lượng ADN đo độ hấp phụ tử ngoại bước sóng 260 nm (A260) - Phân tích phổ băng ADN phương pháp đoạn ADN đa hình nhân ngẫu nhiên (RAPD) kỹ thuật PCR Một phản ứng RAPD-PCR bao gồm đệm PCR 1x nồng độ cuối chất thành phần là: MgCl2 2,5 mM, dNTPs 0,2 mM, mồi ngẫu nhiên 0,5 mM, 2,5 đơn vị Taq ADN polymerase 10-20 ng ADN khuôn Phản ứng thực qua 45 chu kì lặp lại bước chính: biến tính ADN khn 940C, 35 giây, gắn mồi 370C, 30 giây kéo dài chuỗi 720C, phút Sản phẩm RAPD sau điện di gel agarose 2%, nhuộm băng ethidium bromide chụp ảnh để phân tích KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Xây dựng quy trình tách chiết ADN từ mẫu thực vật Để tách chiết ADN từ mẫu thực vật chúng tơi sử dụng qui trình Stacey Issac [7], qui trình dùng với nhiều đối tượng thực vật khác Tuy áp dụng qui trình tách chiết này, chúng tơi khơng thu ADN, chúng tơi thay đổi số thành phần đệm tách chiết, cụ thể tăng nồng độ EDTA hệ đệm lên 50 mM nhằm loại trừ hoàn toàn tác động phân cắt ADN nuclease nội bào, tăng nồng độ NaCl từ 0,7M lên gấp đôi nhằm hạn chế tạo phức ADN CTAB, bổ sung thêm polyvinyl pirrolidone (PVP) sodium dodecyl sulfate (SDS) để làm tăng khả giải phóng ADN tăng kết tủa số hợp chất polyphenol, polysacharide protein Qui trình tách chiết tóm tắt gồm bước: mẫu nghiền với nitơ lỏng, sau bổ sung đệm nghiền (Tris HCl 100 mM, pH 8.0, EDTA 50 mM pH8.0, NaCl 1,4 M; CTAB 2%; PVP 2%; SDS 2%; beta-mecaptoethanol 2%) làm nóng tới 650C Hỗn hợp ủ 650C kết hợp lắc nhẹ Sau để nguội đến nhiệt độ phòng, bổ sung thể tích tương đương hỗn hợp phenol: chloroforrm: isoamylalcohol (trộn theo tỷ lệ 25:24:1 thể tích), lắc mạnh mẫu phút ly tâm 6000 vòng/ phút 250C 10 phút để thu phần dịch tủa Bổ sung tiếp 0,1 thể tích tương ứng NaCl 3M hai thể tích ethanol tuyệt đối chuyển nhanh sang ủ –200C Ly tâm hỗn hợp để thu tủa ADN 14.000 vịng/phút 40C 15 phút Hồ tan kết tủa TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0 có chứa EDTA mM), loại ARN RNAse, tái kết tủa ADN 0,7 lần thể tích isopropanol hồ tan trở lại đệm TE Kết đo độ hấp phụ bước sóng 260 nm (A260) 280 nm (A280) chế phẩm ADN thu (bảng 2) chứng tỏ có mặt ADN, tỷ số A260/A280 đối tượng đạt khoảng 1,9 đến 2,1 Khi phân tích chất lượng ADN điện di gel agarose (hình 1) cho thấy tất mẫu thực vật chọn nghiên cứu thu Mã Đà hay Cát Tiên chứa băng ADN có kích thước lớn, khơng lẫn ARN Các kết phân tích độ hấp thụ tử ngoại điện di khẳng định qui trình với cải tiến thành phần bước tách chiết kể cho phép thu chế phẩm ADN có chất lượng tốt Bảng 2: Độ hấp phụ bước sóng 260 nm 280 nm chế phẩm ADN thực vật Hình 1: Điện di gel agarose chế phẩm ADN thực vật A: Trung Quân , B: Quế Bì, C: Lộc Vừng, D: Săng Mây M: Thang chuẩn ADN l HindIII MĐ: Mã Đà, CT: Cát Tiên Nghiên cứu phổ băng ADN mẫu thực vật thu thập từ Mã Đà Cát Tiên Để thu nhận phổ băng ADN lồi thực vật lựa chọn chúng tơi sử dụng kỹ thuật RAPD- PCR với mồi ngẫu nhiên khác có ký hiệu trình tự ghi bảng Kết điện di sản phẩm RAPD-PCR loài với mồi khác (hình 2, 3, 5) cho thấy có tính đồng hình cao phổ băng ADN mẫu loài thu nhận từ Mã Đà Cát Tiên Tuy vậy, bước đầu phát số băng đa hình mẫu loài thu từ hai vùng Khi sử dụng mồi D5, D6, D7, OPA4, OPA10 OPA12 để tìm hiểu phổ băng lồi Trung Qn (hình 2) chúng tơi phát thấy mồi D6 cho kết đa hình rõ nét nhất, có băng với kích thước khoảng 0,8 kb 1,8 kb thấy mẫu Mã Đà băng có kích thước khoảng 0,8 kb 1,0 kb xuất mẫu Cát Tiên Ngoài mồi D7 cho băng với kích thước khoảng 1,3 kb 1,4 kb có mẫu Mã Đà Tương tự, mồi OPA12 cho băng đa hình với kích thước khoảng 1,3 kb có mẫu Cát Tiên Đối với lồi Quế bì, chúng tơi phát băng đa hình với kích thước khoảng 1,4 kb với mồi OPA4 OPA12, băng có kích thước khoảng 1,6 kb với mồi OPA10 Các băng có mẫu Mã Đà, khơng có Mẫu Cát Tiên (hình 3) Các mồi OPA4, OPA10 OPA12 sử dụng với loài Lộc Vừng Săng Mây khơng có băng nhân điển hình chúng tơi sử dụng mồi P4, P10, Z16, Z17, Z18 Z19 Kết thu với lồi Lộc Vừng (hình 4) cho thấy có băng đa hình thể hiện, băng có kích thước khoảng kb với mồi Z17 kb với mồi Z18 thấy mẫu Mã Đà băng kb với mồi Z19 có mẫu Cát Tiên Tương tự, chúng tơi phát băng đa hình mẫu Săng Mây (hình 5), cụ thể băng có kích thước khoảng 1,3 kb, 1,5 kb với mồi P4 băng 1,7 kb với mồi Z18 thấy mẫu Mã Đà cịn băng có kích thước khoảng 1,4 kb với mồi P4 xuất mẫu Cát Tiên THẢO LUẬN Qua nghiên cứu xây dựng qui trình tách chiết ADN cải tiến cho mẫu thực vật Mặc dầu có nhiều qui trình tách chiết ADN khác từ nguyên liệu thực vật [5, 7], đa dạng tính chất mẫu thực vật, đặc biệt với mẫu có chứa hàm lượng cao chất polyphenol, polysacharide qui trình thơng thường cho kết Chính vậy, cải tiến qui trình mà chúng tơi thiết lập loại bỏ phân cắt nuclease, kết tủa chọn lọc tạp chất thông qua phối hợp CTAB nồng độ NaCl bổ sung SDS cho phép thu nhận chế phẩm ADN chất lượng tốt từ mẫu thực vật khác qui trình thiết lập dùng cho việc tách chiết ADN từ nhiều mẫu thực vật khác RAPD kỹ thuật sử dụng phổ biến nghiên cứu tính đa hình di truyền loài sinh vật [1, 2, 3, 6, 8], đặc biệt mà hệ gen chúng cịn nghiên cứu trình tự [4, 8] Bằng việc sử dụng kỹ thuật này, [4] phát thấy loài ốc cạn Bradybaena similaris thu từ Mã Đà có sai khác phổ băng ADN so với phổ băng loài ốc thu từ Cát Tiên Ngồi ra, chúng tơi phát thấy có khác biệt hoạt độ enzym catalase, superoxit dismuatse, NADH oxidase phổ băng protein hai loại mẫu ốc Các số liệu thu phổ băng ADN Trung Quân, Quế Bì, Lộc Vùng Săng Mây dẫn liệu bổ sung sai khác hệ gen sinh vật loài sống điều kiện môi trường khác Tuy vậy, liệu sai khác có liên quan liên quan đến yếu tố môi trường hay không vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu Xác định trình tự đoạn ADN sai khác nghiên cứu protein biểu sở tốt để trả lời câu hỏi vừa nêu Hình 2: Điện di gel agarose sản phẩm RAPD-PCR mẫu Trung Quân với mồi D5, D6, D7, OPA4, OPA10 OPA12 M: Thang chuẩn ADN kb, MĐ: Mã Đà, CT: Cát Tiên Hình 3: Điện di gel agarose sản phẩm RAPD-PCR mẫu Quế Bì với mồi OPA4, OPA10 OPA12 M: Thang chuẩn ADN kb, MĐ: Mã Đà, CT: Cát Tiên Hình 4: Điện di gel agarose sản phẩm RAPD-PCR mẫu Lộc Vừng với mồi P4, P10, Z16, Z17, Z18 Z19 M: Thang chuẩn ADN kb, MĐ: Mã Đà, CT: Cát Tiên Hình 5: Điện di gel agarose sản phẩm RAPD-PCR mẫu Săng Mây với mồi P4, P10, Z16, Z17, Z18 Z19 M: Thang chuẩn ADN kb, MĐ: Mã Đà, CT: Cát Tiên TÀI LIỆU THAM KHẢO Alberto, F., Santos, R (1997) DNA extraction and RAPD markers to assess the genetic similarity among Gelidium sesquipedale population J Phycol 33:706-710 Bazzicalupo, M and Renato, F (1996) The Use of RAPD for generating specific DNA probes for microorganisms In: Species Diagnostics Protocols Ed Clapp, J.P Humana Press Inc New Jersey pp: 155-175 Drrelkl, L E., Kevin, D R and Srodney, L H (1993) Artifactual variation in RAPD banding patterns Biotechniques, 14: 214-217, Đặng Quang Hưng, Nguyễn Quang Huy, Phan Tuấn Nghĩa (2004) So sánh hoạt độ số enzyme bảo vệ tổn thương oxy hoá phổ băng ADN ốc Bradybaena similaris thu thập từ Mã Đà Cát Tiên, Tỉnh Đồng Nai Tạp chí Di truyền ứng dụng: số 2: 32-38 Mien, T G van de Ven, Partrick G L., and Rex, M B., (1996) Isolation and purification of plant nucleic acids: Genomic and Chloroplast DNA In Species Diagnostics Protocols, 1, ed Clapp, J.P., Humana Press Inc New Jersey pp 01-14 Quyền Đình Thi, Đào Thị Tuyết, Lê Thị Thu Giang, Nguyễn Thị Thảo, Phạm Anh Tuấn (2003) Sử dụng microsatterlite, mtRFLP RAPD để phân tích tính đa hình tơm sú Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 1: 287-298 Stacey, J and Isaac, P G (2000).Isolation and purification of DNA from plants Nucleic Acid Protocols Handbook, Ed Rapley, R Humana Press Inc New Jersey pp 13-16 Wyss, P (1996) The use of RAPD for isolate identification of Arbuscular Mycorrhizal fungi In Species Diagnostics Protocols Ed Clapp, J.P., Humana Press Inc New Jersey pp: 199-208 SUMMARY Investigation of DNA polymorphism of some plant species collected from mada and catien regions (in Dongnai province) A modified protocol for isolation of DNA from some plants was reported Modifications consisted of i) the buffer composition with high concentrations of EDTA (up to 50 mM) and NaCl up to 1.4M, addition of polyvinyl pirrolidone (PVP), sodium dodecyl sulfate and ii) change in the way to collect the DNA from isolation mixture Four plant species: Ancistocladus tectorius, Cinnamomum cassia, Segeraea elliptica and Barringtonia acutangula were collected from Mada and Catien regions for the study to compare DNA banding patterns between each pair of the species by using RAPD-PCR techniques The obtained results showed that all the four species collected from Mada region showed some difference in DNA banding patterns compared to those of the same species collected from Catien region, indicating possible effects of environmental factors on the genome of the species However, further investigation is needed to elucidate the relations between the change in their genome and influencing environmental factors Người thẩm định nội dung khoa học: PGS TS Trịnh Đình Đạt ... phẩm RAPD-PCR loài với mồi khác (hình 2, 3, 5) cho thấy có tính đồng hình cao phổ băng ADN mẫu loài thu nhận từ Mã Đà Cát Tiên Tuy vậy, bước đầu phát số băng đa hình mẫu lồi thu từ hai vùng Khi... băng ADN mẫu thực vật thu thập từ Mã Đà Cát Tiên Để thu nhận phổ băng ADN loài thực vật lựa chọn sử dụng kỹ thu? ??t RAPD- PCR với mồi ngẫu nhiên khác có ký hiệu trình tự ghi bảng Kết điện di sản phẩm...mẫu ốc Bradybaena similaris thu thập từ khu vực so với mẫu ốc loài thu thập từ Vườn Quốc gia Cát Tiên (Tỉnh Đồng Nai) nơi có điều kiện sinh thái tương tự Mã Đà bị tác động chiến tranh hố học