ẢNH HƯỞNG CỦA MANNITOL ĐẾN TÍCH LUỸ PROLIN VÀ GLUCOSE LIÊN QUAN VỚI KHẢ NĂNG ĐIỀU CHỈNH THẨM THẤU TRONG NUÔI CẤY CALLUS CÀ CHUA (LYCOPERSICON ESCULENTUM MILL) Trương Thị Bích Phượng, Hồ Thị Kim Khánh Trường đại học Khoa học, Đại học Huế Nguyễn Hữu Đống Viện Di truyền Nông nghiệp, Hà nội 1. MỞ ĐẦU Hạn là một trong những tác động bất lợi của môi trường xung quanh gây mất nước ở thực vật. Theo Mussell H và Staples RC (1979) một trong những xu hướng để thực vật chống mất nước là dựa trên khả năng làm tăng áp lực nội tại, tăng tính đàn hồi của màng tế bào, giảm kích thước tế bào Thông thường stress nước gây rối loạn toàn bộ phương thức chuyển hóa ở thực vật, làm tăng tích lũy hoặc giảm hàm lượng các chất chuyển hóa như carbohydrate, acid hữu cơ, amino acid, các hợp chất amon và abscisic acid (Kaur và cs. 2000). Khả năng diều chỉnh thẩm thấu và tích lũy các hợp chất hữu cơ hòa tan ở thực vật khi bị stress hạn đã được quan sát thấy ở nhiều loài, sự tích lũy prolin và đường sẽ khởi động tính chống chịu stress thẩm thấu và muối cao (Watanabe và cs. 2000). Việt nam là nước nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa hạn là yếu tố thường xuyên tác động gây ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển của cây trồng, ảnh hưởng xấu đến năng suất và phẩm chất của chúng. Vì vậy việc nghiên cứu các cơ chế chống chịu hạn sẽ là cơ sở cho việc cải thiện giống cũng như tạo ra được các giống có tính chống chịu. Cà chua là loại rau quả có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao, nhưng ở một số vùng ở nước ta nó còn giữ giá trị thấp trong cơ cấu cây trồng. Hiện nay các nghiên cứu trên đối tượng này chỉ dừng lại ở việc sử dụng hệ thống cây trồng hoàn chỉnh. Sử dụng những tiến bộ trong lĩnh vực nuôi cấy mô và tế bào đã thiết lập một công cụ hữu ích cho việc nghiên cứu các cơ chế tế bào của tính chống chịu stress. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi góp phần làm sáng tỏ về vai trò của sự tích luỹ các chất prolin và glucose của callus cà chua liên quan với sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong điều kiện stress nước. 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 2.1. Nguyên liệu thực vật: Sử dụng hạt cà chua (Lycopersicon esculentum Mill) của giống P375 2.2. Nuôi cấy cây và duy trì cây cà chua trong điều kiện in-vitro Hạt giống được rửa sạch dưới dòng nước chảy, để ráo rồi đưa vào tủ cấy. Hạt đuợc khử trùng theo trình tự sau: khử trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 1 phút, sau đó bằng HgCl 2 0,1% trong 2 phút. Hạt được rửa sạch 5 lần bằng nước cất vô trùng. Hạt đã khử trùng được cấy lên môi trường MS cơ bản (Murashige-Skoog 1962), saccharose 30 g/l, agar 8 g/l ở pH 5,8; sau 10 ngày nuôi sẽ xuất hiện các cây con. Cây được nhân giống vô tính bằng cách chuyển đỉnh sinh trưởng và đoạn thân có một đốt lá lên môi trường cơ bản MS có bổ sung kinetin 1,0 mg/l; IBA 0,1 mg/l; B1 1,0 mg/l; B6 0,1 mg/l. 2.3. Nuôi cấy callus: Mảnh lá (5x5 mm) và đoạn thân (5 mm) của cây in-vitro được cấy lên môi trường tạo callus bao gồm môi trường cơ bản MS, bổ sung thêm saccharose 30 g/l; kinetin 2,0 mg/l; NAA 0,5 mg/l; agar 8 g/l ở pH 5,8. Các khối callus (đường kính 2 mm) được nuôi 1 tuần trên môi trường tạo callus có bổ sung ABA nồng độ 10-5 M để tiền xử lý. Sau đó chúng được chuyển sang môi trường tương tự nhưng thay ABA bằng mannitol ở các nồng độ 3, 6, 9 và 12% để gây stress nước trong các thời gian khác nhau 7, 14, 21 và 28 ngày. Các thí nghiệm nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ 25±2 o C, cường độ chiếu sáng 2000-3000 lux, thời gian chiếu sáng 8 giờ/ngày. 2.3. Xác định tốc độ sinh trưởng tương đối Khả năng sinh trưởng của callus cà chua được xác định bằng chỉ số tốc độ sinh trưởng tương đối (RGR) theo công thức của Lutt và cs. (1996): Trong đó:  t = t2 - t1 (t1: thời điểm bắt đầu nuôi cấy, t2: thời điểm sau khi nuôi cấy), W1: trọng lượng tươi (g) của mô tại thời điểm t1, W2: trọng lượng tươi (g) của mô tại thời điểm t2. 2.4. Xác định áp suất thẩm thấu: Áp suất thẩm thấu (P) được xác định theo phương pháp của Schardakov (Grodzinski và Grodzinski 1981) và tính toán giá trị bằng phương trình Van-Hoff : P = iCRT 0,987 atm = 0,1 MPa. C: nồng độ mol của dung dịch. T: nhiệt độ tuyệt đối. R: hằng số khí (0,082). i: hệ số đẳng trương của dung dịch (i = 1 đối với dung dịch saccharose). 2.5. Phân tích hàm lượng prolin Hàm lượng prolin được xác định theo phương pháp của Bates và cs. (1973), đo hấp thụ quang của dịch chiết trên máy quang phổ ở  = 520 nm. Hàm lượng prolin được xác định bằng đường chuẩn prolin và tính toán theo công thức sau: TLT: trọng lượng tươi, TLTM: trọng lượng tươi của mô 2.6. Phân tích hàm lượng glucose: Hàm lượng glucose được xác định theo phương pháp của Folin-Wu (Lecoq 1952) có cải tiến, đo hấp thụ quang của dịch chiết trên máy quang phổ ở  = 590 nm và tính toán giá trị theo đường chuẩn glucose. 2.6. Xử lý thống kê Mỗi công thức thí nghiệm tiến hành với 3 lần lặp lại. Số liệu thí nghiệm được xử lý bằng thống kê sinh học. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khả năng điều chỉnh thẩm thấu của callus cà chua Kết quả trình bày ở hình 1 cho thấy, callus cà chua có khả năng điều chỉnh thẩm thấu tương đối tốt trên môi trường bổ sung mannitol. Áp suất thẩm thấu của các công thức có xử lý mannitol đều cao hơn so với đối chứng, đạt giá trị cao nhất là 0,289 MPa (ĐC: 0,177 MPa) ở môi trường có 12% mannitol sau 7 ngày xử lý và đạt giá trị nhỏ nhất là 0,192 MPa (ĐC: 0,181 MPa) ở môi trường có 3% mannitol sau 28 ngày xử lý. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi còn cho thấy, sau 28 ngày xử lý ở tất cả các nồng độ mannitol áp suất thẩm thấu của callus giảm xuống đồng loạt so với các thời gian xử lý trước. Như vậy nếu bổ sung mannitol vào môi trường với nồng độ tăng dần trong thời gian xử lý ngắn thì mô có khả năng điều chỉnh thẩm thấu tốt, nhưng khi kéo dài thời gian xử lý, thì sẽ ức chế khả năng điều chỉnh thẩm thấu của mô. 3.2. Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến tốc độ sinh trưởng tương đối của callus cà chua Khi áp suất thẩm thấu nội bào tăng từ 0,210-0,224 MPa, tốc độ sinh trưởng của callus tăng lên từ 0,065-0,067. Sau đó tốc độ sinh trưởng của callus giảm dần khi áp suất thẩm thấu tiếp tục tăng, chỉ đạt giá trị 0,0082 ở 0,278 MPa (Hình 2). Nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Lộc và cs. (2000) ở callus lúa cho thấy tốc độ sinh trưởng tương đối của mô cũng tăng cùng áp suất thẩm thấu nội bào và đạt cực đại ở giá trị 0,016/0,64 MPa, sau đó bắt đầu giảm dần tương quan nghịch với áp suất thẩm thấu. 3.3. Khả năng tích luỹ prolin của callus Tương tự như áp suất thẩm thấu, hàm lượng prolin trong các công thức thí nghiệm đều cao hơn so với đối chứng (Hình 3). Trong cùng thời gian xử lý, hàm lượng prolin trong callus tăng dần ở môi trường có 3-9% mannitol và giảm ở 12% mannitol. Trường hợp ở cùng nồng độ mannitol, hàm lượng prolin trong callus cà chua tăng theo thời gian xử lý từ 7-14 ngày và giảm ở 21-28 ngày. Hàm lượng prolin đạt giá trị cao nhất là 12,992 mol/g TLT ở mannitol 9% sau 14 ngày xử lý (ĐC: 2,716 mol/g TLT). Theo Delauney và Verma (1973), sinh tổng hợp prolin được điều khiển bởi enzyme '-pyrrolin -carboxylate synthetase (P5CS). Enzyme này được điều hoà nhờ prolin thông qua ức chế ngược. Ở thực vật chịu stress nước, sự điều hoà ngược này đã biến mất và đây có thể là nguyên nhân làm tăng tích luỹ prolin dưới các điều kiện stress. 3.4. Khả năng tích luỹ glucose của callus Khác với trường hợp prolin , sự tích lũy glucose trong callus xử lý stress nước có sự sai khác không đáng kể, tuy vẫn cao hơn so với đối chứng ở tất cả các công thức thí nghiệm. Ở cùng một nồng độ mannitol, sự tích lũy glucose của callus cà chua tăng từ 7-21 ngày và giảm sau 28 ngày xử lý. Trường hợp ở cùng một thời gian xử lý, hàm lượng glucose trong callus tăng từ 3-9% và giảm ở 12% mannitol. Hàm lượng glucose đạt giá trị cao nhất là 10,154 mg/g TLT (ĐC: 7,304 mg/g TLT) ở môi trường có 9% mannitol sau 21 ngày xử lý (Hình 4). 3.5. Thảo luận Việc xử lý stress nước callus cà chua cho thấy sự thay đổi hàm lượng prolin và hàm lượng glucose trong dịch bào có liên quan với khả năng điều chỉnh thẩm thấu trong tế bào. Thực vật có thể duy trì một sức trương không đổi trong quá trình khô hạn bằng cách tích luỹ các chất hoà tan để tăng áp lực nội tại tế bào. Hàm lượng prolin trong callus cà chua [...]... (Đt: 7540764 (Cq)) Hình 1 Khả năng điều chỉnh thẩm thấu của callus nuôi cấy trên môi trường có mannitol (p . ẢNH HƯỞNG CỦA MANNITOL ĐẾN TÍCH LUỸ PROLIN VÀ GLUCOSE LIÊN QUAN VỚI KHẢ NĂNG ĐIỀU CHỈNH THẨM THẤU TRONG NUÔI CẤY CALLUS CÀ CHUA (LYCOPERSICON ESCULENTUM MILL) Trương. Phan Công Bình và Lê Thị Thính. 2000. Ảnh hưởng của mannitol đến tích luỹ prolin và glucose liên quan với khả năng điều chỉnh thẩm thấu trong nuôi cấy callus lúa (Orya sativa L.). TC Sinh học,. học. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khả năng điều chỉnh thẩm thấu của callus cà chua Kết quả trình bày ở hình 1 cho thấy, callus cà chua có khả năng điều chỉnh thẩm thấu tương đối tốt