XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT HOÁ SINH VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS VAR. AIZAWAI H1 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Bùi Thị Hương, Nguyễn Thuỳ Châu Bộ môn Vi Sinh, Viện Công Nghệ Sau Thu Hoạch Đinh Duy Kháng Phòng Vi Sinh phân tử, Viện Công Nghệ Sinh Học Bacillus thuringiensis (gọi tắt là Bt) là vi khuẩn gram dương được phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, chúng chứa các gen cry sinh tổng hợp bào tử và protein tinh thể độc tố có khả năng diệt nhiều loại côn trùng, vì thế chế phẩm thuốc trừ sâu vi sinh Bt đã được sử dụng để phòng trừ các côn trùng dịch hại thuộc các bộ cánh vảy, bộ hai cánh, bộ cánh cứng và các động vật không xương sống khác. Trong những năm gần đây các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu, sưu tập, phân tích và sàng lọc các chủng B. thuringiensis thu nhận được ở các mẫu phân lập từ môi trường, với mục đích tìm ra những chủng mới có hoạt tính diệt sâu cao, phổ diệt sâu rộng đối với nhiều loài côn trùng. Việc xác định sự tồn tại các nguồn gen quý từ những chủng này là công việc rất cần thiết, làm cơ sở tiền đề cho các nghiên cứu đi sâu tiếp theo đối với những gen cry này như: việc gây đột biến vị trí có định hướng đối với gen cry nhằm tạo chủng B. thuringiensis mới chống khả năng kháng thuốc của các loại côn trùng; việc tạo ra các chủng B. thuringiensis tái tổ hợp mới có phổ diệt sâu rộng, hoạt lực diệt sâu cao hơn đối với nhiều loài côn trùng quan trọng; việc biến nạp các gen độc tố cry thích hợp vào từng loại cây trồng để bảo vệ chúng trước sự tấn công của côn trùng Trong khuôn khổ bài báo này chúng tôi đã tiến hành thử hoạt tính diệt sâu, thăm dò sự tồn tại gen cry1C và cry1Ab của chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập ở Việt Nam. Tiến hành tạo dòng và đọc trình tự đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry 1C đồng thời so sánh với trình tự cùng đoạn gen này đã được công bố trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế. I.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I.1.Thử sinh học hoạt tính diệt sâu: Tiến hành theo phương pháp của S.H.Park: Đối tượng sâu được thử là sâu tơ (Plutella xylostella), sâu keo (Spodoptera exiqua) và sâu khoang (Spodoptera litura): lá bắp cải tươi được cắt thành các khoanh tròn có đường kính 3cm vào hỗn dịch bào tử tinh thể B. thuringiensis có nồng độ 5x107 bào tử/ml, sau đó đặt vào đĩa petri và cho vào mỗi đĩa 10 con sâu; mỗi mẫu thử với 30 con sâu. Đối với sâu bông ( Helicoverpa armigera) cũng được tiến hành tương tự trên lá bông. Hoạt tính diệt sâu ngài gạo (Corrcyra cephalonia) được đánh giá như sau: bỏ 30 con sâu ngài gạo vào bình thuỷ tinh 400g gạo đã được nhiễm bào tử và tinh thể của B. thuringiensis với liều 5x107 bào tử/gam gạo, nuôi ở 30 0 C với độ ẩm 70-80%. I.2. Điện di protein (SDS-PAGE) bào tử và tinh thể của chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 Chủng B. thuringiensis phát triển trên môi trường thạch T3 đã được tạo hỗn dịch trong 5 ml dịch 0,02% Triton X-100. Ly tâm trong 1 phút. Cắn được hoà tan với 30 l đệm SDS (1x SDS gel- loading buffer). Các mẫu được đun sôi trong 5 phút, ly tâm ở 8000vòng/phút trong 5 phút, lấy dịch nổi và chạy điện di trên gel polyacryamide 10% ở 30mA theo phương pháp của Sambrook và Maniatis [5]. I.3. Xác định sự tồn tại gen cry1Ab, cry1C bằng kỹ thuật PCR. Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25l đựng trong ống Eppendorf bao gồm các thành phần: nước khử ion 13,6l, dNTP 2,5l, buffer 2,5l, primer 2l, enzim Tag-polymeraza 0,4l, MgCl2: 2l, ADN 2l ( nồng độ 50ng/l). Sử dụng cặp mồi TY6(5’- GGTCGTGGCTATATCCTTCGTGTCACAGC-3’) và TY14(5’-GAATTGCTTTCATAGGCTCCGTC-3’); TYIC (5’-CAACCTCTATTTGGTGC AGGTTC-3’) và TYIUNI (5’-ATCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTTCTC- 3’) theo thứ tự, để nhân bản đoạn ADN đặc hiệu nằm trong gen cry1Ab và cry1C. Các sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trên gel agaroza 1%. I.4. Tạo dòng đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry1C. Tạo vectơ tái tổ hợp: tiến hành theo phương pháp của Sambrook và cs [5]: gắn trực tiếp sản phẩm PCR được tạo ra ở mục I.3 vào vectơ tách dòng PCR TM 2.1. Phản ứng gắn gồm: nước khử ion: 3l; Dung dịch đệm gắn: 1l; Sản phẩm PCR:3l; vectơ PCR TM 2.1: 2l; T4- ligaza: 1l. Ủ qua đêm ở nhiệt độ 14 0 C. Sau đó biến nạp sản phẩm gắn vào vi khuẩn E. coli chủng DH5. Các khuẩn lạc E. coli chứa vectơ pCRTM 2.1 tái tổ hợp được chọn lọc trên môi trường LB chứa ampixillin, IPTG (Isopropyl- -D- Thiogalactopyranoside) và X-gal. Sau đó tách chiết ADN plasmit từ tế bào vi khuẩn bằng cách xử lý với dung dịch chứa NaOH, SDS để phá vỡ tế bào. Thu dịch nổi chứa ADN plasmit, kết tủa bằng cồn rồi hoà lại cặn trong dung dịch đệm TE, ARN được loại bằng RNaza nồng độ 100g/ml. I.5. Phân tích trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C. Sau khi tách chiết và tinh sạch vectơ tái tổ hợp từ tế bào chủ, gen được xác định trình tự theo phương pháp enzim học của Sanger nhờ bộ kit của Hãng Amersham-Pharmacia Biotech với máy đọc trình tự ADN tự động ALF-Express của Hãng Pharmacia. Phân tích kết quả được tiến hành với chương trình PC/Gene. II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN II.1. Thử sinh học hoạt tính diệt sâu của chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập Chủng B. thuringiensis phân lập đã được phân loại là chủng B. thuringiensis var. aizawai theo phương pháp định typ huyết thanh của Ohba và Aizawai [1]. Chúng tôi đã tiến hành thử sinh học hoạt tính diệt sâu của chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập có tinh thể hình quả trám đối với một số côn trùng phổ biến thuộc bộ cánh vảy như sâu ngài gạo, sâu tơ, sâu keo, sâu khoang và sâu bông kết quả được chỉ ra ở bảng 1: Bảng 1: Hoạt tính diệt sâu của các chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập đối với sâu tơ (Plutella xylostella), sâu keo (Spodoptera exiqua), sâu khoang (Spodoptera litura), sâu bông (Helicoverpa armigera) và sâu ngài gạo (Corrcyra cephalonica) Kết quả bảng 1 cho thấy: chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập có hiệu lực diệt đặc hiệu cao là 100% đối với sâu ngài gạo, sâu tơ và sâu keo. Hiệu quả diệt giảm hơn đối với sâu khoang (90%) và giảm hơn nữa trên đối tượng sâu bông (30%). Như vậy chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 có ý nghĩa rất quan trọng để bổ sung vào bộ sưu tập chủng giống phục vụ cho công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh B. thuringiensis. Kết quả thử sinh học cho thấy sâu bông là loài rất khó diệt. Chúng tôi cho rằng cần phải có những nghiên cứu sâu hơn về mặt sinh học phân tử đối với chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 có hiệu lực diệt sâu bông nói trên như: phân tích sự tồn tại các gen cry, tạo dòng và đọc trình tự các gen cry mã hoá protein tinh thể độc tố có hiệu lực diệt sâu bông, từ đó tạo ra chủng B. thuringiensis tái tổ hợp mới có hiệu lực diệt sâu bông là rất cần thiết và có ý nghĩa thực tiễn cho công nghệ sản xuất thuốc trừ sâu B. thuringiensis diệt trừ sâu bông H. armigera tại Việt nam. II.2. Phân tích protein tinh thể và bào tử của các chủng B. thuringiensis var. aizawai phân lập bằng phương pháp điện di protein. Hình 1: Điện di đồ protein trên gel 10% polyacrylamit (PAGE) của chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập và chủng chuẩn. Chú thích: Kênh 1: Maker (chỉ thị với phosphorylase có trọng lượng phân tử 97,4kDa, Bovin serum albumin – 66 kDa, Ovalbumin – 42,7 kDa, Carbonic anhydrase – 31kDa, Soybean tripsin inhibitor – 21,5 kDa, -Lactalbumin – 14,4 kDa); Kênh 2: chủng chuẩn Bt. var aizawai ; Kênh 3: chủng Bt. var. aizawai H1 phân lập. Kết quả điện di protein tinh thể của chủng Bt. var aizawai H1 phân lập được chỉ ra ở hình 1 cho thấy: Chủng Bt. var aizawai phân lập có khuôn mẫu protein giống với chủng Bt. var aizawai chuẩn gồm có các băng protein với trọng lượng phân tử là: 130, 81, 71 kDa. II.3.Xác định sự tồn tại gen cry1Ab và cry1C của chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập: Chúng tôi đã tiến hành sử dụng cặp mồi TYIC và TYIUNI để nhân bản đoạn ADN đặc hiệu nằm trong gen cry1C của chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập và chủng chuẩn B. thuringiensis var. aizawai M1, kết quả được thể hiện ở hình 2 Hình 2. Điện di đồ sản phẩm PCR đặc hiệu của gen cry 1C của chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập và chủng chuẩn B. thuringiensis var. aizawai M1 [...]... (90%) và giảm hơn nữa trên đối tượng sâu bông (30%) Kết quả điện di protein tinh thể của chủng Bt .aizawai H1 phân lập cho thấy: Khuôn mẫu protein của chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập giống với chủng chuẩn B thuringiensis var aizawai M1 Chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập mang gen cry1C, không mang gen cry1Ab Đã tạo dòng và đọc trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C từ chủng B thuringiensis. .. hiệu vào khoảng 285bp theo lý thuyết giống với sản phẩm PCR của chủng chuẩn B thuringiensis var aizawai M1 (kênh 1,3) Như vậy cả hai chủng B thuringiensis var aizawai H 1phân lập và chủng chuẩn B thuringiensis var aizawai M1 đã mang gen cry1C Tương tự chúng tôi tiến hành sử dụng cặp mồi: TY6 và TY14 để nhân bản đoạn ADN đặc hiệu thuộc gen cry1Ab của chủng B thuringiensis var aizawai phân lập và chủng. .. hiện ở hình 5 Hình 5: So sánh trình tự nucleotit giữa đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C tạo dòng từ chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập ở Việt Nam (VNCRY1C) và đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C do Sanchis V và cộng sự công bố trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế (QTCRY1C) Từ kết quả ở hình 5 cho thấy đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C tạo dòng từ chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập của Việt. .. hiệu của gen cry1C tạo dòng từ chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập ở Việt nam Kết quả ở hình 6 cho thấy: Đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C có thể dịch thông sang một đoạn protein có chiều dài 95 axit amin III KẾT LUẬN: Chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập ở Việt nam có hiệu lực diệt đặc hiệu cao là 100% đối với sâu ngài gạo, sâu tơ và sâu keo Hiệu quả diệt giảm hơn đối với sâu khoang... thuringiensis var aizawai phân lập và chủng chuẩn B thuringiensis var aizawai M1 Kết quả cho thấy cả hai chủng này đều không có sản phẩm PCR đặc hiệu Như vậy cả hai chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập và chủng chuẩn B thuringiensis var aizawai M1 đều không chứa gen cry1Ab Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy chủng B thuringiensis var aizawai H 1phân lập ở Việt Nam đã mang gen cry1C nhưng không mang... phẩm PCR chủng chuẩn Bt aizawai cắt bằnglM1; Kênh 2: Chỉ thị phân tử (ADN Hind III và EcoR I) từ trên xuống 21226, 5148, 4973, 4277, 3530, 2027, 1904, 1584, 1330, 983, 831, 564 bp) Kênh 3: sản phẩm PCR chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập Kết quả ở hình 2 cho thấy: sản phẩm PCR thu được rất đặc hiệu, không có sản phẩm phụ Chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập có duy nhất một sản phẩm... thuringiensis var aizawai H1 phân lập, đoạn ADN này có chiều dài 285bp, có thể mã hoá cho một đoạn protein có chiều dài 95 axit amin Trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C tạo dòng từ chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập ở Việt nam có độ tương đồng cao đạt tới 99,3% so với đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C do Sanchis V và cộng sự công bố năm 1989 trong Ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế mã số AC X13602... đặc hiệu thuộc gen cry1C từ chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập Tiến hành gắn sản phẩm PCR đặc hiệu của gen cry1C từ chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập vào vectơ PCRTM2.1 để tạo vectơ tái tổ hợp Sau đó biến nạp vectơ tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli DH5 Nhờ quá trình nhân lên của vi khuẩn mà vectơ tái tổ hợp cũng được nhân theo Sau đó tiến hành tách chiết và tinh sạch plasmit tái tổ... sau: 96A, 44C, 61G, 84T Hình 4: Trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry 1C tạo dòng từ chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập, đoạn ADN này dài 285 cặp bazơ II.6 So sánh trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C Chúng tôi đã tiến hành so sánh trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C tạo dòng từ chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập với trình tự cùng đoạn gen này đã được công bố năm 1989... thị phân tử ADN 1kb leader (12216, 11198, 10180, 9162, 8144, 7126, 6108, 5090, 4072, 3054, 2036, 1636, 1018, 517, 506, 396, 344, 298, 220, 201, 154, 134, 75) II.5 Xác định trình tự nucleotit đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C Kết quả ở hình 4 cho thấy: trình tự đoạn ADN đặc hiệu của gen cry1C tạo dòng từ chủng B thuringiensis var aizawai H1 phân lập được xác định có chiều dài 285 cặp bazơ bao gồm số lượng . XÁC ĐỊNH MỘT SỐ TÍNH CHẤT HOÁ SINH VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ CỦA CHỦNG BACILLUS THURINGIENSIS VAR. AIZAWAI H1 PHÂN LẬP Ở VIỆT NAM Bùi Thị Hương, Nguyễn Thuỳ Châu Bộ môn Vi Sinh, Viện. II.1. Thử sinh học hoạt tính diệt sâu của chủng B. thuringiensis var. aizawai H1 phân lập Chủng B. thuringiensis phân lập đã được phân loại là chủng B. thuringiensis var. aizawai theo. var aizawai ; Kênh 3: chủng Bt. var. aizawai H1 phân lập. Kết quả điện di protein tinh thể của chủng Bt. var aizawai H1 phân lập được chỉ ra ở hình 1 cho thấy: Chủng Bt. var aizawai phân lập