NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH CƠNG NGHỆ THU NHẬN SILYMARIN VÀ TẠO SINH KHỐI TẾ BÀO TỪ CÚC GAI (SILYBUM MARIANUM) TRỒNG Ở VIỆT NAM Nguyễn Thị Hồng Gấm, Nguyễn Quốc Khang Khoa Sinh học– Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Hà nội Lê Thị Lan Oanh, Nguyễn Thị Tố Nga, Nguyễn Thị Ngọc Dao Viện Công nghệ Sinh học, Hà nội I ĐẶT VẤN ĐỀ Cây Cúc gai (Silybum marianum) thuộc họ Cúc Asteraceae, thảo 1-2 năm, hoa vào năm thứ 2, nguyên liệu dùng sản xuất thuốc hạt toàn Cây phát triển chủ yếu châu Âu, châu Phi, Nam Mỹ, Trung Đông Á Đây thuốc có giá trị cao, để điều trị bệnh hiểm nghèo gan thận, phổ biến nước ta Do việc khai thác phát triển sử dụng Cúc gai di thực trồng Việt Nam để sản xuất chế phẩm thuốc chữa bệnh gan thận nước tạo nguồn dược phẩm quí, mới, phong phú rẻ tiền phục vụ bảo vệ sức khoẻ cộng đồng vấn đề quan tâm cấp thiết Cây cúc gai du nhập vào trồng Việt Nam từ lâu, phát triển tốt vùng cao có đất tốt khí hậu mát mẻ như: Tam Đảo, Sapa,…; lượng dược liệu nhu cầu ngày gia tăng Do chúng tơi thực hiên đề tài nêu trên, nhằm góp phần phát triển, mở rộng làm phong phú nguồn dược liệu đất nước II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 2.1 Đối tượng: - Hạt Cúc gai dùng thí nghiệm có nguồn gốc từ Cúc gai trồng Cộng hoà liên bang Đức (CHLB Đ) trồng Sapa Việt Nam Hạt sấy khô Lá, thân Cúc gai thu từ Cúc gai trồng thử nghiệm Hà Nội vào tháng 4-5 bắt đầu chín ngả vàng Các phận thái lát, sấy nhiệt độ 60OC đến khô nghiền nhỏ thành bột mịn - Các hố chất khác dùng dạng phân tích (pa.) hãng Sigma Merk Hình Cây Cúc gai phát triển Hình Cây Cúc gai hoa 2.2 Phương pháp nghiên cứu: - Nghiên cứu tỷ lệ nảy mầm hạt.Hạt Cúc gai gieo giấy lọc bão hoà nước hộp Petri Mỗi công thức nhắc lại lần, lần gieo 100 hạt để tối hoàn toàn nhiệt độ 15, 25 35OC Tỷ lệ nảy mầm theo dõi qua thời đIểm 3, ngày - Định tính nhóm chất hữu phận phương hố lý thơng thường thuốc thử hoá học đặc hiệu - Chiết rút phân đoạn flavonoit theo phương pháp Talli - Nghiên cứu thành phần hoá học phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM), sắc ký lỏng cao áp (HPLC),… Nuôi cấy mô rễ, thân để tạo sinh khối III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Nghiên cứu công nghệ nhân giống nguyên liệu vùng sinh thái khác công nghệ tạo sinh khối tế bào Cúc gai: Để thực vấn đề đặt ra, cần nghiên cứu Cúc gai cách hệ thống từ việc tạo giống nguyên liệu qui trình nhân giống trồng đại trà vùng sinh thái thích hợp ni cấy tạo sinh khối đến nghiên cứu thành phần hoá học Cúc gai trồng Việt Nam, qui trình cơng nghệ chiết rút chất có hoạt tính sản xuất chế phẩm thuốc để thử nghiệm Qua nhiều thăm dò, thử nghiệm, chúng tơi thành cơng qui trình cơng nghệ, tóm tắt sau: 3.1.1 Sự nảy mầm hạt Cúc gai Bước đầu tiến hành khảo sát nảy mầm hạt Cúc gai từ trồng Việt nam (VN) Cộng hoà liên bang Đức (Đức) Hạt cúc gai sấy khô đạt độ ẩm 9-10% tiến hành thí nghiệm Hạt gieo giấy lọc thấm nước cất hộp petri, công thức nhắc lại lần, lần gieo 100 hạt, để tối nhiệt độ 15, 25 35OC Số hạt nảy mầm theo dõi sau 3, ngày Kết trình bầy bảng Bảng Ảnh hưởng nhiệt độ đến thời gian nảy mầm hạt Cúc gai Nhiệt độ tối ưu khoảng 25OC, hạt Cúc gai Đức nảy mầm sau ngày, nhiệt độ đóng vai trị quan trọng trình nảy mầm hạt Cúc gai Các hạt Cúc gai sau nẩy mầm nhân chậu thí nghiệm phát triển bình thường trình bày hình đây: Hình Cây Cúc gai từ hạt Cúc gai Đức (1) hạt Cúc gai VN (2) 3.1.2 Thử nghiệm trồng Cúc gai Cúc gai đẫ trồng Sapa nhiều năm qua khí hậu thích hợp với lồi ơn đới cho hàm lượng hoạt chất không Cúc gai (CHLB Đ) Chúng thử nghiệm trồng Cúc gai điều kiện đồng Hà Nôi, ngoại thành Hà Nội diện tích vườn 50m2 Trung Tâm Giống thuốc thuộc Viện Dược liệu, thử nghiệm trồng Cúc gai An Khánh, Thường Tín cho thấy Cúc gai trồng điều kiện khí hậu Hà Nội, cho hoa năm thứ Tuy nhiên cần xác định thời vụ trồng thích hợp từ tháng 10 năm trước đến tháng năm sau vào vụ Thu Đơng , cần phân tích đánh giá sản lượng, hàm lượng chất lượng thuốc hạt Cúc gai trồng điều kiện năm 2002 Hiện cho trồng thử nghiệm lại đồng thời Sapa Trung tâm Cây thuốc, Cúc gai gần tháng tuổi sinh trưởng tốt.(hình 2) 3.2 Thử nghiệm ni cấy mơ tế bào Với độ nảy mầm tốt tiến hành nuôi cấy mô rễ Cúc gai tạo sinh khối tế bào phịng thí nghiệm Hiện bắt đầu thực nội dung trên, thử nghiệm cho hạt cúc gai nảy mầm điều kiện vô trùng thử nuôi cấy mô lá, thân rễ Bước đầu đẫ tìm mơi trường thích hợp tạo mô sẹo khối mô cho giống Cúc gai Đức Việt Nam Q trình tạo mơ sẹo diễn qua bước sau: 3.2.1 Các bước khử trùng hạt nẩy mầm: Kết bước trải qua công đoạn sau: - Ngâm hạt rửa nước cất lần - Lắc ethanol 70% thời gian phút, sau lắc nước gia ven 50% thời gian 20 phút - Rửa lại nước cất nóng ấm lần - Cuối cấy hạt vào bình có chứa mơi trường cho hạt nảy mầm Thành cơng là:: + Hạt nảy mầm đạt kết 100% + Môi trường cho hạt nảy chồi tốt ký hiệu T/2 3.2.2 Tạo mô sẹo từ rễ cúc gai Có thể tóm tắt sau: - Sau hạt nảy mầm thành hoàn chỉnh, tiếp tục cắt mảnh mảnh rễ để đưa vào môi trường tạo mô sẹo - Sau thời gian tháng bắt đầu hình thành mơ sẹo - Đối với mơi trường thích hợp cho việc tạo mơ sẹo có ký hiệu là: TM1, rễ mơi trường có ký hiệu TMS - Sau mơ sẹo hình thành, sau nhiều thăm dị thử nghiệm mơi trường khác điển hình mơi trường phù hợp cho việc ni cấy mô sẹo 141 MSD2 Những kết phản ảnh rõ nét qua ảnh chụp sau Hình Tạo mơ sẹo từ thân Cúc gai Hình Mơ sẹo từ Cúc gai mơi trường 141 Hình Mơ sẹo từ rễ Cúc gai mơi trường 141 Hình Tạo mô sẹo từ Cúc gai môi trường MT1 Hình Ni mơ sẹo từ Cúc gai mơi trường MT1 3.3 Xây dựng qui trình thu nhận Silymarin qui mơ phịng thí nghiệm: Qui trình thu nhận silymarin từ hạt Cúc gai trình bầy tổng quát sơ đồ sau: -Đã chọn hệ dung mơi thích hợp độc để chiết rút thu nhận Silymarin làm thuốc qui mơ phịng thí nghiệm Hiệu suất thu nhận chế phẩm so với phương pháp phân tích định lượng Qui trình với quy mơ Pilot 20 lit- có hàm lượng 2,12% trọng lượng khô Như hiệu suất thu Silymarin quy trình 87% so với phân tích định lượng Kết thu 20 gam Silymarin tinh khiết Kết phân tích SKLM cho vết đậm sắc ký đồ có Rf (0,40; 0,46; 0,55 0,58) gần giống với giá trị Rf thành phần Silymarin Bungary làm chất chuẩn Chế phẩm Carsil hai chế phẩm VN1 VN2 tách chiết hệ dung mơi khác phân tích thành phần máy HPLC Bảng Kết phân tích máy HPLC Mẫu Silymarin Bungary có peak đặc trưng chiếm tới 88,7% tổng số chế phẩm đưa vào phân tích, mẫu Silymarin thu (từ hạt Cúc gai VN1 VN 2) có peak tương tự chiếm tới 93,3 81,2% tổng số mẫu đưa vào phân tích Như thành phần Silymarin thu từ mẫu giống thành phần Silymarin dùng làm thuốc Bungary Tuy nhiên tỷ lệ peak mẫu có khác Thành phần peak Silymarin Bungary có hàm lượng cao chiếm tới 29,9%, peak chế phẩm Silymarin VN thu chiếm có 7,8%, peak chiếm tới 44,9%, peak2 Silymarin Bungary chiếm 11,6% chế phẩm Silymarin VN2 17,4 38,0% Thành phần Silymarin Cúc gai VN VN có thành phần tương đương nhau, dùng loại dung mơi thí nghiệm để thu nhận Silymarin Chúng tiến hành để tách peak phân tích thành phần hố học tính chất chúng, cơng trình tiếp sau IV KẾT LUẬN Đã nghiên cứu nẩy mầm hạt Cúc gai từ hạt sấy khô 60OC, cịn 9-10% ẩm độ Sau khử trùng đưa vào mơi trường nẩy mầm thích hợp ( T/2 ) Kết hạt nẩy mầm đạt 63,34 – 78,93% 25OC, sau ngày Đã thành công qui trình tạo mơ sẹo từ lá, thân rễ Cúc gai môi trường khác là:lá thân mơi trường thích hợp TM1 cho rễ môi trường TMS Đồng thời lựa chọn mơi trường thích hợp để ni mơ sẹo phát triển thành 141 MSD2 Tiến hành qui trình sản xuất Cúc gai thành cơng thực địa điều kiện mơi trường có nhiệt độ cao Hà nội Xây dựng qui trình thu nhận Silymarin từ Cúc gai qua bước:Bột nguyên liệu  Loại chất béo  Chiết rút etylacetat  Đuổi dung môi  Tinh chế lại  Chế phẩm Silymarin Chế phẩm thu có hiệu xuất khai thác cao chất lượng tốt tương tự Silymarin Bungary, phân tích sắc ký lớp mỏng (SKLM) sắc ký lỏng cao áp (HPLC) TÀI LIỆU THAM KHẢO: Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Quốc Khang, Đào Kim Nhung (1977)- Thực tập Sinh hoá, Đại học Tổng hợp Hà nội Đào Kim Nhung (1996)- Luận án PTS Khoa Sinh học, ĐHTH Hà nội Võ Văn Chi (2000)- Từ điển thuốc Việt nam NXB Y-học Hà nội, tr 339 Carsil, a product with confirmed effectivenes in toxic, metabolic and degenerative diseases of the hepatic parenchyma, 2000, Sopharma, Bungary Flora K., Hahn M Rosen H, Benner K (1999)- Milk thistle (S marianum) for the therapy of liver diseases Am J Gastroenterol 94 (2), 545 – 546 Amirghofran Z., Azadbakht M., Karimii MH (2000).- Evaluation of the immunomodulatory effects of five herbal plants J Ethnopharmacol 72 (1-2), 167-172 Luper S (1998)- A review of plants used in the treatment of liver disease Altern Med Rev (6), 410-421 Syed AH Et al (2002) Contemporary role and future propects of medicinal plants TelMedPak Alikaridis F (2000)- Hairy root’s Silybum marianum biosynthesis Fitoterapia, 379 –384 SUMMARY: Study on extraction procedure of flavolignans silymarin and production of biomass from milk thistle sylibum marianum grown in viet nam Germination process of the dryed under 60oC seeds from milk thistle (Silybum marianum) growing in Vietnam was investigated The results showed that 63,34 – 78,93% of the seeds were germinated at 25OC after days The procedure of callus culture of leaves, stem and roots in different mediums was completted The suitable medium for leaves and stem callus formation was TM1, and for root callus formation was TMS The mediums 141 and MSD2 were suitable for plant formation from callus The production of milk thistle in field was carried out Milk thistle could grow in higher temperature condition of Hanoi The 20 litre volume extraction procedure of flavolignans Silymarin from the plant was done with two solvent systems (VN1 and VN2) with following steps: Material powder  lipid removal  etylacetat extraction  solvent evaporation  refinement  Silymarin preparation The obtained bioactive preparation had good quantity with 2,12% per dry weight and quality as Silymarin drug of Bulgaria (Carsil) analyzed by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and Think Layer Chromatography (TLC) techniques The components Silymarin from VN1 and VN2 are similar, so both solvents can be used to obtain Silymarin The obtained preparation Silymarin should be a promising component of a drug using for treatment of liver diseases Người thẩm định nội dung khoa học: PGS Trịnh Đình Đạt  ... để tạo sinh khối III KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Nghiên cứu công nghệ nhân giống nguyên liệu vùng sinh thái khác công nghệ tạo sinh khối tế bào Cúc gai: Để thực vấn đề đặt ra, cần nghiên cứu Cúc gai. .. dựng qui trình thu nhận Silymarin qui mơ phịng thí nghiệm: Qui trình thu nhận silymarin từ hạt Cúc gai trình bầy tổng qt sơ đồ sau: -Đã chọn hệ dung mơi thích hợp độc để chiết rút thu nhận Silymarin. .. sau Hình Tạo mơ sẹo từ thân Cúc gai Hình Mơ sẹo từ Cúc gai mơi trường 141 Hình Mô sẹo từ rễ Cúc gai môi trường 141 Hình Tạo mơ sẹo từ Cúc gai mơi trường MT1 Hình Ni mơ sẹo từ Cúc gai môi trường