XÁC ĐỊNH PHÂN TỬ LƯỢNG CỦA PHÂN TỬ ADN MẠCH VÒNG Nguyễn Thị Hồng Hạnh Viện Công nghệ Sinh học, Trung tâm KHTN&CNQG. I. MỞ ĐẦU Các ADN mạch vòng được phát hiện trong nhân của vi khuẩn, trong ty thể, trong các lục lạp của thực vật cũng như của động vật [1, 2, 3]. Một ADN vòng có thể là một đơn thể (1a) hoặc một nhị thể với các cấu hình khác nhau. Các ADN mạch vòng gồm hai phần hệt nhau có thể được sắp xếp đối xứng (1b) hoặc không đối xứng (1c). Trong điện trường của điện di thông thường, các ADN mạch thẳng và ADN mạch vòng dịch chuyển trên cùng một quĩ đạo. Tuy nhiên, trong từ trường của điện di xung - PFGE, dưới ảnh hưởng của các vector không cân xứng với hiệu điện thế và thời gian tác động khác nhau [4], các ADN mạch thẳng và mạch vòng dịch chuyển trên các quĩ đạo hoàn toàn riêng biệt và vì vậy có thể xa rời nhau. Dựa trên nguyên tắc trên, điện di xung –PFGE không cân xứng đã được sử dụng để phân biết và phân giải các ADN có các cấu trúc khác nhau Hình 1- Các ADN mạch vòng có thể là một đơn phân (a), nhị phân đối xứng gồm hai nửa giống nhau sắp sếp theo kiểu đầu - chụm - đuôi (b) hoặc không đối xứng có cấu trúc đầu - chụm - đầu (c). Nguyên sinh động vật Leishmania sống ký sinh trong các đại thực bào của người và động vật. Các bệnh mà ký sinh trùng gây nên thường khác nhau, do Leishmania có một hệ genom rất mềm dẻo và luôn thay đổi. Các yếu tố di truyền mạch vòng có nguồn gốc từ một nhiễm sắc thể mẹ thường được phát hiện trong nhân của chúng. Các ADN mạch vòng thường có cấu trúc khác nhau. Mạch vòng CD1 trong L. Major là một nhị phân có cấu trúc đặc biệt gồm hai nửa giống nhau nhưng xếp đặt theo kiểu đầu chụm đầu, trong khi đó mạch vòng CD1 của Leishmania mexicana M379 có thể là một nhị phân [5] Trong bài báo này, chúng tôi trình bầy các phương pháp được sử dụng để xác định phân tử lượng của yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể CD1 của nguyên sinh động vật Leishmania M379 nói riêng và của các ADN mạch vòng nói chung. Phương pháp đã được sử dụng có kết quả để xác định phân tử lượng của một mạch vòng mini trong hệ gen ty thể của nguyên sinh động vật Leishmania [6]. II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP. 1. Nguyên liệu Nguyên sinh động vật Leishmania M379 thuộc chủng Garnham (G1) được nuôi trên môi trường GLSH có bổ xung 10% huyết thanh bê [7] ở nhiệt độ 26o C và cấy chuyển hai lần một tuần. 2. Phương pháp - Tách chiết ADN. Nguyên sinh động vật Leishmania được nuôi trong môi trường GLSH đến giai đoạn log để tách chiết ADN. Ký sinh trùng được ủ trong dung dịch tan (100 mM Tris pH 9 , 200 mM EGTA, 2% EDTA và RNA-ase) trong 2 giờ ở 37 o C. Sau khi bổ xung proteinase K (20g / ml) mẫu được ủ tiếp trong vài giờ ở 55 o C. ADN được làm sạch và tách chiết bằng phenol. - Cắt ADN của Leishmania Các men ClaI và Xbal ( Promega) ở các nồng độ khác nhau được dùng để cắt ADN của Leishmania. Phản ứng cắt được tiến hành ở 37 o C trong 2 giờ. - Chuẩn bị PFGE block Nguyên sinh động vật Leismania nuôi ở giai đoạn log được dùng để chuẩn bị PFGE block theo phương pháp của Van der Ploeg [8] - Đánh dấu đồng vị phóng xạ Phân tử mạch vòng CD1 được tách bằng phương pháp điện di xung PFGE [9]. Chúng được cắt với EcoRI trước khi được đánh dấu phóng xạ với 32 P theo phương pháp đã được công bố [10] - Kỹ thuật điện di xung Các phân tích PFGE nhằm phân tách các nhiễm sẵc thể được tiến hành như đã được miêu tả [9] - Lai Southern và các phép đo đồng vị phóng xạ Lai Southern được tiến hành theo các phương pháp chuẩn [10]. Các tín hiệu lai phóng xạ được phát hiện trên phim Kodak X trong vòng 24 giờ. II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Cắt hạn chế và lai Southern để xác định phân tử lượng của CD1 Nhằm xác định phân tử lượng của yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể CD1, ADN genome của Leishmania, chủng G1 được cắt hoàn toàn với men ClaI. Các đoạn cắt được phân giải bởi điện di PFGE trong 7 giờ và lai Souther với CD1 đánh dấu đồng vị phóng xạ. Như đã thấy ở hình 2, mạch vòng CD1 dường như có phân tử lượng khoảng 28 kb, vì khi cắt CD1 với ClaI, bốn đoạn ADN với phân tử lượng là 3, kb ; 5., 2 kb ; 6 kb và 13 kb đã được phát hiện như mong đợi. Hình 2- Yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể CD1 có trọng lượng phân tử khoảng 28 kb. Bốn đoạn ADN với kích thước thứ tự từ trên xuống dưới 1 (13 kb); 2 ( 6 kb); 3 (5, 2kb) và 4 (3, 7 kb) là sản phẩm cắt hoàn toàn của CD1 với Cla I Xác định cấu trúc của mạch vòng CD1. Việc xem xét phân tử lượng của CD1 được khởi xướng khi rất ngẫu nhiên một đoạn ADN có phân tử lượng  56 kb được phát hiện trong điện trường cuả điện di không cân xứng PFGE. Đoạn ADN này lai đặc trưng với CD1 (hình 3) và không lai với các ADN khác. Chúng tôi giả thiết đoạn ADN mới phát hiện có thể có nguồn gốc từ CD1 với phân tử lượng là 56 kb, nó là một nhị nguyên, cấu tạo từ hai nửa giống nhau theo kiểu đầu – chụm - đuôi. Các kết quả thực nghiệm cho thấy, khi hàm lượng men ClaI cao (1g ADN / 1 đơn vị men), CD1 bị cắt hoàn toàn và cho bốn mảnh ADN với kích thước 13kb ; 6kb ; 5, 2 kb và 3,7 kb (hình 4, hàng 1), còn khi lượng men ClaI bị giảm, CD1 bị cắt hạn chế và cho các sản phẩm cắt khác với trường hợp đầu (hình 4, hàng 2, 3, 4, 5). Các đoạn ADN với kích thước 28 kb, 56 kb, các tín hiệu phóng xạ đi từ giếng của gel quan sát như dự đoán. Như vậy, CD1 đã là một nhị nguyên cân xứng có trọng lượng phân tử là 56 kb với cấu trúc đầu -chụm - đuôi (hình 5). IV. KẾT LUẬN. Bằng việc kết hợp các phương pháp khác nhau của sinh học phân tử như cắt hạn chế, cắt hoàn toàn ADN genomic với các men cắt thích hợp, phương pháp điện di xung PFGE và phương pháp lai phân tích Southern , chúng tôi đã xác định cấu trúc cũng như phân tử lượng của yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể CD1 trong hệ genome của nguyên sinh động vật Leishmania mexicana M379 thuộc chủng Garnham. Chúng tôi đã sử dụng phương pháp này để xác định cấu trúc của một số vòng mini trong hệ gene ty thể của Leishmania mexicana M379 [4b]. Chúng tôi cho rằng phương pháp có thể được sử dụng để xác định phân tử lượng và cấu trúc của bất cứ ADN mạch vòng. Lời cảm ơn: Công trình nghiên cứu này được thực hiện tại phòng thí nghiệm của khoa Sinh học Đại cương, viện Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học, trường Đại học Tự do Brussels, Bỉ. Tác giả cảm ơn sự giúp đỡ của Gs. Ts Hamers. R và các bạn bè đồng nghiệp. Hình 3- Một đoạn ADN mạch thẳng có phân tử lượng  56 kb ( mũi tên ) được phát hiện trong điện trường cuả điện di không cân xứng PFGE. 1: Nhiễm sắc thể của Leishmania mexicana, chủng G1 được phân giải bởi điện di xung không cân xứng PFGE 2: thang chuẩn ADN 49 kb. B) Các nhiễm sắc thể của gel A được lai với CD1 phóng xạ. Hình 4- Sự phối hợp của các phương pháp cho phép xác định cấu trúc nhị phân của CD1. A. Các đoạn của ADN bị cắt bởi men Cla I ở các nồng độ khác nhau ( 1: 1 g ADN /1 đơn vị Cla I; 2: 1 g / 0, 5 đơn vị Cla I; 3: 1 g/ 0, 25 đơn vị Cla I; 4: 1 g / 0, 125 đơn vị Cla I và 5: 1 g / 0, 065 đơn vị Cla I ) B. Lai Southern của gel A Các mũi tên chỉ các phân tử lượng từ trên xuống dưới 56kb; 28 kb; 6 kp; 5,2 kb và 3,7 kb. [...]... Detection of specific sequences among ADN fragments separated by gel electrophoresis J Mol Biol 98 : 503 – 517 4 - Klotz, L C and Zimm B H (1972) Macromolecule 5: 471 - 481 4a - Liu, J (1992) Thesis submitted for the degree of Doctor of Science VUB-Brussels 4b - Nguyễn Thị Hồng Hạnh và Hammers, R (2002) Tạo dòng phân tử và giải toàn bộ trình tự một ADN ty thể của nguyên sinh động vật Leishmania mexicana... Volgelstein, B (1983) A technique for radiolabelling DNA restriction endonuclease fragments to higth specificity Cell Biol 126 : 6 -13 9 - Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2003) Phân biệt các cấu trúc của ADN bằng phương pháp điện di xung PFGE Những vấn đề cơ bản của khoa học sự sống Tr 887- 888 10 - Maniatis, T.M., Frisch, E.F and Sambrook, J (1982) Molecular clonning A laboratory Manual Cold Spring Harbor laboratory Press...Hình 5 - Yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể trong nhân của L mexicana M379, chủng Garnham CD1 là một nhị nguyên cân xứng và có trọng lượng phân tử là  56 kb TÀI LIỆU THAM KHẢO 1- Julian D and Smith D (1978) Plasmid-determine resistance to antimicrobial agents Ann Rev Microbial 32 : 469 – 518 2 - Liu,... the mitochondria genome of Leishmania mexicana M379, strain E8 We believed, that the methods described above could be applied to determine the molecular weight of any circular DNAs Người thẩm định nội dung khoa học: TS Nguyễn Thị Thanh Bình ... laboratory Press Cold Spring Harbor SUMMARY EVALUATION OF THE STRUCTURE AS WELL AS THE MOLECULAR WEIGHT OF CIRCULAR DNAS Nguyen Thi Hong Hanh Institute of Biotechnology, NCST Living organisms possessed ADNs of linear and circular structuctures with different linear and circular configurations Circular DNAs in the genome of living organisms could adopt different configurations as well as different molecular . XÁC ĐỊNH PHÂN TỬ LƯỢNG CỦA PHÂN TỬ ADN MẠCH VÒNG Nguyễn Thị Hồng Hạnh Viện Công nghệ Sinh học, Trung tâm KHTN&CNQG. I. MỞ ĐẦU Các ADN mạch vòng được phát hiện trong nhân của vi. Cắt hạn chế và lai Southern để xác định phân tử lượng của CD1 Nhằm xác định phân tử lượng của yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể CD1, ADN genome của Leishmania, chủng G1 được cắt hoàn. phẩm cắt hoàn toàn của CD1 với Cla I Xác định cấu trúc của mạch vòng CD1. Việc xem xét phân tử lượng của CD1 được khởi xướng khi rất ngẫu nhiên một đoạn ADN có phân tử lượng  56 kb được