ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN  DƯƠNG THANH THỦY KHẢO SÁT TÁC ĐỘNG IN VIVO CỦA TẾ BÀO TUA ĐÃ CẢM ỨNG KHÁNG NGUYÊN TỪ KHỐI U VÀ TẾ BÀO UNG THƯ VÚ SƠ CẤP Chuyên ngành: Sinh Lý Động Vật Mã số chuyên ngành: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. NGUYỄN ĐỨC THÁI Tp. Hồ Chí Minh, 2012 Dương Thanh Thủy LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, con gửi lờ i cảm ơn đến gia đình đã luôn động viên và ủng hộ con. Với con, gia đình luôn là chỗ dựa vững chắc nhất. Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ này không chỉ là thành quả học tập, nghiên cứu của riêng tôi mà còn có cả sự chỉ bảo và giúp đỡ tận tình của Thầy cô, bạn bè và các đồng nghiệp. Con gửi lời cảm ơn chân thành đến Thầy Th.S. Phan Kim Ngọc. Người Thầy đã luôn động viên và tạo điều kiện tốt nhất cho con hoàn thành tốt luận văn này. Con gửi lờ i cảm ơn chân thành đến Thầy TS. Nguyễ n Đức Thái, đã tận tình hướng dẫn con trong suốt thời gian qua. Em cảm ơn Anh Phạm Văn Phúc, đã tận tình chỉ bảo, truyền đạt kiến thức và giúp đỡ em những lúc khó khăn. Tôi cảm ơn Chính Nhân, Thanh Bình, Steven và Minh Nguyệt, đã luôn đồng hành cùng tôi suốt thời gian qua. Cảm ơn các bạn đồng nghiệp đã luôn động viên, hỗ trợ tôi. Dương Thanh Thủy i Dương Thanh Thủy Mục lục MỤC LỤC Trang MỤC LỤC…………………………………………………………………… i! DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT…………………… v DANH MỤC BẢNG……………………………………………………… viii DANH MỤC HÌNH……………………………………………………… ix ĐẶT VẤN ĐỀ………………………………………………………………. 1 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÚ 3 1.1.1. Tình hình ung thư vú 3 1.1.2. Ung thư vú 4 1.1.2.1. Tổng quan 4 1.1.2.2. Các giai đoạn phát triển ung thư vú 4 1.1.3. Các liệu pháp điều trị hiện nay 6 1.1.3.1. Liệu pháp điều trị truyền thống 6 1.1.3.2. Chiến lược điều trị mới 8 1.1.4. Tế bào gốc ung thư vú 9 1.1.5. Mô hình động vật ung thư vú 11 1.1.5.1. Mô hình dị ghép 11 1.1.5.2. Mô hình cảm ứng bằng hóa chất 13 1.1.5.3. Mô hình chuột biến đổi gen 13 1.2. MIỄN DỊCH UNG THƯ 15 1.2.1. Kháng nguyên ung thư 15 1.2.1.1. Các loại kháng nguyên ung thư 15 1.2.1.2. Kháng nguyên ung thư vú 16 1.2.2. Khả năng “lẩn trốn” miễn dịch của ung thư 17 1.2.2.1. Các cơ chế lẩn trốn miễn dịch của ung thư 17 ii Dương Thanh Thủy Mục lục 1.2.2.2. Khả năng kháng miễn dịch trong ung thư vú 18 1.2.3. Tế bào tua 19 1.2.3.1. Đặc tính sinh học của tế bào tua 19 1.2.3.2. Tế bào tua trong ung thư vú 21 1.2.4. Tình hình nghiên cứu điều trị ung thư vú bằng liệu pháp tế bào tua ở Việt Nam và thế giới 22 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27 2.1. VẬT LIỆU 27 2.1.1. Mẫu vật 27 2.1.1.1. Nguồn tế bào 27 2.1.1.2. Động vật thí nghiệm 27 2.1.2. Hóa chất 27 2.1.2.1. Hóa chất nuôi tế bào ung thư vú 27 2.1.2.2. Hóa chất tạo mô hình 28 2.1.2.3. Hóa chất nuôi tế bào tua 28 2.1.2.4. Hóa chất khác 28 2.1.3. Dụng cụ 29 2.1.4. Thiết bị 30 2.2. PHƯƠNG PHÁP 31 2.2.1. Quy trình nghiên cứu tổng quát 31 2.2.2. Nội dung 1: Nuôi cấ y sơ cấp tế bào ung thư vú từ khối u 32 2.2.2.1. Nuôi cấy tế bào ung thư vú từ mảnh mô khối u vú 32 2.2.2.2. Đánh giá quần thể tế bào sơ cấp 34 2.2.3. Nội dung 2: Biệt hóa và trư ở ng thành tế bào đơn nhân tủy xương chuột thành tế bào tua 35 2.2.3.1. Quy trình nuôi cấy 35 2.2.3.2. Kiểm tra đặc tính tế bào tua đã biệt hóa 36 2.2.3.3. Cảm ứng tế bào tua với kháng nguyên ung thư 37 2.2.4. Nội dung 3: Xây dự ng mô hình chuột ung thư vú dị ghép 38 iii Dương Thanh Thủy Mục lục 2.2.4.1. Tạo mô hình chuột suy giảm miễn dịch 38 2.2.4.2. Nuôi cấy dòng tế bào ung thư vú người Việt Nam chuyển gen GFP 39 2.2.4.3. Tạo mô hình chuột mang khối u vú 40 2.2.4.4. Đánh giá hiệu quả tạo mô hình 40 2.2.5. Nội dung 4: Đánh giá tác động in vivo của tế bào tua đã cảm ứng kháng nguyên thu từ khối u và tế bào ung thư vú sơ cấp 41 2.2.5.1. Bố trí thí nghiệm 41 2.2.5.2. Đánh giá sự thay đổi kích thước khối u 42 2.2.5.3. Đánh giá sự biến động bạch cầu tổng 43 2.2.5.4. Đánh giá sự khác biệt lượng tế bào gây ung thư 43 2.2.5.5. Thống kê kết quả 44 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 45 3.1. NỘI DUNG 1: NUÔI CẤY SƠ CẤP TẾ BÀO UNG THƯ VÚ THU TỪ KHỐI U 45 3.1.1. Sự tăng sinh và hình thái tế bào ung thư sơ cấp 45 3.1.2. Hiệu quả nuôi cấy sơ cấp 49 3.1.3. Đánh giá quần thể tế bào ung thư vú sơ cấp 52 3.1.4. Kết luận và biện luận chung 52 3.2. NỘI DUNG 2: BIỆT HÓA, TRƯỞNG THÀNH TẾ BÀO ĐƠN NHÂN TỦY XƯƠNG CHUỘT THÀNH TẾ BÀO TUA 54 3.2.1. Hiệu quả biệt hóa và trưởng thành tế bào tua từ tủy xương chuột 54 3.2.2. Đánh giá tế bào tua thu nhận từ tủy xương chuột 56 3.3. NỘI DUNG 3: XÂY DỰNG MÔ HÌNH CHUỘT UNG THƯ VÚ DỊ GHÉP 57 3.3.1. Hiệu quả gây suy giảm miễn dịch trên chuột nhắt trắng 57 3.3.2. Nuôi cấy dòng tế bào VNBC-GFP 58 3.3.3. Hiệu quả tạo mô hình chuột mang khối u vú ngư ờ i 59 3.3.3.1. Hình thái bên ngoài 59 iv Dương Thanh Thủy Mục lục 3.3.3.2. Khả năng phát huỳnh quang của khối u chuột 59 3.3.3.3. Mô học khối u chuột 60 3.4. NỘI DUNG 4: ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG IN VIVO CỦA TẾ BÀO TUA ĐÃ CẢM ỨNG KHÁNG NGUYÊN THU TỪ KHỐI U VÀ TẾ BÀO UNG THƯ VÚ SƠ CẤP 62 3.4.1. Hình thái bên ngoài 62 3.4.2. Sự biến động bạch cầu tổng 63 3.4.3. Sự thay đổi kích thướ c khối u 65 3.4.4. Sự thay đổi tỷ lệ tế bào VNBC-GFP trong khối u 67 3.4.5. Mô học khối u 69 3.4.5.1. Mô nhuộm H&E 69 3.4.5.2. Sự phát huỳnh quang trên mảnh cắt lát mô 70 3.4.6. Kết luận và biện luận chung 71 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 77 4.1. KẾT LUẬN 77 4.2. ĐỀ NGHỊ 78 v Dương Thanh Thủy Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 5-FU 5-fluorouracil ABC ATP-binding cassette ABC G2 ATP-binding casstte sub-family G member 2 AFP Antigen Fetoprotein Kháng nguyên protein bào thai ALDH Aldehyde Dehydrogenase APC Antigen Presenting Cell Tế bào trình diện kháng nguyên Bcr-Abl Break point cluster-Abelson BLG Beta Lactoglobin BMP-4 Bone morphogenetic protein 4 BRCA1/2 Breast cancer 1/2 Gen ung thư vú BU Busulfan CA-125/ 19-9 Cancer antigen 125/ 19-9 Kháng nguyên ung thư CAF/FAC Cyclophosphamide, Doxurubicin, 5-Fluorouracil CCL22 Chemokine (C-C motif) Ligand 22 CCR7 C-C Chemokine Receptor type 7 Thụ thể Chemokine C-C loại 7 CD Cluster of Differentiation Cụm biệt hóa CDH1 Cadherin-1 CEA Carcinoembryonic Antigen Kháng nguyên u quái CEF/FEC Cyclophosphamide, Epirubicin, 5-Fluorouracil CHECK2 Checkpoint Kinase 2 CM1/2 Condition Medium 1/2 CMF Cyclophosphamide, Methotrexate, 5-Fluorouracil CTL Cytotoxicity T cell Tế bào T gây độc CY Cyclophosphamide DC Dendritic cell Tế bào tua DC-LAMP Dndritic cell Lysosomal Associated Membrance Protein Protein màng liên quan lysosome tế bào tua DMBA 7,12-dimethylbenz[a]anthrancene DMEM Dulbecco's Modiffied Eagle Medium DNA Deoxyribonucleic acid Ecad E-Cadherine EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid vi Dương Thanh Thủy Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt EGFR Epidermal Growth Factor Receptor Thụ thể nhân tố tăng trưởng biểu mô ENU N-ethyl-N-nitrosourea ER Estrogen Receptor Thụ thể estrogen Erbb2 V-erb-b2 erythroblastic FasL Fas Ligand FGF Fibroblast Growth Factor Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi GD3 Ganglioside D3 GEM Genetically Enginerered Mice GM-CSF Granulocyte Macrophage Colony Nhân tố kích thích Stimulating Factor dòng đại thực bào hạt GM2 Ganglioside M2 HER2 Human Epidermal Growth Thụ thể tăng trưởng Receptor 2 biểu mô người HPV Human apilloma virus Virus gây ung thư cổ tử cung HTLV-1 Human T Lymphotropic Virus-1 Virus gây ung thư tế bào T IARC International Agency for Cơ quan nghiên cứu Research on Cancer ung thư quốc tế IFN Interferone IL Interleukine LAIR Leukocyte-associated Thụ thể cho phân tử giống immunoglobulin-like receptor Ig liên quan bạch cầu LCIS Lobular carcinoma in situ M171 Medium 171 MCF7 Michigan Cancer Foudation 7 Dòng tế bào ung thư vú do Tổ chức Michigan tạo ra MDSC Myeloid Derived Suppressor Cells Tế bào dòng tủy ức chế MHC Major histocompatibility complex Phức hợp phù hợp mô MMP Matrix Metalloproteinase MMTV-LTK Mouse Mammary Tumor Virus gây ung thư vú ở chuột Virus Long Terminal Repeat MNU N-methyl-N-nitrosourea MUC1 Mucin 1 NK Natural Killer Tế bào giết tự nhiên NOD Nonobese Diabetic Tiểu đường không béo phì PBS Phosphate buffered Saline PDL1 Programmed cell death 1 ligand Ligand tế bào chết theo chương trình PR Progesterone receptor Thụ thể progesterone PTEN Phosphatase and tensin homolog vii Dương Thanh Thủy Danh mục các ký hiệu và chữ viết tắt RPMI Roswell Park Memorial Institute SCID Severe Combined Immunodeficient Chuột ức chế miễn dịch SN Sentinel Node TGF-β Transforming Growth Factor β Nhân tố tăng trưởng chuyển dạng beta TLR T lymphocyte Receptor Thụ thể bạch cầu T TNF Tumor necrosis factor Nhân tố hoại tử mô ung thư TNM Tumor-Node-Metastasis Chỉ tiêu phân loại ung thư vú dựa trên kích thước khối u, hạch u và di căn Treg T regular Tế bào T điều hòa UV Ultraviolet Tia tử ngoại VEGF Vascular endothelial growth factor Nhân tố tăng trưởng nội mô mạch máu VNBC-GFP Vietnamese Breast Cancer cell expressed GFP Dòng tế bào ung thư vú người Việt Nam biểu hiện GFP WAP Whey Acidic Protein viii Dương Thanh Thủy Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 2. 1. Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu 29 Bảng 2. 2. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 30 Bảng 2. 3. Bố trí thí nghiệm theo thời gian tiến hành 41 Bảng 3. 1. Thống kê hiệu quả nuôi cấy thành công………………………………. 50 Bảng 3. 2. Tỷ lệ tế bào ung thư và tế bào gốc ung thư vú trong quần thể tế bào sơ cấp 52 [...]... chuột thành tế bào tua 3 Xây dựng mô hình chuột ung thư vú dị ghép 4 Đánh giá tác động in vivo của tế bào tua đã cảm ứng kháng nguyên thu từ khối u và tế bào ung thư vú sơ cấp Dương Thanh Thủy Đặt vấn đề 3 1 TỔNG QUAN TÀI LI U 1.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ VÚ 1.1.1 Tình hình ung thư vú Ung thư vú là loại ung thư thường gặp và gây tử vong hàng đ u ở phụ nữ các nước công nghiệp Theo cơ quan nghiên c u ung thư. .. tính ung thư phức tạp trên từng bệnh nhân Vì vậy, nhằm hướng đến li u pháp đi u trị hi u quả cho từng bệnh nhân, chi phí thấp, dễ thực hiện, phù hợp với đi u kiện Việt Nam, đề tài Khảo sát tác động in vivo của tế bào tua đã cảm ứng kháng nguyên từ khối u và tế bào ung thư vú sơ cấp sử dụng nguồn kháng nguyên khối u đơn giản, dễ thu nhận để cảm ứng lượng thấp tế bào tua (105 tế bào) nhằm mục ti u: Bước... Hình 3 25 Bi u đồ sự biến động bạch c u tổng trước và sau khi tiêm tế bào tua trong lô thí nghiệm và lô đối 64 Hình 3 26 Bi u đồ biến động bạch c u tổng giữa các lô thí nghiệm tiêm tế bào tua cảm ứng kháng nguyên từ tế bào ung thư sơ cấp và khối u 65 Hình 3 27 Bi u đồ thay đổi kích thư c khối u trong chuột được tiêm tế bào tua cảm ứng kháng nguyên từ khối u và tế bào sơ cấp 66... tổng số của toàn tế bào) và tế bào tua [22] Tế bào tua có tính u việt trong trình diện kháng nguyên, đặc biệt là kháng nguyên ung thư, kích hoạt được hệ thống miễn dịch đặc hi u ti u diệt tế bào ung thư Nhưng trong đi u kiện in vitro, tế bào tua có khả năng trình diện được kháng nguyên ung thư cho độc bào T và dẫn đến ti u diệt tế bào ung thư Các nhà khoa học cho rằng có thể sử dụng tế bào tua của cơ... hóa sớm của tế bào gốc thông qua sự oxi hóa retinol thành acid retinoic Ki u hình ALDFELUOR dương tính được sử dụng như một chỉ ti u để chọn lọc tế bào gốc ung thư vú [23] Tế bào ung thư vú, tế bào gốc ung thư vú có thể được thu nhận từ ba nguồn: các dòng tế bào ung thư vú thư ng mại, tế bào nuôi cấy sơ cấp từ khối u bệnh nhân, tế bào trong khối u dị ghép trên chuột ức chế miễn dịch Từ khối u bệnh nhân... ti u: Bước đ u tìm hi u những tác động đến hệ miễn dịch và ức chế tăng trưởng ung thư của tế bào tua đã cảm ứng kháng nguyên từ khối u và tế bào ung thư vú sơ cấp trên mô hình chuột; từ đó làm tiền đề cho những nghiên c u s u hơn và những thử nghiệm lâm sàng trên bệnh nhân Đề tài được tiến hành với bốn nội dung chính: 1 Nuôi cấy sơ cấp tế bào ung thư vú từ khối u 2 Biệt hóa và trưởng thành tế bào đơn nhân... thể, biến đổi và cảm ứng trình diện kháng nguyên in vitro sau đó đưa vào cơ thể bệnh nhân, DC này trình diện kháng nguyên cho tế bào T CD4+ và CD8+ và dẫn đến ti u diệt tế bào ung thư [18] Trong nghiên c u DC trị ung thư vú cần quan tâm đến: nguồn và cách chuẩn bị DC; hoạt tính của DC; nguồn kháng nguyên ung thư; kĩ thuật cảm ứng kháng nguyên và quy trình tiêm chủng DC [18] Có ba nguồn DC từ bệnh nhân:... nguyên ung thư có thể là: khối u /tế bào ung thư phân giải; epitop peptide và protein kháng nguyên chuyên biệt; nucleic acid xác định kháng nguyên ung thư tổng số; và dung hợp tế bào ung thư và DC [18]   Dương Thanh Thủy Tổng quan tài li u 23 Báo cáo đ u tiên sử dụng vaccine DC cho ung thư vú được tiến hành trên chuột được tiêm chủng dưới da với hỗn hợp DC chưa trưởng thành từ tủy xương và tế bào ung. .. Bi u đồ thay đổi kích thư c khối u trong lô đối chứng và thí nghiệm 67 Hình 3 29 Bi u đồ tỷ lệ % tế bào VNBC-GFP trong khối u của các lô chuột tiêm tế bào tua cảm ứng kháng nguyên từ khối u và tế bào sơ cấp 68 Hình 3 30 Bi u đồ tỷ lệ % tế bào VNBC-GFP trong khối u chuột của các lô đối chứng và thí nghiệm 68 Hình 3 31 Hình thái tế bào trong m u khối u chuột tiêm PBS (a) và tiêm tế bào. .. TLR3 cho hi u quả kháng ung thư cao gấp 40 lần so với tế bào tua trưởng thành trong môi trường chứa TNF-α, IL-1β và IFN-γ Vì vậy có thể thấy TLR3 có vai trò quan trọng trong hi u quả kháng ung thư của tế bào tua thu từ nuôi cấy in vitro [44] 1.2.3.2 Tế bào tua trong ung thư vú Bên trong khối u vú của bệnh nhân có sự hiện diện của tế bào tua chưa trưởng thành CD1a+ nhưng vùng ngoại vi xuất hiện DC trưởng . phát huỳnh quang của khối u chuột 59 3.3.3.3. Mô học khối u chuột 60 3.4. NỘI DUNG 4: ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG IN VIVO CỦA TẾ BÀO TUA ĐÃ CẢM ỨNG KHÁNG NGUYÊN THU TỪ KHỐI U VÀ TẾ BÀO UNG THƯ VÚ SƠ CẤP. chuột mang khối u vú 40 2.2.4.4. Đánh giá hi u quả tạo mô hình 40 2.2.5. Nội dung 4: Đánh giá tác động in vivo của tế bào tua đã cảm ứng kháng nguyên thu từ khối u và tế bào ung thư vú sơ cấp. cảm ứng kháng nguyên từ tế bào ung thư sơ cấp và khối u 65 Hình 3. 27. Bi u đồ thay đổi kích thư c khối u trong chuột được tiêm tế bào tua cảm ứng kháng nguyên từ khối u và tế bào sơ cấp 66