108 dƣơng tính thể hiện ở dạng các tế bào vi khuẩn ở ống tƣơng ứng ngƣng tụ lại làm đục cả ống nghiệm, trong khi ở các ống âm tính vi khuẩn (kháng nguyên) chìm xuống đáy ống làm dịch trở nên trong. Ngƣng kết thấy rõ ở những ống nghiệm có nồng độ kháng nguyên và kháng thể gần bằng nhau, vì vậy ở những ống có nồng độ kháng thể cao (đầu dãy) có thể không thấy ngƣng kết. Nhờ phản ứng này ta có thể xác định đƣợc hiệu giá kháng thể trong huyết thanh bị kiểm. Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng lớn nhất của huyết thanh (hoặc nhũ thanh, ) còn cho phản ứng dƣơng tính. Phản ứng ngƣng kết có thể thực hiện theo chiều khác để phát hiện kháng nguyên đặc hiệu tức là xác định typ/dạng huyết thanh học của vi khuẩn hoặc vi sinh vật khác. Khi đó thƣờng phải có bộ kháng huyết thanh đa giá (xác định nhóm) và đơn giá (xác định typ). Trong thực tế các virut đƣợc coi là kháng nguyên hòa tan và không thể thực hiện phản ứng ngƣng kết. Tuy vậy, bằng cách gắn kết virut lên hồng cầu ngƣời ta có thể tạo đƣợc kháng nguyên hữu hình đặc hiệu virut có tính ngƣng kết hoàn hảo với kháng thể và đƣợc áp dụng trong một biến thể của phản ứng huyết thanh học, phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp phát hiện và bán định lƣợng kháng thể. Đồng thời, kháng nguyên này cũng còn đƣợc sử dụng trong phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gián tiếp phát hiện kháng nguyên bằng cách lấy kháng huyết thanh chuẩn cho tiếp xúc trƣớc với bệnh phẩm chứa kháng nguyên nghi rồi đo lại hàm lƣợng (hiệu giá) kháng thể bằng phản ứng ngƣng kết hồng cầu gián tiếp. Sự sụt giảm hiệu giá kháng thể trong kháng huyết thanh chuẩn chứng tỏ có kháng nguyên đặc hiệu trung hòa kháng thể đó. 1.3. Phản ứng cố định bổ thể Phản ứng cố định bổ thể (CFR) hay còn gọi là phản ứng kết hợp bổ thể là phản ứng huyết thanh học phát hiện tổ hợp kháng nguyên - kháng thể thông qua vận dụng thuộc tính gây dung giải tế bào, kể cả tế bào hồng cầu, của hệ thống bổ thể (các enzym trong huyết tƣơng động vật có vai trò trong miễn dịch không đặc hiệu) một khi hệ thống này đƣợc hoạt hóa nhờ kháng thể khi kháng thể hình thành tổ hợp kháng nguyên - kháng thể. Phản ứng này gồm hai hệ thống: 1) hệ thống phản ứng chính và 2) hệ thống phản ứng hiển thị (hệ thống phụ, hay hệ thống dung huyết). Bổ thể là một hệ thống gồm 9 protein (C1 đến C9) hòa tan trong huyết tƣơng ở trạng thái vô hoạt và có thể đƣợc hoạt hóa theo phản ứng dây chuyền từ C1 đến C9 một khi C1 đƣợc hoạt hóa (con đƣờng cổ điển) 109 hoặc C3 đƣợc hoạt hóa (con đƣờng nhánh). Yếu tố C1 đƣợc hoạt hóa nhờ phần Fc của kháng thể khi kháng thể kết hợp với kháng nguyên (Fc từ trạng thái vô hoạt sang trạng thái hoạt động của một enzym). Khi tổ hợp bổ thể đƣợc hoạt hóa một số yếu tố sản phẩm của bổ thể đƣợc hình thành và gắn kết lên cấu trúc màng tế bào chất làm hình thành tổ hợp tấn công màng (MAC - membrane attacking complex) là những lỗ khổng bất thƣờng trên màng tế bào chất qua đó tế bào chất bị thoát ra ngoài (dung bào) (bên cạnh các phản ứng quá mẫn, viêm và hoạt hóa thực bào, ). Tuy nhiên, các bổ thể là những protein mẫn cảm với nhiệt. Đun ở 56 - 58 °C nhanh chóng làm biến tính bổ thể, trong khi nếu đun ở nhiệt độ này sau 30 phút kháng thể vẫn giữ nguyên hoạt tính. Ở hệ thống phản ứng chính ngƣời ta trộn kháng nguyên chuẩn (1 ml) với huyết thanh (1 ml) cần kiểm đã đƣợc đun nóng vô hoạt bổ thể rồi thêm vào đó một lượng ở nồng độ làm việc của bổ thể là huyết thanh chuột lang tƣơi mới. Sau khi ủ 15 phút ở 37 °C thì cho thêm vào đó một lƣợng nhất định (1 ml) hỗn hợp hệ thống phụ pha sẵn. Lại ủ nhƣ trên, sau 15 phút kiểm tra kết quả. Phản ứng chính dƣơng tính thể hiện dƣới dạng hồng cầu chìm xuống đáy ống nghiệm (phản ứng phụ âm tính). Ngƣợc lại, phản ứng chính âm tính thể hiện dƣới dạng dịch trong ống nghiệm có màu đỏ của hemoglobin (phản ứng phụ dƣơng tính). Nồng độ làm việc của bổ thể được xác định trước (vào đầu ngày làm việc) nhờ dãy ống pha loãng dần huyết thanh chuột lang trong nƣớc sinh lý (1 ml mỗi ống) rồi cho vào tất cả các ống trong dãy một lƣợng (1 ml) hỗn hợp hệ thống phụ pha sẵn. Trong hệ thống phụ này có kháng nguyên là huyền dịch 6% tế bào hồng cầu cừu trộn đều với kháng thể là kháng huyết thanh thỏ tối miễn dịch (mẫn hóa) với hồng cầu cừu gọi là hemolysin. Sau khi ủ 15 phút ở 37 °C, trong ống nghiệm có đủ bổ thể sẽ thấy dung huyết (dịch đỏ đều) còn các ống có nồng độ bổ thể quá thấp sẽ không xuất hiện dung huyết (hồng cầu chìm xuống đáy ống, dịch trên trong). Nồng độ làm việc của bổ thể là ở ống có độ pha loãng lớn nhất còn cho phản ứng dung huyết. Pha huyết thanh chuột lang tƣơi mới ở nồng độ này ta sẽ có dung dịch bổ thể ở nồng độ làm việc. Lượng làm việc của bổ thể đƣợc giữ ổn định (1 ml) trong quá trình thực hiện phản ứng. 1.4. Phản ứng HI (ngăn trở ngƣng kết hồng cầu) Nhiều virut có thuộc tính ngƣng kết hồng cầu. Chúng có thụ thể tƣơng ứng với thụ thể có trên bề mặt hồng cầu, do đó kết nối các hồng cầu liền kề lại với nhau thành mạng đa chiều không chìm xuống đáy tự nhiên 110 nhờ tỷ trọng của hồng cầu cao hơn tỷ trọng dung dịch sinh lý. Phản ứng ngƣng kết hồng cầu của virut giúp ta phát hiện đƣợc sự hiện diện cũng nhƣ bán định lƣợng virut tƣơng ứng. Đồng thời, ngƣời ta còn lợi dụng đặc tính này của virut để xác định sự hiện diện cũng nhƣ hiệu giá kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh cần kiểm dƣới dạng phản ứng ngăn trở ngƣng kết hồng cầu (HI: hemagglutination inhibition reaction). Trƣớc tiên ngƣời ta phải thực hiện phản ứng ngƣng kết hồng cầu để xác định hiệu giá của virut chuẩn rồi trên cơ sở đó pha dịch virut làm việc với hiệu giá 4 đơn vị ngƣng kết (4 HA). Phản ứng này đƣợc thực hiện trên khay nhựa vi chuẩn độ (Microtitration plate) 96 lỗ (mỗi lỗ chứa khoảng 0,4 ml) đáy U hoặc V. Cho vào mỗi lỗ 50 μl nƣớc sinh lý NaCl rồi cho vào lỗ thứ nhất 50 μl virut, trộn và chuyển sang lỗ thứ hai, rồi tiếp tục trộn chuyển nhƣ vậy đến hết lỗ thứ 10 thì vứt bỏ 50 μl. Hai lỗ 11 và 12 dùng làm đối chứng âm tính chỉ chứa nƣớc sinh lý để xác định thời điểm đọc kết quả tốt nhất. Cho 50 μl huyền dịch hồng cầu thích hợp (0,5% hoặc 1%, khối lƣợng tƣơi trên thể tích, luôn ở trạng thái khuấy đều). Trộn đều rồi để yên ở nhiệt độ phòng 15 đến 60 phút, đọc kết quả khi hai lỗ 11 và 12 có hồng cầu chìm xuống tâm đáy lỗ hoàn toàn. Hồng cầu ngƣng kết tạo mạng đa chiều không chìm xuống tâm đáy lỗ khay mà dàn trải đều khắp lỗ hoặc nếu chìm chúng cũng tỏa rộng và thƣờng tạo một lớp nhăn nheo khắp mặt đáy lỗ. Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng lớn nhất còn cho kết quả dƣơng tính. Nồng độ virut làm việc phải chứa 4 HA chính là nồng độ của virut ở độ pha loãng cách đó hai lỗ khay (2 2 =4). Pha virut gốc để có nồng độ này rồi kiểm tra lại với phản ứng trong 4 lỗ khay có nồng độ 2 HA, 1 HA, 1/2 HA và 1/4 HA. Nếu dịch virut bị nhạt (tức ít nhất có một trong hai lỗ nửa bên trái không ngƣng kết) thì pha thêm virut cho đủ sao cho hai lỗ đầu có ngƣng kết rõ còn hai lỗ sau không thấy ngƣng kết. Ngƣợc lại nếu virut quá đặc (có ít nhất ba lỗ ngƣng kết) thì pha thêm nƣớc sinh lý để vừa đủ tạo ngƣng kết ở hai lỗ. Phản ứng HI cũng đƣợc tiến hành trên khay nhựa vi chuẩn độ 96 lỗ, mỗi dãy lỗ khay cho một phản ứng. Đầu tiên pha huyết thanh theo cấp số 2. Cho vào mỗi lỗ 50 μl nƣớc sinh lý NaCl rồi cho vào lỗ thứ nhất 50 μl huyết thanh kiểm, trộn và chuyển sang lỗ thứ hai, rồi tiếp tục trộn chuyển nhƣ vậy đến hết lỗ thứ 10 thì vứt bỏ 50 μl. Cho vào mỗi lỗ từ lỗ 1 đến lỗ 11 (đối chứng âm) 50 μl dịch virut làm việc 4 HA, trộn đều và ủ 5 - 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó cho vào tất cả các lỗ (lỗ 1 đến 12) 50 μl 111 huyền dịch hồng cầu đã dùng để xác định hiệu giá HA. Hai lỗ 11 và 12, nhƣ vậy, dùng làm đối chứng âm tính (chứa chỉ virut và hồng cầu) và dƣơng tính (chứa chỉ nƣớc sinh lý và hồng cầu). Để ở nhiệt độ phòng và đọc kết quả sau 15 đến 60 phút phụ thuộc vào kết quả chìm hồng cầu ở lỗ thứ 12 (đối chứng HI dƣơng tính: hồng cầu phải chìm hoàn toàn xuống tâm đáy lỗ khay). Hiệu giá kháng thể là độ pha loãng cao nhất của huyết thanh mà ở đó còn thấy ngăn trở đƣợc ngƣng kết (hồng cầu chìm xuống đáy lỗ). 1.5. Các phƣơng pháp kháng thể đánh dấu Các phƣơng pháp kháng thể đánh dấu gồm phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang, miễn dịch phóng xạ, miễn dịch enzym và miễn dịch ferritin. Phƣơng pháp cuối cùng áp dụng với kính hiển vi điện tử để kiểm tra cấu trúc phân tử trên bề mặt tế bào hoặc tổ chức nhờ mật độ điện tử cao của ferritin, không phổ biến trong chẩn đoán. Bản chất các phƣơng pháp này là sử dụng các kháng thể (thƣờng là kháng thể đơn dòng) đƣợc gắn kết (đánh dấu) với một chất phát huỳnh quang (kháng thể đánh dấu huỳnh quang), hoặc chất phóng xạ (kháng thể đánh dấu phóng xạ), hoặc một enzym chuyển hóa làm cơ chất không màu phát màu (kháng thể đánh dấu enzym). Chúng còn đƣợc gọi chung là conjugat (conjugate). Ta có conjugat trực tiếp nếu đó là kháng thể đặc hiệu epitop của mầm bệnh hay đối tƣợng cần nghiên cứu, hoặc là conjugat gián tiếp nếu đó là kháng thể đặc hiệu gamma-globulin của loài động vật cần nghiên cứu. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang trực tiếp bắt đầu bằng việc cố định kháng nguyên cần kiểm lên phiến kính hiển vi (thƣờng bằng aceton lạnh), sau đó phủ conjugat trực tiếp 30 phút trong buồng ẩm. Rửa bằng nƣớc rồi soi kính hiển vi huỳnh quang (trong tối) với bức xạ kích thích thích hợp với thuốc nhuộm huỳnh quang gắn conjugat, nếu thấy tiêu bản phát màu huỳnh quang đặc hiệu là kết quả dƣơng tính. Phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp bắt đầu bằng việc cố định kháng nguyên chuẩn nếu để phát hiện kháng thể (hoặc kháng nguyên cần kiểm) lên phiến kính hiển vi, sau đó phủ huyết thanh cần kiểm (hoặc kháng huyết thanh chuẩn), cho tiếp xúc 30 phút ở trong buồng ẩm, rửa bằng nƣớc rồi lại phủ bằng conjugat huỳnh quang gián tiếp chống gamma- globullin loài cho huyết thanh lần phủ trƣớc. Sau 30 phút tiếp xúc lại rửa, để khô và hiển vi huỳnh quang. Kết quả dƣơng tính tƣơng tự phƣơng pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp. Tuy nhiên, phƣơng pháp gián tiếp có độ 112 nhạy cao hơn và tiện hơn do có thể nghiên cứu kháng nguyên lẫn nghiên cứu kháng thể. Phản ứng miễn dịch phóng xạ sử dụng conjugat phóng xạ. Tiến trình cũng bắt đầu bằng việc cố định (trên phiến kính hoặc trên màng), phủ và rửa tƣơng tự phản ứng miễn dịch huỳnh quang. Tuy nhiên, kết quả phản ứng đƣợc đọc nhờ ép bản phản ứng lên một phim X-quang, để khoảng 30 - 60 phút thì rửa hiển thị phim. Vệt đen trên phim tƣơng ứng vị trí tiêu bản cho phép kết luận kết quả dƣơng tính. Cũng có thể đọc kết quả nhờ ống đo phóng xạ (scintillation counter) bằng cách cho tiêu bản tiếp xúc với đầu dò đọc của thiết bị. Phản ứng miễn dịch enzym gồm nhiều biến thể, sử dụng khay nhựa polystyren để hấp phụ protein (ELISA) hoặc cố định protein lên màng nitrocelluloza hay nylon (immunoanalysis, hay Western analysis). Các biến thể này đều có thể sử dụng conjugat trực tiếp lẫn conjugat gián tiếp. Phản ứng trực tiếp chỉ phát hiện đƣợc kháng nguyên trong khi phản ứng gián tiếp phát hiện đƣợc cả kháng nguyên (nếu có kháng thể đặc hiệu) và kháng thể (nếu có kháng nguyên đặc hiệu). Phƣơng pháp ELISA trực tiếp bắt đầu từ việc cố định (hấp phụ) protein kháng nguyên cần kiểm lên đáy và thành của lỗ khay chuyên dụng (khay ELISA) nhờ phản ứng kiềm của môi trƣờng trong một đêm. Sau khi rửa khay bằng dung dịch PBS (3 lần, có pha Tween 20 ở mức 0,5%), khay đƣợc phủ bổ sung bằng dung dịch protein huyết thanh bê hoặc albumin trứng (blocking), rửa lại rồi cho conjugat trực tiếp tiếp xúc kháng nguyên trong khoảng 1 giờ, rửa rồi cho dung dịch cơ chất của enzym vào lỗ. Nếu phản ứng kháng nguyên - kháng thể dƣơng tính, cơ chất enzym sẽ chuyển từ không màu sang có màu và có thể đo đƣợc bằng quang phổ kế. Phản ứng chuyển màu có thể dừng bằng dung dịch NaOH hoặc H 2 SO 4 . Enzym có thể là phosphataza kiềm hoặc peroxidaza. Cơ chất enzym có thể là tetramethyl benzidin hoặc axit 5-aminosalicylic đối với enzym peroxidaza. Các chất này đều phải pha mới và pha thêm H 2 O 2 3% trƣớc khi dùng hiển thị phản ứng. Phƣơng pháp ELISA trực tiếp còn có thể thực hiện dƣới dạng phản ứng sandwich ("bánh mỳ kẹp thịt"), khi đó lỗ khay đƣợc gắn sẵn kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên cần kiểm để tăng hiệu quả gắn kết kháng nguyên với lỗ khay. Đầu tiên cho kháng nguyên tiếp xúc với kháng thể gắn trong lỗ khay khoảng 30 phút rồi rửa các lỗ khay. Tiếp theo sau là phủ lỗ khay bằng conjugat đặc hiệu và các bƣớc rửa và hiển thị nhƣ đã mô tả ở 113 trên. Trong lỗ khay cho phản ứng dƣơng tính nhƣ vậy có ba lớp, một lớp kháng nguyên giữa hai lớp kháng thể, nên phƣơng pháp đƣợc gọi là "bánh mỳ kẹp thịt". Phƣơng pháp ELISA gián tiếp sử dụng conjugat gián tiếp, tức là kháng thể đặc hiệu với gamma-globulin loài cung cấp kháng huyết thanh đặc hiệu (trong phát hiện kháng nguyên) hoặc huyết thanh cần kiểm (trong phát hiện kháng thể) đƣợc đánh dấu enzym. Tƣơng tự phƣơng pháp ELISA trực tiếp, trong phƣơng pháp ELISA gián tiếp để phát hiện kháng nguyên ban đầu ngƣời ta cố định dịch bệnh phẩm hay kháng nguyên (hấp phụ trong dịch pH cao, thƣờng qua đêm) vào lỗ khay, rửa rồi phủ bổ sung (blocking) bằng dịch protein (không kháng thể, ở nhiệt độ thấp). Sau đó phủ kháng nguyên bằng kháng huyết thanh đặc hiệu mầm bệnh, rửa rồi lại phủ bằng dịch conjugat gián tiếp. Sau khi rửa kỹ, phủ lỗ khay bằng cơ chất enzym thích hợp. Phản ứng màu giúp ta xác định sự hiện diện của kháng nguyên đặc hiệu. Để phát hiện kháng thể bằng phƣơng pháp ELISA gián tiếp, cần cố định kháng nguyên đặc hiệu vào lỗ khay, hấp phụ bổ sung bằng protein không kháng thể, sau khi rửa ngƣời ta cho huyết thanh cần kiểm vào cho tiếp xúc với kháng nguyên. Sau bƣớc rửa, cho dịch conjugat gián tiếp, lại rửa kỹ rồi cho cơ chất enzym thích hợp để hiển thị. Phản ứng phát màu của cơ chất giúp ta xác nhận sự hiện diện của kháng thể đặc hiệu trong huyết thanh cần kiểm. 1.6. Phƣơng pháp điện di miễn dịch Đây là phƣơng pháp kiểm tra sự hiện diện kháng thể đặc hiệu virut có bề mặt tích điện âm mạnh và virut tích điện âm mạnh. Nếu cho kháng nguyên và huyết thanh cần kiểm đƣợc điện di song song trong một bản keo (gel) agarose hoặc agar thì nếu trong huyết thanh có kháng thể đặc hiệu sẽ xuất hiện vết kết tủa ở dải giữa hai làn điện di. Phƣơng pháp này thƣờng để kiểm tra bệnh cảm nhiễm virut Aleutian ở chồn mink. 2. Chẩn đoán bằng phản ứng quá mẫn muộn Phản ứng quá mẫn muộn để phát hiện miễn dịch tế bào ở trong cơ thể và vận dụng với một số bệnh thú y hình thành miễn dịch tế bào nhƣ bệnh lao, bệnh tỵ thƣ, bệnh Johne (á lao) và bệnh sẩy thai truyền nhiễm. Lấy dịch chiết từ lứa cấy tế bào vi khuẩn nuôi cấy lâu ngày ta đƣợc "dị ứng nguyên quá mẫn muộn", với bệnh lao gọi là tubercullin, với bệnh sẩy thai 114 truyền nhiễm là brucellin, với bệnh tỵ thƣ là mallein và với bệnh Johne là johnin. Ngoài ra phản ứng này còn thực hiện với bệnh sán lá gan, sán nang (Echinococcus), bệnh cảm nhiễm Toxoplasma, bệnh cảm nhiễm nấm Histoplasma và bệnh nấm sợi của da (do Trichophyton), Các phản ứng này phát hiện cảm nhiễm trong quá khứ nhƣng nhiều khi là bệnh đang tiến triển. Tiêm tubercullin vào trong da (nội bì) nếu phản ứng dƣơng tính ta thấy chỗ tiêm viêm tấy đỏ và cứng vào khoảng 72 giờ. Các dị ứng nguyên quá mẫn muộn khác cũng có thể áp dụng và cho kết quả tƣơng tự. Ngoài ra, ở động vật để tiện thực hiện, phản ứng có thể là dƣới da (tiêm kháng nguyên vào dƣới da), trong mắt (nhỏ kháng nguyên vào niêm mạc mắt). Phản ứng dƣới da có thể xác định kết quả nhờ đo độ dày chỗ da bị tiêm trƣớc khi tiêm và sau khi tiêm 1 - 3 ngày và có thể vận dụng với hầu hết tất cả các bệnh nêu trên. Riêng bệnh tỵ thƣ ở ngựa phản ứng trong mắt khá tiện lợi, buộc ngựa cần kiểm tra vào chỗ tránh gió lùa, nhỏ kháng nguyên vào một mắt để mắt kia làm đối chứng âm. Phản ứng dƣơng tính biểu hiện viêm kết mạc mắt (sau một ngày) kèm theo dòng ghèn trắng đục, nhầy và dính chảy ra từ khóe mắt. IV. Chẩn đoán phân tử thông qua phân tích gen 1. Phương pháp lai phân tử (hybridization) Các phƣơng pháp lai phân tử (hybridization) có nguyên lý chung là nếu ADN hai sợi và ARN hai sợi đƣợc biến tính bởi nhiệt hoặc kiềm thì trở thành một sợi. Nếu hỗn hợp axit nucleic một sợi này với axit nucleic một sợi khác thì khi gặp điều kiện nhiệt độ nhất định các đoạn axit nucleic một sợi có trình tự nucleotid tƣơng bổ sẽ kết hợp với nhau nhờ liên kết hydro. Vì hình thành axit nucleic lai tạp (hybrid) nên phƣơng pháp đƣợc gọi là hybridization (phƣơng pháp lai, để thuận tiện trong tiếng Việt thƣờng gọi lai phân tử). Với nguyên lý này, nếu có một đoạn ADN hoặc ARN có trình tự nucleotid đặc hiệu virut hoặc vi khuẩn ta có thể đánh dấu bằng (cho kết hợp với) đồng vị phóng xạ, biotin, hoặc digoxygenin rồi kiểm tra xem nó có lai với ADN hoặc ARN (ở trạng thái một sợi) trong bệnh phẩm hay không ta có thể phát hiện đƣợc sự hiện diện của mầm bệnh trong bệnh phẩm. ADN hoặc ARN một sợi đƣợc đánh dấu gọi là "dò" hay "mẫu dò" (probe). Phƣơng pháp kiểm xuất biotin lợi dụng avidin và phƣơng pháp kiểm xuất digoxygenin lợi dụng kháng thể đánh dấu enzym, là những 115 phƣơng pháp phi phóng xạ đƣợc khai phát đã làm các phƣơng pháp lai phân tử trở nên khả thi trong chẩn đoán. Các phƣơng pháp này so với dùng đồng vị phóng xạ có nhiều lợi điểm nhƣ khả năng bảo quản dò đƣợc lâu và có thể áp dụng trong các phòng thí nghiệm thông thƣờng, không lo ô nhiễm phóng xạ nên có thể tiếp xúc dễ dàng. Tuy nhiên do có độ nhạy thấp so với phƣơng pháp PCR (sau đây) nên chúng chỉ đƣợc sử dụng trong việc đồng định hoặc định typ vi sinh vật đã phân lập thuần khiết. Phƣơng pháp lai phân tử thông thƣờng cần cố định axit nucleic có trong bệnh phẩm lên màng nylon hoặc nitrocelluloza rồi cho phản ứng với dò đặc hiệu. Sau đó rửa bỏ các thành phần (kể cả dò) không gắn kết do không có trình tự tƣơng bổ đặc hiệu với axit nucleic đã cố định và cho hiển thị dò đặc hiệu. Nếu không thấy đƣợc dò chứng tỏ không có sự tƣơng đồng trong trình tự nucleotid của dò và của axit nucleic đã cố định. Tùy thuộc vào phƣơng pháp cố định mà ta có những biến thể dƣới đây. 1.1. Lai khuẩn lạc (colony hybridization) Phƣơng pháp này dùng để đồng định vi khuẩn mầm bệnh đã phân lập hình thành khuẩn lạc trên môi trƣờng thạch. Đặt màng nylon lên mặt môi trƣờng thạch sẽ làm khuẩn lạc in lên màng, hoặc là lấy cặn vi khuẩn phết lên màng, sau đó bằng phƣơng pháp kiềm làm biến tính axit nucleic rồi cho phản ứng với dò. Do có thể không cần cấy chuyển và bồi dƣỡng thuần khiết nên có thể thực thi nhanh việc chẩn đoán. Tuy nhiên, do nhiều thành phần của tế bào nên phản ứng có thể bị trở ngại và làm việc phán định kết quả khó khăn. 1.2. Lai đốm (dot hybridization) Còn gọi là phƣơng pháp thẩm đốm (dot blot), phƣơng pháp này bắt đầu bằng việc chiết xuất axit nucleic từ bệnh phẩm rồi nhỏ giọt (đốm) lên màng và cố định axit nucleic trên đó rồi cho phản ứng với dò. Tuy cần nuôi cấy phân lập lứa cấy thuần vi khuẩn mầm bệnh nhƣng là phƣơng pháp nhanh chóng do sử dụng axit nucleic không cần tinh khiết đƣợc chiết xuất bằng phƣơng pháp đơn giản. 1.3. Lai Southern (Southern hybridization) Phân tử ADN cần kiểm có thể để nguyên hoặc đƣợc cắt bằng enzym hạn chế rồi điện di để phân đoạn trên gel agarose, sau đó chuyển các phân đoạn ADN từ gel sang màng nylon rồi cho phản ứng với dò. Bằng phƣơng pháp này có thể phân tích một cách chi tiết đoạn ADN nào 116 phản ứng với dò nên không chỉ dùng để đồng định mà còn sử dụng để giám biệt typ. Hơn nữa với các loại mầm bệnh có ADN lớn nhƣ vi khuẩn, nguyên trùng, ký sinh trùng, thì sau khi phân cắt bằng enzym hạn chế rồi điện di thì số phân đoạn quá nhiều làm khó phân tích nhƣng với phƣơng pháp này có thể phân tích đƣợc các mô hình, hay kiểu dạng (pattern), do số phân đoạn phản ứng với dò trở nên hạn chế tức là chỉ những đoạn ADN đặc hiệu đƣợc hiển thị vị trí trong làn gel điện di. Sự khác biệt của các kiểu dạng của các đoạn cắt bởi enzym hạn chế phản ứng với dò đƣợc gọi là tính đa hình độ dài phân đoạn hạn chế (restriction fragment length polymorphism). 1.4. Lai khay vi thể (microplate hybridization) Chiết xuất axit nucleic từ vi sinh vật mầm bệnh, cho hấp phụ cố định vào đáy lỗ khay vi thể rồi cho phản ứng với dò. Nếu sử dụng phƣơng pháp kháng thể đánh dấu để phát hiện dò thì phƣơng pháp này tƣơng tự phản ứng ELISA, có thể phán định và xử lý kết quả tƣơng tự, đồng thời có thể xử lý chẩn đoán số lƣợng lớn mẫu bệnh phẩm. Hơn nữa, các axit nucleic từ vi khuẩn mầm bệnh không chỉ có ADN mà còn có ARN thông tin vốn rất nhiều trong tế bào cũng phản ứng với dò nên độ nhạy của phƣơng pháp cao. 2. PCR (Phản ứng chuỗi polymeraza) 2.1. Nguyên lý và ứng dụng PCR Phản ứng chuỗi polymeraza (PCR: polymerase chain reaction) là kỹ thuật dựa trên phản ứng tổng hợp ADN nhờ enzym DNA-polymeraza lặp đi lặp lại mà chỉ một đoạn nhất định của ADN đặc hiệu trong bệnh phẩm đƣợc tăng lƣợng. DNA-polymeraza (DNA-polymerase) là enzym lấy ADN một sợi làm khuôn để tổng hợp sợi ADN tƣơng bổ. Quá trình tổng hợp ADN đƣợc thực hiện nối dài một hƣớng từ đầu 5' đến đầu 3' và tại vị trí xuất phát của quá trình tổng hợp phải có mặt một đoạn ngắn ADN một sợi gọi là mồi (primer) tƣơng bổ với ADN khuôn. Nếu tổng hợp đƣợc hai mồi (một cặp) tƣơng bổ với hai vị trí trên hai sợi khác nhau của một ADN hai sợi và hƣớng của phản ứng từ một mồi ngƣợc với hƣớng phản ứng từ mồi kia, tức là kẹp một đoạn cần tăng lƣợng của ADN, thì nếu cho cặp primer với lƣợng gấp bội vào dịch chứa bệnh phẩm thì phản ứng DNA- polymeraza sẽ thực hiện lặp đi lặp lại nhiều lần. Kết quả là từ vị trí một mồi ADN đƣợc kéo dài rồi trong chu kỳ tiếp theo lại làm khuôn cho mồi có chiều ngƣợc lại tổng hợp kéo dài ADN đến quá vị trí của mồi trƣớc. 117 Quá trình tổng hợp lặp đi lặp với một cặp mồi làm cho chỉ đoạn ADN nằm giữa (tức đƣợc kẹp giữa) hai mồi đƣợc tăng lƣợng theo cấp số nhân. Nếu số chu kỳ nhiệt là 30 thì đoạn ADN này tăng là 2 30 (tức khoảng 10 9 ) lần. Để thực hiện phản ứng cần có DNA-polymeraza chịu nhiệt và thiết bị luân nhiệt (thermocycler) tự động hóa, và mỗi chu kỳ phản ứng phải qua ba bƣớc 1) biến tính ADN hai sợi thành một sợi bằng nhiệt (94 - 95 °C), 2) nhiệt độ thích hợp để mồi gắn vào trình tự nucleotid đặc hiệu của ADN bệnh phẩm và 3) nhiệt độ thích hợp phản ứng kéo dài chuỗi ADN nhờ DNA-polymeraza. Nhiệt độ chu kỳ 2) và 3) phụ thuộc vào thành phần nucleotid của mồi và khuôn nhƣng có thể vận dụng nhiệt độ gắn mồi khoảng 60 °C, nhiệt độ phản ứng kéo dài khoảng 70 °C. Thành phần dịch phản ứng gồm DNA-polymeraza chịu nhiệt (Taq polymerase), hỗn hợp deoxyribonucleotid triphosphat (dNTP, gồm 4 loại dATP, dTTP, dCTP và dGTP), cặp mồi (primer), dung dịch đệm và ADN khuôn (template DNA). Sản phẩm PCR đƣợc điện di để xác nhận độ dài đặc hiệu của ADN theo lý luận phải có, thƣờng nhờ điện di song song với ADN dấu phân tử lƣợng (molecular weight marker DNA). Đôi khi sản phẩm đƣợc lai Southern để kiểm tra tính đặc hiệu. Để điện di thƣờng dùng gel agarose 0,8% trong dung dịch đệm acetat-tris, nhuộm ADN bằng ethidium bromid (~50 g/ml) pha vào agarose trƣớc khi đổ bản gel hoặc pha vào dung dịch điện di sau khi điện di. Thời gian gần đây nhờ phát triển kỹ thuật chế primer đánh dấu huỳnh quang chỉ phát quang khi gắn kết vào ADN và thiết bị phân tích huỳnh quang tự động ngƣời ta đã phát triển PCR thông thƣờng thành PCR thực thời (real-time PCR) với năng lực chẩn đoán và phân tích định lƣợng rất tiện lợi. Nhờ PCR có thể tăng lƣợng bất kỳ ADN nào có trong bệnh phẩm nên ta có thể chẩn đoán thông qua phát hiện sự hiện diện của gen đặc hiệu mầm bệnh mà không cần nuôi cấy phân lập mầm bệnh. Điều này làm cho việc chẩn đoán các mầm bệnh không nuôi cấy đƣợc trở nên khả thi. Phƣơng pháp PCR còn đƣợc phối hợp với các kỹ thuật sinh học phân tử khác trong nghiên cứu nhƣ mô tả dƣới đây. 2.2. PCR-RFLP (Phản ứng chuỗi polymeraza - đa dạng độ dài đoạn ngẫu nhiên) PCR-RFLP là phƣơng pháp so sánh các kiểu dạng (hay mô hình: pattern) các phân đoạn của sản phẩm PCR đƣợc phân cắt bởi enzym hạn chế đƣợc phân tách bằng điện di trong gel. [...]... xác định bệnh chắc chắn thì cũng phải có kết luận sơ bộ chẩn đoán và có biện pháp đề phòng bệnh l y lan Nguyên tắc cần tuân thủ đối với dịch 129 bệnh truyền nhiễm là một khi có con vật sốt chƣa rõ nguyên nhân phải nghi là nguồn bệnh truyền nhiễm và phải cách ly Thà chẩn đoán nhầm một bệnh không truyền nhiễm là bệnh truyền nhiễm còn hơn là nhầm một bệnh truyền nhiễm là bệnh không truyền nhiễm Tuy nhiên,... phƣơng pháp lai phân tử (hybridization)? 14 Nguyên lý và ứng dụng PCR? 15 Các chỉ tiêu của nghiên cứu dịch (tễ) học mô tả? 16 Các phƣơng pháp nghiên cứu dịch tễ học phân tích? 125 CHƢƠNG 4 PHÒNG CHỐNG BỆNH TRUYỀN NHIỄM I Các phương pháp phòng bệnh truyền nhiễm 1 Nguyên tắc chung của công tác phòng chống dịch bệnh truyền nhiễm Nguyên lý công tác phòng chống dịch bệnh truyền nhiễm là vận dụng những kiến... thuộc y u, từ 0,5 đến 0,8 chỉ mức trung bình, lớn hơn 0,8 đến 1 chỉ mối quan hệ phụ thuộc mạnh Trƣớc hết cần lập bảng xác định thứ bậc, nhƣ sau: Năm Tỷ lệ tiêm X (%) 1990 91 92 93 94 55 57 63 64 62 Tỷ lệ bệnh Y (%) 1,8 1,7 2,1 1 ,6 1,2 Số thứ tự bậc X Y 10 9 7 6 8 2 3 1 4 6 d (=X -Y) d2 +8 +6 +6 +2 +2 64 36 36 4 4 123 95 68 1,4 5 5 0 0 96 97 98 99 71 75 74 77 0,9 0,8 0,8 0 ,6 4 2 3 1 7 8 9 10 -3 -6 -6 -9... 121 Bệnh Không bệnh Bộc lộ với y u tố nguy cơ a b a+b Không bộc lộ c d c+d Cộng a+c b+d a+b+ c+d Trong đó: a là số động vật bị bệnh mà ta hồi cứu th y có tiếp xúc y u tố nguy cơ, b là số động vật không bệnh nhƣng có tiếp xúc y u tố nguy cơ, c là số động vật bệnh nhƣng không tiếp xúc y u tố nguy cơ, d là số động vật không bệnh cũng không tiếp xúc y u tố nguy cơ, a+b là tổng số cảm nhiễm y u tố nguy cơ,... giữa bệnh và y u tố nguy cơ, RR=1 cho th y không có sự liên quan giữa bệnh và cảm nhiễm y u tố nguy cơ, còn RR1 nói lên sự kết hợp và giá trị n y càng cao thì sự kết hợp càng mạnh, tức y u tố nguy cơ (mầm bệnh) giả thuyết... của chu trình truyền l y mầm bệnh và các giai đoạn của quá trình sinh dịch vào công tác thực tiễn Bệnh truyền nhiễm x y ra đƣợc là do ba khâu của quá trình sinh dịch: nguồn bệnh, các nhân tố trung gian truyền bệnh và động vật cảm thụ, và sự liên hệ giữa ba khâu đó Thiếu một trong ba khâu hoặc thiếu sự liên hệ giữa hai trong ba khâu đó thì dịch không x y ra đƣợc Nguồn bệnh là khâu đầu tiên và chủ y u,... không cảm nhiễm y u tố nguy cơ, a+c là tổng số động vật mắc bệnh, b+d là tổng số động vật không mắc bệnh Đại lƣợng nguy cơ tƣơng đối (relative risk) RR=[a/(a+b)]/[c/(c+d)] =a(c+d)/c(a+b) là đại lƣợng giúp xác định mức độ kết hợp giữa bệnh và bộc lộ với y u tố nguy cơ RR>1 nói lên rằng có sự liên quan giữa bệnh và y u tố nguy cơ, RR=1 cho th y không có sự liên quan giữa bệnh và cảm nhiễm y u tố nguy cơ,... hình) ADN đa hình đƣợc khuyếch đại ngẫu nhiên (random amplified polymorphic DNA) còn gọi là tổ hợp mơ hồ tính đa hình độ dài khuyếch đại hay ALP-HA (amplified fragment length polymorphism hazy association), PCR đƣợc mồi ngẫu nhiên hay AP-PCR (arbitrarily primed PCR) hay l y vân tay khuyếch đại ADN (DNA amplification fingerprinting), Đ y là phƣơng pháp đồng định mầm bệnh hoặc định typ nhờ sử dụng các cặp... (cảm nhiễm) với y u tố nguy cơ (giả thiết) và ở nhóm không bộc lộ Các số liệu thu thập đƣợc trình b y ở bảng sau: Bệnh Không bệnh Bộc lộ với y u tố nguy cơ a b a+b Không bộc lộ c d c+d Cộng a+c b+d a+b+ c+d Trong đó: a là số động vật có tiếp xúc y u tố nguy cơ bị phát bệnh, b là số động vật có tiếp xúc y u tố nguy cơ nhƣng không phát bệnh, c là số động vật bệnh nhƣng không tiếp xúc y u tố nguy cơ,... đoán là gì? đặc điểm chẩn đoán bệnh truyền nhiễm? 2 Các bƣớc trong hẩn đoán bệnh nguyên học? 3 Kiểm nghiệm thể bệnh nguyên có khác phân lập và đồng định bệnh nguyên? 4 Phân lập và đồng định vi khuẩn mầm bệnh? 5 Phân lập và đồng định virut mầm bệnh? 6 Mục đích của phƣơng pháp huyết thanh học? Phƣơng pháp huyết thanh học trong kiểm nghiệm thể bệnh nguyên và đồng định mầm bệnh có gì khác nhau? 7 Phản ứng . CHỐNG BỆNH TRUYỀN NHIỄM I. Các phương pháp phòng bệnh truyền nhiễm 1. Nguyên tắc chung của công tác phòng chống dịch bệnh truyền nhiễm Nguyên lý công tác phòng chống dịch bệnh truyền nhiễm. (=X -Y) d 2 X Y 1990 55 1,8 10 2 +8 64 91 57 1,7 9 3 +6 36 92 63 2,1 7 1 +6 36 93 64 1 ,6 6 4 +2 4 94 62 1,2 8 6 +2 4 123 95 68 1,4 5 5 0 0 96. một số bệnh thú y hình thành miễn dịch tế bào nhƣ bệnh lao, bệnh tỵ thƣ, bệnh Johne (á lao) và bệnh s y thai truyền nhiễm. L y dịch chiết từ lứa c y tế bào vi khuẩn nuôi c y lâu ng y ta đƣợc