Đang tải... (xem toàn văn)
Vấn đề vệ sinh thực phẩm luôn được đặt lên hàng đầu trong những chương trình phát triển của các quốc gia. Trong những năm gần đây, tình hình ngộ độc thực phẩm có xu hướng gia tăng cả về số lượng lân qui mô tác hại ở nhiều nước...
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ĐOÀN THỊ NGỌC TUYỀN XÂY DỰNG QUI TRÌNH PHÁT HIỆN ESCHERICHIA COLI TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) VÀ THỬ NGHIỆM ỨNG DỤNG LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – NĂM 2005 Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Trần Linh Thước LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn thầy Trần Linh Thước thầy Nguyễn Tiến Dũng tận tình hướng dẫn em thực luận văn Cảm ơn tất thầy cô Khoa Sinh Trường Đại học sư phạm Trường Đại học Khoa học tự nhiên (Đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh) tận tâm giảng dạy suốt thời gian em học tập nhà trường Cảm ơn bạn Huệ, Na, Phượng, Thanh, Ánh tất bạn Phòng thí nghiệm Công nghệ Gen - Vi sinh Trường Đại học Khoa học tự nhiên tận tình hỗ trợ mặt sở vật chất mặt kó thuật Cảm ơn gia đình hỗ trợ vật chất động viên tinh thần cho suốt thời gian học tập xa nhà Đoàn Thị Ngọc Tuyền Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Trần Linh Thước DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT AOAC : Assciation of Official Analytical Chemist (Hiệp hội nhà phân tích nhà nước) bp : Base pair - caëp base CEN : European Committee for Normalization (Hội đồng Châu Âu chuẩn hóa) dH2O : Nước caát DNA : Deoxyribonucleic acid d NTP : 3'- Deoxynucleoside - 5' triphosphate ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay (Thử nghiệm hấp thu miễn dịch gắn enzyme) FDA FP : Food and Drug Administration (Cục quản lý Thực phẩm Dược phẩm) : False positive (dương tính giả) FN KDa RA RS-P : False negative (âm tính giả) : Kilo Dalton (1000Da, đơn vị khối lượng protein) : Relative accuracy (độ xác tương đối) : Relative sensitivity (độ nhạy tương đối) RS-N : Relative specificity (độ đặc hiệu tương đối) ISO : International Standards Organisation (Tổ chức tiêu chuẩn Nordval : Nordic Committee on Food Analysis (Hội đồng phân tích phẩm Bắc Âu) PCR : Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi tổng hợp nhờ TAE TE Taq UV WHO : Tris acetic acid – EDTA (ethylenediamine tetraacetic acid) : Tris - EDTA : Thermus aquaticus : Ultraviolet (tia tử ngoại) : World Health Organization Đoàn Thị Ngọc Tuyền quốc tế) thực polymerase) Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Trần Linh Thước ĐẶT VẤN ĐỀ Vấn đề vệ sinh thực phẩm đặt lên hàng đầu chương trình phát triển quốc gia Trong năm gần đây, tình hình ngộ độc thực phẩm có xu hướng gia tăng số lượng lẫn qui mô tác hại nhiều nước Theo thống kê Tổ chức Y tế giới (WHO), có đến 50% vụ ngộ độc thực phẩm tác nhân vi sinh vật gây [20] Hiện nay, xuất thực phẩm chiếm tỷ trọng quan trọng kinh tế xuất nước ta Sự hội nhập kinh tế theo xu hướng toàn cầu hóa có tác động lớn đến tiêu chuẩn chất lượng an toàn vệ sinh thực phẩm Việc đẩy mạnh xây dựng qui trình, cải tiến trang thiết bị xem giải pháp đóng vai trò định, giúp nâng cao lực kiểm soát chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm Về mặt việc kiểm tra diện vi sinh vật gây bệnh thực phẩm E coli, Samonella, Shigella, Virio… có vai trò quan trọng E coli xem vi sinh vật thị nhiễm khuẩn thực phẩm, loài vi khuẩn gây bệnh hội gây viêm ruột tiêu chảy trẻ nhỏ, tiêu chảy hội chứng lỵ hay tiêu chảy hội chứng tả Ngoài ra, E coli gây bệnh viêm đường niệu, viêm khuẩn bàng quang, thận, tuyến tiền liệt, ống dẫn trứng Qui trình kiểm tra E coli gây bệnh thực phẩm phương pháp truyền thống thường chậm, tốn thời gian (kéo dài - ngày) độ nhạy thấp Trong phương pháp chẩn đoán phân tử dựa kỹ thuật sinh học phân tử lai phân tử, PCR có khả khắc phục nhược điểm này, quan tâm nghiên cứu ứng dụng giới Từ bối cảnh nêu trên, thực tiễn sản xuất nước ta đặt yêu cầu cần có phương pháp phát nhanh E coli gây bệnh thực phẩm, thay phương pháp truyền thống, cho phép giám sát tính an toàn giảm tối đa nguy gây bệnh từ nhóm vi khuẩn thực phẩm Do vậy, mục tiêu đề tài luận văn thiết lập qui trình phát E coli thực phẩm phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) để thay phương pháp truyền thống Đoàn Thị Ngọc Tuyền Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Trần Linh Thước PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM VÀ VI SINH VẬT GÂY BỆNH QUA THỰC PHẨM 1.1 Một số khái niệm liên quan Trong lónh vực thực phẩm nay, có hai khái niệm sử dụng rộng rãi vệ sinh thực phẩm an toàn thực phẩm số khái niệm quan trọng khác cần phân biệt - Vệ sinh thực phẩm (food hygiene) [7,9] : khái niệm để biểu thị thực phẩm không chứa vi sinh vật gây bệnh không chứa độc tố Khái niệm bao hàm tình trạng vệ sinh vận chuyển, chế biến bảo quản thực phẩm - An toàn thực phẩm (food safety) [7, 9]: khả không gây ngộ độc thực phẩm người vi sinh vật hóa chất, yếu tố vật lý Theo nghóa rộng, khái niệm hiểu khả cung cấp đầy đủ kịp thời số lượng chất lượng thực phẩm quốc gia gặp thiên tai lý Mục đích an toàn thực phẩm việc bảo đảm thực phẩm không bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh, không chứa độc tố sinh học, độc tố hoá học yếu tố khác có hại cho sức khoẻ người tiêu dùng trình sản xuất, vận chuyển , chế biến bảo quản thực phẩm - Ngộ độc thực phẩm [6,17]: dùng để tất bệnh gây mầm bệnh có thực phẩm Ngộ độc thực phẩm chia thành nhóm: + Ngộ độc chất độc vi sinh vật tạo nguyên liệu hóa chất từ trình chăn nuôi, trồng trọt bảo quản, chế biến… Các độc chất có thực phẩm trước tiêu thụ + Ngộ độc nhiễm trùng: trường hợp vi khuẩn gây bệnh theo thực phẩm vào thể đường tiêu hóa tác động tới thể diện thân vi khuẩn độc tố vi khuẩn - Độc tố [7, 8]: hợp chất hóa học có nguyên liệu, sản phẩm thực phẩm hàm lượng gây ngộ độc tiêu thụ người hay động vật Độc tố tồn Đoàn Thị Ngọc Tuyền Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Trần Linh Thước nhiều trạng thái khác tạo thực phẩm nhiều đường khác Độc tố có nguồn gốc từ vi sinh vật tạo đường sau: + Tế bào vi sinh chứa thành phần có độc tính Vi sinh vật tăng trưởng thành mật độ cao thực phẩm, tế bào bị chết đi, độc tố phóng thích vào thực phẩm Loại độc tố gọi nội độc tố (endotoxin) + Tế bào vi sinh tổng hợp protein có độc tính tiết tế bào Loại độc tố gọi ngoại độc tố (exotoxin) Nội độc tố ngoại độc tố khác nhiều chất hóa học, đặc tính hóa học phương thức hoạt động Bảng so sánh số đặc trưng hai loại độc tố Bảng So sánh số đặc điểm ngoại độc tố nội độc tố vi khuẩn [7, 26] Ngoại độc tố (exotoxin) - Do vi khuẩn sống tiết Nội độc tố (endotoxin) - Do vi khuẩn chết phóng thích - Có vi khuẩn Gram dương Gram - Có vi khuẩn Gram âm, vi âm khuẩn Gram dương - Bản chất protein - Bản chất lipopolysaccharide - Không bền với nhiệt - Tương đối bền với nhiệt - Độc lực cao - Tương đối độc - Triệu chứng bệnh đặc hiệu, không - Triệu chứn g bệnh không đặc hiệu, gây sốt hay gây sốt, choáng 1.2 Những vi sinh vật gây bệnh thực phẩm thường gặp - Coliform [10]: Coliform Feacal coliform (coliform phân) nhóm vi sinh vật dùng để thị khả có diện vi sinh vật gây bệnh thực phẩm Nhóm coliform gồm vi sinh vật hiếu khí kỵ khí tùy ý, Gram âm, không sinh bào tử, hình que, lên men đường lactose sinh môi trường nuôi cấy lỏng Dựa vào nhiệt độ tăng trưởng, nhóm lại chia thành nhóm nhỏ coliform coliform phân có nguồn gốc từ phân loài động vật Coliform phân có nguồn gốc từ ruột người động vật máu nóng bao gồm giống Escherichia, Klebsiella Enterobacter Trong thành viên Đoàn Thị Ngọc Tuyền Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Trần Linh Thước nhóm coliform phân E coli loài quan tâm nhiều vệ sinh an toàn thực phẩm - Escherichia coli [1,10]: vi khuẩn diện ruột người động vật, thải thiên nhiên theo đường phân nên thường gặp đất nước Năm 1971 E coli xếp vào nhóm vi sinh vật gây bệnh thực phẩm vi sinh vật thị nhiễm khuẩn thực phẩm Loài trực khuẩn Gram âm mang đầy đủ tính chất vi khuẩn đường ruột Khả gây bệnh E coli đa dạng tùy thuộc vào vị trí xâm nhập Đối với nhiễm khuẩn đường ruột, E coli gây nhiều bệnh khác với triệu chứng không đặc trưng xem vi khuẩn gây bệnh hội (như viêm đường niệu, viêm nhiễm bàng quang, thận, tuyến tiền liệt, ống dẫn trứng hay nhiễm trùng máu) Ngoài E coli gây viêm màng não trẻ sơ sinh Đối với nhiễm khuẩn đường ruột, E coli gây bệnh viêm ruột, tiêu chảy trẻ nhỏ, tiêu chảy hội chứn g lỵ hay tiêu chảy hội chứng tả - Salmonella [7,10]: trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy ý, không sinh bào tử, di động chu mao Vi khuẩn chịu nhiệt chịu số hóa chất brilliant green, sodium lauryl sulfate, selenite, tetrathionate Người ta phân lập 2324 chủng Salmonella khác Ngoài nội độc tố Salmonella tạo hai loại ngoại độc tố độc tố ruột (enterotoxin) độc tố tế bào (cytotoxin) Dựa vào cấu trúc kháng nguyên O H, người ta chia Salmonella gây bệnh thành nhóm: nhóm gây bệnh cho người, nhóm gây bệnh cho động vật nhóm gây bệnh cho người động vật Ở người Salmonella gây sốt thương hàn (do S typhi hay S typhi A, B,C), nhiễm trùng máu (S cholera-suis), rối loạn tiêu hoá (S typhimurinum, S enteritidis) Vi khuẩn xâm nhập vào thể đường miệng qua thức ăn Vào ruột non, vi khuẩn tăng trưởng xâm nhập vào máu quan khác gây viêm Ngộ độc thực phẩm nội độc tố Salmonella gây triệu chứng nôn mữa, đau đầu, ớn lạnh, tiêu chảy Sốt xuất vào 12 – 24 sau ăn thức ăn có chứa – 10 triệu tế bào Salmonella/g thức ăn Bệnh kéo dài – ngày, phần lớn bệnh nhân tự phục hồi có trường hợp tử vong, đặc biệt người già, trẻ sơ sinh người suy yếu hệ miễn dịch - Shigella [7,10]: trực khuẩn Gram âm, không di động, không sinh bào tử, kỵ khí tùy ý, tăng trưởng nhiệt độ từ 10 – 40C, pH – 8, có kháng nguyên O, số có kháng nguyên K, kháng nguyên H Shigella gồm có loài: S dysenteriae, S flexneri, S boyalia, S Đoàn Thị Ngọc Tuyền Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Trần Linh Thước sonnei Trong S dysenteriae type tạo độc tố thần kinh có độc lực cao, gây dịch lớn Tỉ lệ tử vong bệnh Shigella cao bệnh Salmonella Nhiễm khuẩn Shigella giới hạn đường tiêu hóa cần 10 – 100 tế bào đủ gây bệnh Vi khuẩn tạo hai dạng độc tố Nội độc tố lipopolysaccharide có thành tế bào vi khuẩn gây kích thích thành ruột Ngoại độc tố vừa tác động lên ruột vừa tác động lên hệ thần kinh trung ương gây triệu chứng tiêu chảy, ức chế hấp thu đường, axit amin ruột non, tác động lên hệ thần kinh gây tử vong Vi khuẩn công niêm mạc ruột già tạo vết loét hoại tử Khi ruột già bị tổn thương gây đau bụng quặn dội, tiêu nhiều lần, phân nhầy nhớt có máu gọi hội chứng lỵ Shigella - Vibrio [6,10]: phẩy khuẩn, Gram âm, di động nhờ tiên mao đầu, hiếu khí yếm khí không bắt buộc Vibrio thường gặp thực phẩm, hải sản, gồm khoảng 28 loài, đo có loài gây bệnh V parahaemolyticus, V cholerae,V vulnificus vaø V alginolyticus + V cholerae laø loài vi khuẩn phổ biến thiên nhiên gây dịch tả người sử dụng nước bẩn thực phẩm bị nhiễm Bệnh tả xuất V cholerae xâm nhập vào đường tiêu hóa, qua hàng rào axit dịch vị, kết dính vào màng nhầy biểu mô ruột tiết độc tố ruột Độc tố ruột V cholerae protein không bền nhiệt, cấu tạo đơn vị A B Phần B giúp độc tố gắn vào thụ thể bề mặt tế bào ruột GM1 Tiểu đơn vị A vào ruột tăng hoạt động adenylcylase khiến tế bào sản xuất cAMP nhiều làm tăng tiết ạt nước chất điện giải từ tế bào thượng bì vào lông ruột gây tiêu chảy Virio tạo hemolysin (chủng Eltor), mucinase làm tróc niêm mạc thượng bì ruột, neuramirdase làm tăng thụ thể tiếp nhận độc tố + V parahaemolyticus đa số gây độc thức ăn làm viêm ruột + V vulnificus diện rộng rãi nước biển, hải sản, có khả tổng hợp độc tố cytotoxin, hemolysin, cytolysin Tỉ lệ tử vong độc tố vibrio thường cao + V alginolyticus gặp phát gây bệnh lần vào năm 1971 Vi khuẩn có khả tạo độc tố ruột Khi vào thể, chúng phát triển nhanh máu gây bệnh Đoàn Thị Ngọc Tuyền Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Trần Linh Thước - Yersinia [7,10]: trực khuẩn Gram âm, kỵ khí tùy ý, không tạo bào tử, tạo độc tố ruột chịu nhiệt Vi khuẩn xâm nhập vào thể qua da (vết bọ chét cắn), niêm mạc (kết mạc, niêm mạc hầu trong, đường hô hấp) Khi vào thể Yersinia sinh sản nhanh, biểu lâm sàng hạch thể Vi khuẩn vào máu xâm nhập vào phủ tạng gây xuất huyết Thời gian ủ bệnh – ngày Sau sốt cao đột ngột, hạch to dần gây đau đớn Trường hợp nhiễm độc thần kinh, người bệnh cảm thấy bứt rứt, lo âu Trường hợp nhiễm trùng máu sớm kèm theo nôn mữa, tiêu chảy, nhiễm muộn đông máu nội hạch, hạ huyết áp, người trở nên lừ đừ, suy thận, suy tim - Proteus [8,10]: vi khuẩn có tự nhiên, đường tiêu hóa người động vật Thực phẩm bị nhiễm Proteus chủ yếu từ nguồn nước hay từ dụng cụ vật liệu chế biến thực phẩm không xử lý tốt Proteus gây độc lượng tế bào thể đủ lớn Độc tố đóng vai trò phụ trợ để làm tăng khả thẩm thấu niêm mạc ruột, giúp vi khuẩn xâm nhập vào máu nhanh nhiều Thời gian ủ bệnh tương đối ngắn (khoảng giờ, kéo dài 16 giờ) Khi bị nhiễm khuẩn, người bệnh bị nôn mữa, tiêu chảy cấp , viêm dày, ruột Nhiệt độ thể tăng Bệnh xuất nhanh khỏi nhanh Cơ thể phục hồi sau – ngày không gây tử vong - Staphylococcus [6,10]: cầu khuẩn Gram dương, tế bào bình thường liên kết với hình thành chùm, thường sống da người, đường hô hấp, đường tiêu hoá, quần áo , đồ vật Staphylococcus tạo loại độc tố chịu nhiệt (A, B, C1, C2, C3, D, E, G, H) enzyme có khả hỗ trợ cho độc tố gây độc người Nếu bị ngộ độc sau 1- người bệnh buồn nôn, ói mữa, tiêu chảy dội, không sốt phục hồi Lượng độc tố gây ngộ độc cho người 2mg - Clotridium [6,10]: trực khuẩn Gram âm, yếm khí, tạo bào tử, nhiệt độ phát triển tối ưu 43 – 47C Hai chủng gây ngộ độc thực phẩm là: + C botulium lần ghi nhận gây ngộ độc vào năm 1973 có người chết nhiễm độc C botulium có khả tạo độc tố thần kinh nhiều độc tố khác (A, B, F, G, G2, D G) Độc tố thường có độc lực cao + C perfringens phát triển nhiệt độ từ 12 - 50C, bị ức chế nồng độ muối NaCl 6% Phần lớn trường hợp ngộ độc thực phẩm C perfringens mật độ tế bào 106 tế bào/gam Đoàn Thị Ngọc Tuyền Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Trần Linh Thước thực phẩm Thời gian ủ bệnh – 24 Triệu chứng đau bụng, tiêu chảy, sốt, buồn nôn Độc tố C perfringens bị bất hoạt 60C 10 phút - Listeria [6,10]: loài gây bệnh chủ yếu L monocytogenes, vi khuẩn ưa lạnh, phát triển nhiệt độ 2,5 - 44C, thường diện trong sữa, thịt, cá, rau nước bề mặt Triệu chứng bệnh tiêu chảy, sốt nhẹ Trường hợp nặng, chủng gây bệnh sinh sản đại thực bào gây nhiễm trùng máu, tác động lên hệ thần kinh trung ương, tim, mắt xâm nhập vào bào thai bụng mẹ gây sẩy thai , đẻ non nhiễm trùng thai nhi Ngoài vi khuẩn thường gặp kể có nhiều vi khuẩn khác có vai trò định việc gây bệnh cho người từ thực phẩm Bacillus cereus, Campylobacter jejuni, Corynebacterium, Aeromonas hydrophila - Virus [6,10]: nhóm vi sinh vật gây bệnh có kích thước nhỏ nhất, thay đổi từ 5- 20nm Virus gây bệnh thực phẩm nghiên cứu khó nuôi cấy môi trường nuôi cấy thông thường Có nhiều vụ dịch hay ca bệnh từ thực phẩm virus gây nhiều trường hợp người ta không phát nguồn gốc gây bệnh Thực phẩm đóng vai trò môi trường lan truyền mầm bệnh Một số virus thực phẩm gây bệnh người biết virus Fadeno serotype 40 41 gây loét dày (họ Adenoviridae, chứa DNA, kích thước 100 nm), virus Hepatitis E gây bệnh gan (họ Calciviridae, chứa RNA, kích thước 34 nm), virus Pravo gây đau bao tử ( họ Pravoviridae, chứa DNA, kích thước 22nm), virus Popilo type – vaø Echo type – 65 gây viêm phổi (họ Picornarividae, chứa RNA, kích thước 28nm) - Nấm mốc tạo độc tố [7,20]: số loài có khả tạo độc tố gây ngộ độc hay ung thư người động vật Trong thực phẩm, số loài có khả tạo độc tố, thường gặp nguy hiểm aflatoxin Aspergillus flavus A parasiticus tạo Mức độ ngộ độc nấm mốc khác nhau, biểu nhiễm độc nhẹ (gây nôn mữa, tiêu chảy), tổn thương gan, thận, túi mật ống mật Một số độc tố gây u tuyến u gan, gây thoái hóa tế bào nhu mô gan, xơ hóa Citrinin Penicilium citrinum P viridicatum gây bệnh tăng urea huyết, albumin niệu, viêm tiểu cầu thận Một số độc tố nấm mốc tetronic acid, terestic acid, viridicatic acid tác động vào tim gây độc chức tim Độc tố cuûa Stachybotrys ata, Fusarium tricinctum, Dendrodocium toxicum, Aspergillus ochraceus tác động vào máu hệ tuần hoàn gây hội chứng chảy máu Đoàn Thị Ngọc Tuyền Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Trần Linh Thước Mẫu thực phẩm 10 g + 90g BPW Đồng Ủ 370C 20 Lấy 1ml cho vào eppendorf, li tâm 10.000 vòng/phút Loại bỏ phần nước Rửa sinh khối tế bào với 1ml nước cất vô trùng Li tâm 10.000 vòng/phút , thu nhận sinh khối Huyền phù hóa sinh khối vào 0,2 ml TE Đun sôi cách thủy 10 phút Li tâm 10000 vòng/phút, thu lấy phần dịch phía Phản ứng PCR 35 chu kỳ với bước 95C phút, 55C 45 giây, 72C 1phút Phân tích kết gel agarose 1,5% Diễn giải kết Hình 17 Tóm tắt qui trình phát E coli thực phẩm PCR Đoàn Thị Ngọc Tuyền Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Trần Linh Thước XÁC NHẬN HIỆU LỰC PHƯƠNG PHÁP 3.1 Giới hạn phát Giới hạn phát mật độ tế bào thấp vi sinh vật mục tiêu mà phương pháp có khả phát mẫu so với phương pháp chuẩn Giới hạn phát thông số quan trọng định phương pháp thiết lập có đáp ứng yêu cầu thực tế hay không Trong luận văn giới hạn phát qui trình phát E coli thực phẩm khảo sát g E coli có nguồn gốc khác nhau, chủng thực mẫu đại diện cho nhóm thực phẩm Mỗi loại mẫu gây nhiễm với mật độ E coli 3CFU, 8CFU, 15CFU 36CFU/g mẫu lặp lại lần Tiến hành phân tích mẫu gây nhiễm phương pháp PCR nuôi cấy Kết trình bày Bảng Hình 18 Bảng Kết khảo sát giới hạn phát quy trình PCR xét nghiệm E coli thực phẩm Lần Mật độ gây nhiễm Mẫu gây nhiễm Phương pháp Thịt Cá Bánh Sữa tươi Cà chua Nuôi caáy _ _ _ _ _ PCR _ _ _ _ _ Nuôi cấy + + - + + PCR + + - + + Nuôi cấy + + + + + PCR + + + + + Nuôi cấy + + + + + PCR + + + + + Nuôi cấy + + + + + PCR + + + + + Nuôi cấy _ _ _ _ _ PCR _ _ _ _ _ Nuôi cấy + + + + + PCR + + + + + Nuôi cấy + + + + + (CFU/g) 15 36 Đoàn Thị Ngọc Tuyền Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Trần Linh Thước PCR + + + + + + + + PCR + + + + + Nuôi cấy + + + + + PCR 36 + Nuôi cấy 15 + + + + + + Ở mật độ gây nhiễm 3CFU/g mẫu hai phương pháp cho kết dương tính loại mẫu Mẫu bánh lan gây nhiễm lần cho kết âm tính hai phương pháp lần cho kết dương tính, có lẽ lần việc gây nhiễm không thành công Như giới hạn phát 3CFU/g mẫu thực phẩm sau qua bước tăng sinh môi trường TSB 37C 20 Tuy giới hạn phát phương pháp tương đương rõ ràng phương pháp PCR có hiệu so với phương pháp nuôi cấy có thời gian phát ngắn hơn, sau khoảng 24 kể từ phân tích Trong phương pháp nuôi cấy cho kết sau ngày 299bp Hình 18 Kết điện di khảo sát giới hạn phát quy trình PCR xét nghiệm E coli thực phẩm 1: Thang 100bp; 2, 3, ,5, 6: mẫu thịt, cá, bánh, sữa cà chua gây nhiễm mật độ 3CFU/g; 7, 8, 9,10, 11: mẫu thịt, cá, bánh, sữa cà chua gây nhiễm mật độ 8CF/g Đoàn Thị Ngọc Tuyền Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Trần Linh Thước 3.2 Xác định thông số kó thuật tương đối phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy Để đánh giá thông số kó thuật phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy tiến hành chọn mẫu đại diện cho nhóm thực phẩm khác Thí nghiệm tiến hành 66 mẫu, có 33 mẫu gây nhiễm E coli với mật độ CFU/g mẫu (các mẫu trước gây nhiễm khẳng định âm tính với E coli) Tất mẫu phân tích đồng thời phương pháp nuôi cấy PCR Kết phân tích trình bày Bảng Bảng Kết phân tích E coli loại mẫu thực phẩm có không gây nhiễm E coli phương pháp truyền thống phương pháp PCR Mẫu gây nhiễm STT Mẫu không gây nhiễm Tên mẫu PCR Nuôi cấy PCR Nuôi cấy Xúc xích tôm + + _ _ Xúc xích heo + + _ _ Xúc xích bò + + _ _ Heo laùt + + _ _ Thịt bò hộp + + _ _ Thịt gà hầm + + _ _ Cá viên + + _ _ Khô mực + + _ _ Caù basa + + _ _ 10 Caù trích sốt cà + + _ _ 11 Chả lụa + + _ _ 12 Cá ngừ sốt cà + + _ _ 13 Nấm rơm + + _ _ 14 Xà lách son + + _ _ 15 Cải + + _ _ 16 Đậu que + + _ _ Đoàn Thị Ngọc Tuyền Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Trần Linh Thước 17 Rau dền + + _ _ 18 Chuối + + _ _ 19 Đậu hủ + + _ _ 20 Sữa tươi + + _ _ 21 Sữa đặc + + _ _ 22 Sữa chua + + _ _ 23 Bơ + + _ _ 24 Cà phê sữa + + _ _ 25 Phomai + + _ _ 26 Bánh lan + + _ _ 27 Baùnh AFC + + _ _ 28 Nước cam + + _ _ 29 Nho + + _ _ 30 Trứng gà + + _ _ 31 Trứng vịt + + _ _ 32 Trứng cút + + _ _ 33 Cà chua + + _ _ Từ kết Bảng tóm tắt tương quan kết phân tích phương pháp PCR phương pháp nuôi cấy Bảng Bảng Sự tương qua kết phân tích phương pháp nuôi cấy PCR Phương pháp PCR Phương pháp nuôi cấy Mẫu dương tính Mẫu âm tính Tổng Mẫu dương tính N11 = 33 N12 = C = N11 + N12 = 33 Mẫu âm tính N21 = N22 = 33 D = N21 +N22 =33 Tổng kết A = N11 + N21 = 33 B = N12 + N22 = 33 N = 66 Đoàn Thị Ngọc Tuyền Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Trần Linh Thước Từ kiện Bảng 9, thông số kó thuật tương đối phương pháp PCR phương pháp nuôi cấy tính sau: - Độ xác tương đối: RA (%) = ( N11 + N22) x 100 / N = ( 33 + 33) x 100 / 66 = 100% - Tỉ lệ dương tính giaû: FP (%) = N21 x 100 / D = x 100 / 33 = 0% - Tỉ lệ âm tính giả: FN (%) = N12 x 100 / D = x 100 / 33 = 0% - Độ nhạy tương đối : RS-P (%) = N11 x 100 / C = 33 x 100 / 33 = 100% - Độ đặc hiệu tương đối: RS-N (%) = N22 x 100 / D = 33 x 100 / 33 = 100% - Độ khác biệt có ý nghóa phương pháp : = ((N12 - N21) - 1) 2/ ( N12 + N21) với bậc tự df = = (( - ) - )2 / ( - ) = Các thông số cho thấy phương pháp PCR để phát E coli có kết đáng tin cậy với độ nhạy tương đối RS = 100% thõa mãn giới hạn chấp nhận tiêu chuẩn AOAC Nordl ( RS 95%) Không có trường hợp âm tính giả dương tính giả 33 mẫu gây nhiễm Giá trị thông số khác độ đặc hiệu tương đối, độ xác tương đối đạt 100% giá trị = > 3,84 cho thấy khác biệt phân tích E coli thực phẩm phương pháp PCR hay nuôi cấy Nói cách khác kết phân tích E coli phương pháp nuôi cấy phương pháp PCR tương đương Đoàn Thị Ngọc Tuyền Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Trần Linh Thước 3.3 Đánh giá độ lặp lại Mục đích khảo sát để đánh giá mức độ ổn định phương pháp thao tác thực qui trình phân tích Thí nghiệm lặp lại 10 lần dịch mẫu xử lý với điều kiện, thành phần phản ứng, thời điểm Kết thể Hình 19 299bp Hình 19 Kết điện di khảo sát độ lặp lại phản ứng PCR 1: Thang 100bp, 2: Vạch chuẩn 299bp; 3-12: sản phẩm khuếch đại E coli 10 lần lặp lại Kết cho thấy tất lần lặp lại cho kết dương tính Như kết luận phương pháp PCR có tính ổn định cao, dễ dàng thao tác Kết tạo thuận lợi cho việc triển khai phương pháp PCR đến phòng thí nghiệm khác 3.4 Đánh giá độ ổn định - Khảo sát giới hạn dao động nhiệt độ bắt cặp cho phép: để xác định giới hạn dao động nhiệt độ bắt cặp cho phản ứng PCR, tiến hành khảo sát nhiệt độ 50 oC, 52oC, 55oC, 58oC, 60oC 62 oC Kết thể Bảng 10 Hình 20 Đoàn Thị Ngọc Tuyền Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Trần Linh Thước Bảng 10 Giới hạn dao động nhiệt độ bắt cặp cho phép phản ứng PCR Nhiệt độ 500C 520C 550C 580C 600C 620C Kết PCR + + + + + + 299bp Hình 20 Kết điện di khảo sát giới hạn dao động nhiệt độ bắt cặp cho phép phản ứng PCR 1: Vạch 299bp chuẩn; 2: 50, C; 3: 52C; 4: 55C; 5: 58C; 6: 60C ;7: 62C Kết cho thấy nhiệt độ 50C, 52C, 55, 58C, 60C 62C cótín hiệu khuếch đại.Vì dao động nhiệt độ bắt cặp cho phép phản ứng PCR để phát E coli 50 - 62C Đoàn Thị Ngọc Tuyền Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Trần Linh Thước - Khảo sát giới hạn dao động nồng độ Mg2+ cho phép: tiến hành phản ứng PCR với nồng độ Mg2+ – 4mM Các thành phần khác phản ứng không thay đổi Kết khảo sát trình bày Bảng 11 Hình 21 Bảng 11 Giới hạn dao động cho phép nồng độ Mg2+ phản ứng PCR Nồng độ Mg2+ (mM) 1,5 2,0 Kết PCR + + + 2,5 + 3,0 3,5 + + + Hình 21 Kết điện di khảo sát giới hạn dao động cho phép nồng độ Mg2+ phản ứng PCR 1:Vạch 299 bp chuaån; 2: 1mM Mg2+; 3:1,5mM Mg2+; 4: 2,0mM Mg2+; 5: 2,5mM Mg2; 6: 3mM Mg2+; 7: 3,5mM Mg2+; 8: 4,0mMg2+ Kết Hình 21 cho thấy nồng độ Mg2+ từ 1mM đến 4mM cho kết khuếch đại dương tính Như nồng độ Mg2+ dao động cho phép khoảng từ 1- 4mM - Khảo sát giới hạn dao động nồng độ mồi cho phép : Nồng độ mồi phản ứng định số lượng DNA mục tiêu trình khuếch đại Nồng độ mồi cao cho sản phẩm khuếch đại không đặc hiệu, ngược lại nồng độ mồi thấp cho sản phẩm khuếch đại, khó phát trình điện di, dễ gây nên kết âm tính giả Trong khảo sát thay đổi nồng độ mồi cho phản ứng khoảng 1,25 -10 pmol Kết khảo sát trình bày Bảng 12 Hình 22 Bảng 12 Giới hạn dao động cho phép nồng độ mồi phản ứng PCR Đoàn Thị Ngọc Tuyền Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Trần Linh Thước VMồi/pư(pM) 0,2 Nồng độ mồi 1,25pM KQ PCR - 0,41 0,63 2,5pM 3,75pM + 0,83 5pM 6,25pM + + + 1,5 1,7 7,5pM 8,75pM - - Kết Bảng 12 Hình 22 cho thấy nồng độ mồi 1,25pM, 7,5pM 8,75pM không cho sản phẩm khuếch đại Các nồng độ từ 2,5 – 6,25 cho sản phẩm khuếch đại Vậy giới hạn dao động cho phép nồng độ mồi 2,5pM – 6,25 để phát E coli phương pháp PCR 299bp Hình 22 Kết điện di khảo sát giới hạn dao động cho phép nồng độ mồi phản ứng PCR 1:Vạch 299 bp chuaån; 2: 1,25pM; 3: 2,5pM; 4: 3,75pM; 5: 5pM; 6: 6,25pm; 7: 7,5pM; 8: 8,75pM - Khảo sát giới hạn dao động cho phép nồng độ Taq: Taq DNA polymerase thành phần thiếu phản ứng khuếch đại sử dụng với hàm lượng nhỏ nên sai số dụng cụ kó thao tác khó tránh khỏi Để đánh giá giới hạn sai số cho phép nồng độ enzym phản ứng tiến hành khảo sát nồng độ dao động khoảng 0,5 2,0l/ phản ứng Kết trình bày Bảng 13 Hình 23 Bảng 13 Giới hạn dao động cho phép nồng độ Taq phản ứng PCR Thể tích Taq DNA polymerase 1U ( l) 0,5 1,0 1,5 2,0 Kết PCR + + + + Đoàn Thị Ngọc Tuyền Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Trần Linh Thước 299bp Hình 23 Kết điện di khảo sát giới hạn dao động cho phép nồng độ Taq DNA polymerase 1: Vạch 299bp chuẩn ; 2: 0,5U Taq; 3: 1,0U Taq; 4: 1,5U Taq; : 2,0U Taq Keát Bảng 12 Hình 23 cho thấy nồng độ enzym Taq polymerase phản ứng thay đổi 0,5 - 2,0l tương ứng với - 4U mà không ảnh hưởng đến kết khuếch đại Các kết phân tích độ ổn định phản ứng PCR để phát E coli cặp mồi EC theo quy trình thiết lập cho thấy, quy trình phản ứng ổn định, cho phép dao động lớn thao tác phối trộn thành phần phản ứng ỨNG DỤNG QUI TRÌNH PCR PHÁT HIỆN E COLI TRÊN CÁC MẪU THỰC TẾ Mục đích thí nghiệm nhằm so sánh phương pháp PCR phương pháp nuôi cấy việc phát E coli loại thực phẩm, sơ đánh giá tỉ lệ nhiễm vi sinh vật loại thực phẩm thị trường Thông qua so sánh nhận xét hiệu phương pháp áp dụng vào thực tế kiểm nghiệm Mẫu thực phẩm khảo sát thí nghiệm thu từ chợ, siêu thị sở sản xuất kinh doanh thực phẩm địa bàn thành phố Hồ Chí Minh Số lượng mẫu 70 mẫu đại diện cho tất loại thực phẩm Kết khảo sát trình bày Bảng 14 Bảng 14 Kết phân tích diện E coli số loại mẫu thực phẩm phương pháp PCR phương pháp nuôi cấy Đoàn Thị Ngọc Tuyền Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Trần Linh Thước Nhóm thực phẩm Số lượng mẫu Số mẫu dương tính với E coli Phương pháp PCR Phương pháp nuôi cấy ( tỷ lệ %) (tỷ lệ %) Thịt 14 Cá 27 22 23 Rau 17 13 13 Sữa 1 Trứng 0 Tổng cộng 70 43 (61%) 45 (62%) Kết Bảng 14 cho thấy diện E coli số loại mẫu thị trường cao khoảng 62% Hầu hết mẫu không qua đóng gói khử trùng bị nhiễm E coli Có khác biệt không đáng kể tỷ lệ phát E coli mẫu thực phẩm phương pháp PCR phương pháp nuôi cấy Phương pháp PCR cho tỉ lệ phát 61% , phương pháp nuôi cấy có tỉ lệ 62% Kết phân tích 70 mẫu chưa đủ để khẳng định tỉ lệ nhiễm E coli thực tế Đây kết bước đầu giúp cho nhà quản lý thực phẩm có đánh giá sơ tỉ lệ nhiễm vi sinh vật thực phẩm Đoàn Thị Ngọc Tuyền Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Trần Linh Thước PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết trình thí nghiệm rút số kết luận sau: - Đã thiết lập quy trình PCR để phát E coli cặp mồi EC tự thiết kế Cặp mồi EC có tính chuyên biệt cao chủng E coli Độ nhạy phát phương pháp PCR mẫu thực phẩm gây nhiễm – CFU/g thực phẩm sau 20 tăng sinh môi trường TSB Kết tương đương với phương pháp nuôi cấy - Đã tiến hành đánh giá hiệu lực sơ qui trình đề xuất Các thông số kó thuật phương pháp PCR độ xác, độ nhạy, độ đặc hiệu, dương tính giả, âm tính giả đạt tỉ lệ 100% so với phương pháp nuôi cấy Qui trình PCR có độ lặp lại cao, ổn định, dễ thực cho kết đồng - Đã thử nghiệm ứng dụng qui trình PCR để khảo sát tỉ lệ nhiễm E coli 70 mẫu thực phẩm khác nhau, phương pháp PCR phát 61% mẫu bị nhiễm E coli, thống với phương pháp truyền thống( 62%) ĐỀ NGHỊ Để phương pháp PCR chấp nhận ứng dụng rộng rãi, đề nghị số điểm sau: - Thực bước xác nhận hiệu lực thứ cấp để có đủ sở triển khai phương pháp PCR phát E coli vào thực tế - Thực khảo sát diện E coli loại thực phẩm diện tích rộng có kế hoạch để khẳng định chắn tỉ lệ nhiễm E coli thực phẩm lưu hành thị trường Đoàn Thị Ngọc Tuyền Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Trần Linh Thước TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Nguyễn Thanh Bảo (1993), Escherichia coli, Vi khuẩn học, Bộ môn vi sinh, Đại Học Y dược TP Hồ Chí Minh Nguyễn Hữu Chí (2001), Các bệnh đường tiêu hóa thường gặp, Nxb Thành Phố Hồ Chí Minh Nguyễn Tiến Dũng (2002), Phát phân biệt Samonella spp S entericaI PCR, Luận văn Thạc só Ngành Sinh học Trường Đại học Khoa học tự nhiên Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh Hồ Huỳnh Thùy Dương ( 2003), Sinh học phân tử, Nxb Giáo Dục Phạm Thành Hổ ( 2002), Di truyền học, Nxb Giáo Dục Lê Đình Hùng (1997), Đại cương phương pháp kiểm tra vi sinh thực phẩm,Trung tâm đo lường chất lượng III Nguyễn Đức Lượng, Phạm Minh Tâm (2000), Vệ sinh an toàn thực phẩm, Trường Đại học Kó Thuật TP Hồ Chí Minh Nguyễn Vónh Phước (1977), Vi sinh vật thú y tập I, II, III, Nxb Đại Học Trung Học Chuyên Nghiệp Hà Nội Bùi Thị Thuận, Nguyễn Phùng Tín, Bùi Minh Đức (1991), Kiểm tra chất lượng tra vệ sinh an toàn thực phẩm, Nxb Y học 10 Trần Linh Thước (2002), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, Nxb Giáo Dục 11 Trần Linh Thước (2001), Thực tập vi sinh vật học, Nxb Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh 12 Trần Thanh Thủy (2000), Hướng dẫn thực tập vi sinh vật học, Nxb Giáo Dục 13 Văn phòng công nhận chất lượng Việt Nam (2000) Yêu cầu chung lực phòng thử nghiệm hiệu chuẩn, ISO/IEC 17025 TIẾNG ANH Đoàn Thị Ngọc Tuyền Luận văn tốt nghiệp GVHD: PGS.TS Trần Linh Thước 14 AOAC International Methods Committee Guidelines for Validation of Qualitative Microbiological Official Methods of Analysis (2000) 15 Bruce A White (1993), PCR protocol, Human Press, New Jersey 16 Caeiro JP, Estrada - Garicia MT, Jiang ZD, Mathewson JJ, Adachi JA, Steffer R, Dupon HL (1999), Improved detection of enterotoxigenic Escherichia coli among patients with traverlers' diarrhea by use of the polymerase chain reaction technique J infection Disease, 180 (6) - 2053 - 2055 17 DBMD (2001) - Foodborne infections - General information 18 Hugh G Griffin, Annette M Griffin (1994), PCR technology: Current innovation, CRC Press USA 19 Jame P Nataro James B Kaper (1998), Diarrheagenic Escherichia coli, Clinical Microbiology Reviews, 11(1): 142 – 201 20 Sac – Single Jul (2002), Method validation of microbiological methods 21 World Health Organization (WHO) (1997) Vol.50 No 1/2 World Health statistics Quarterly TÀI LIỆU TRÊN INTERNET 22 http: // www bham.ac.uk/ bcmught / path /sero html 23 http: // www bham.ac.uk/ bcm 4ght 6/ path tox html 24 http: // www rva nl / pdfdoc / t02ukexplanatory doconmicribiologyb pdf 25 http:// www.cdc.gov/ ncidod/ diseaseinfo/ escherichia coli Ghtm 26 http:// www.bact.wise.edu/bact 330/lectureecoli Đoàn Thị Ngọc Tuyền ... phản ứng PCR cho phép phát 2.7 Quy trình? ?? mật E 103 CFU/ml hay 3CFU/ ng phươngPCR PCR E coli phát độ x coli thực phẩm bằ phản ứng pháp Căn vào kết thí nghiệm trên, đề nghị qui trình PCR để phát. .. TSB Gây nhiễm E coli mật độ Ủ 370C 24 Phát E coli Phát E coli phương pháp truyền thống phươngpháp PCR Hình Sơ đồ khảo sát giới hạn phát E coli mẫu thực phẩm gây nhiễm theo phương pháp truyền thống... lây nhiễm dẫn đến biến chứng CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÁT HIỆN E COLI TRONG THỰC PHẨM 3.1 Phương pháp nuôi cấy truyền thống [6,10] Phương pháp nuôi cấy truyền thống để phát E coli gồm ba bước: (1) tăng![- Phađn loái vaø ñaịc ñieơm hình thaùi [8] - Xây dựng Quy trình phát hiện Escherichia Coli trong thực phẩm bằng phương pháp PCR(Polumerase Chain Reaction) và thử nghiệm ứng dụng](https://media.store123doc.com/figures/001/876/phadn-loai-vao-naic-nieom-hinh-thaui-1876365.png)
