Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ a ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC KHUÔNG TRƢỜNG GIANG t NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY DẦU DIESEL CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TẠI CÂY XĂNG VIỆT HOÀNG HUYỆN PHÚ LƢƠNG TỈNH THÁI NGUYÊN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60 42 0201 LUẬN VĂN THẠC SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS: NGHIÊM NGỌC MINH Thái Nguyên, Năm 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chƣa có ai công bố trong một công trình nào khác. Thái Nguyên, ngày tháng năm 2013 Tác giả Khuông Trƣờng Giang Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ ii LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Nghiêm Ngọc Minh, Trƣởng phòng Công nghệ Sinh học Môi Trƣờng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã trực tiếp hƣớng dẫn, truyền đạt những kiến thức và những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài nghiên cứu. Trong quá trình làm luận văn, tôi đã nhận đƣợc sự giúp đỡ nhiệt tình của các anh chị trong Phòng Công nghệ Sinh học Môi Trƣờng. Đặc biệt là TS. Lê Thị Nhi Công, Th.S. Cung Thị Ngọc Mai, CN. Vũ Thị Thanh … Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Khoa sau Đại học - Đại học Thái Nguyên đã dạy dỗ và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Lời cuối cùng tôi xin cảm ơn những ngƣời thân trong gia đình, anh em và bạn bè đã động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể hoàn thành khóa học và thực hiện tốt luận văn này. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn! Thái Nguyên, ngày tháng năm 2013 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii CHƢƠNG I: MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1. Đặc điểm chung của dầu mỏ 3 2.1.1 Cấu trúc hóa học và đặc điểm của dầu mỏ: 3 2.1.2 Các sản phẩm từ dầu mỏ: 4 2.2. Tình trạng ô nhiễm dầu hiện nay và ảnh hƣởng của nó: 6 2. 2.1 Tình hình ô nhiễm dầu trên thế giới: 7 2.2.3 Hậu quả tác động của nước ô nhiễm dầu. 10 2.3. Các phƣơng pháp xử lý ô nhiễm dầu 12 2.3.1 Phương pháp cơ học: 12 2.3.2. Phương pháp hóa học: 12 2.4. Vai trò của vi sinh vật trong phân hủy dầu: 13 2.5. Cơ chế phân hủy dầu DO của vi sinh vật: 15 2.5.1. Phân hủy hydrocacbon no: 16 2.5.2 Phân hủy hydrocacbon thơm: 19 2.6. Các phƣơng pháp phân loại vi sinh vật: 19 2.6.1. Phương pháp phân loại truyền thống: 20 2.6.2 Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử: 20 CHƢƠNG III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 3.1 Nguyên liệu, hoá chất và các thiết bị sử dụng: 22 3.1.1 Nguyên liệu: 22 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ iv 3.1.2 Hoá chất, môi trƣờng nuôi cấy: 22 3.1.3. Máy móc và thiết bị nghiên cứu. 23 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu: 24 3.2.1. Thu thập mẫu: 24 3.2.2. Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng dầu diesel. 25 3.2.3. Khảo sát khả năng sử dụng dầu diesel của các chủng vi khuẩn. 25 3.2.4. Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của các chủng vi khuẩn: 26 3.2.5. Đánh giá ảnh hƣởng của một số điều kiện hóa lý tới khả năng phân hủy dầu diesel: 27 3.2.7. Phƣơng pháp phân loại vi sinh vật dựa vào xác định trình tự đoạn trên mã hóa 16S rRNA và xây dựng cây phát sinh chủng loại: 27 CHƢƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 4.1. Kết quả lấy mẫu đất và nƣớc thải. 31 4.3. Đặc điểm sinh học của chủng G10 41 4.4. Phân loại định tên và xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự đoạn gen mã hoá 16S rRNA của chủng vi khuẩn G10. 42 4.5. Ảnh hƣởng của pH, nồng độ muối NaCl đến khả năng sinh trƣởng trong môi trƣờng có dầu diesel của chủng G10: 45 4.6. Khả năng phân huỷ dầu diesel của chủng G10: 48 CHƢƠNG V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50 Kết luận 50 Kiến nghị: 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 51 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Atm Bp CFU DNA KDa LB MPA OD PCR Ppm RNA rRNA vsv X-gal : : : : : : : : : : : : : : : Standard atmosphere Base pair ( cặp bazơ ) Colony forming unit Deoxyribonucleic acid Kilo Dalton ( 1.66 x 10 -27 kg ) Luria - Broth Meat - Peptone - Agar Opitical Density ( mật độ quang học ) Polymerase Chain Reaction ( phản ứng chuỗi trùng hơp) Parts per million ( Đơn vị một phần triệu, mg/1) Ribonucleic acid Ribosomal ribonucleic acid Vi sinh vật 5 – bromo – 4 – crlomo – indolyl - - D – galactopy ranoside Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1. Máy móc và thiết bị dùng trong đề tài. ………………… ……… Bảng 4.1 Hình thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn phân lập đƣợc … Bảng 4.2. Khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng có dầu diesel 1% của 10 chủng vi kkhuẩn. …… Bảng 4.3. Khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng có dầu diesel 2% của 6 chủng vi khuẩn. …….… ………………………………………………………… Bảng 4.4. Khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng có dầu diesel 5% của 5 chủng vi khuẩn. … … ………………………………………………………… Bảng 4.5. Khả năng sinh trƣởng trên môi truờng có dầu diesel 10% của 4 chủng vi khuẩn. … … … Bảng 4.6. Một số chủng có trình tự 16S rRNA tƣơng đồng với chủng G10…… Bảng 4.7. Khả năng sinh trƣởng và phát triển của chủng G10 với nồng độ DO 10% ở các giải pH khác nhau. … … … ………………………… Bảng 4.8. Khả năng sinh trƣởng và phát triển của chủng G10 với nồng độ DO 10% ở các nồng độ muối NACl khác nhau. … … … … ………. 24 34 35 37 39 40 43 46 47 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 4.1. Mẫu đất và nƣớc tại cây xăng Việt Hoàng, xã Yên Đổ, Phú Lƣơng, Thái Nguyên. … … … … … … … … … ………… Hình 4.2a. Làm giàu lần 1 trên môi trƣờng khoáng có bổ sung 1% dầu DO.… … … … … … … … ………… .… … … … … ……. Hình 4.2b. Làm giàu lần 2 trên môi trƣờng khoáng có bổ sung 1% dầu DO.… … … … … … … … ………… .… … … … … ……. Hình 4.2c. Làm giàu lần 3 trên môi trƣờng khoáng có bổ sung 1% dầu DO.… … … … … … … … ………… .… … … … … ……. Hình 4.3. Tập đoàn vi sinh vật trên môi trƣờng muối khoáng Gost thạch. .… … … … … … … … ………… ……………………. Hình 4.4. Đặc điểm dịch nuôi chủng trên môi trƣờng muối khoáng có bổ sung 1% dầu diesel sau 7 ngày nuôi cấy. … … … …………………… Hình 4.5. Đồ thị biểu thị mức độ sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn ở nồng độ 1% dầu diesel Hình 4.6. Khả năng sinh trƣởng và phát triển trên môi trƣờng có 2% dầu diesel… ………………………………………………………………………. Hình 4.7. Đồ thị biểu thị mức độ sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn ở nồng độ 2% dầu diesel…………………………………………………………. Hình 4.8. Khả năng sinh trƣởng và phát triển trên môi trƣờng có 5% dầu diesel…………………………………………………………………………. Hình 4.9. Đồ thị biểu thị mức độ sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn ở nồng độ 5% dầu diesel………………………………………………………… Hình 4.10. Khả năng sinh trƣởng và phát triển trên môi trƣờng có 10% dầu diesel………………………………………………………… … Hình 4.11. Đồ thị biểu thị mức độ sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn 31 32 32 32 33 35 36 37 37 38 39 40 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ viii ở nồng độ 10% dầu diesel……………………………………………………… Hình 4.12. Đặc điểm khuẩn lạc và hình thái tế bào chủng G10……… Hình 4.13. Trình tự đoạn gen 16S rRNA của chủng vi khuẩn G10… Hình 4.14. Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn G10 ………. Hình 4.15. Đồ thị biểu thị mức độ sinh trƣởng của chủng vi khuẩn G10 tại các giá trị pH khác nhau …………………… ……………… …… Hình 4. 16. Đồ thị biểu thị mức độ sinh trƣởng của chủng vi khuẩn G10 tại các giá trị NaCl khác nhau ………………………………….…… 41 41 42 44 46 48 Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 1 CHƢƠNG I: MỞ ĐẦU Ngành công nghiệp chế biến dầu mỏ của các nƣớc trên thế giới trong đó có Việt Nam đã và đang phát triển không ngừng. Tuy nhiên cùng với sự phát triển của ngành này là tình trạng ô nhiễm môi trƣờng do ảnh hƣởng của các chất thải có nhiễm dầu. Các hiện tƣợng tràn dầu, rò rỉ dầu gây ô nhiễm nghiêm trọng cho môi trƣờng, làm hủy hoại hệ sinh thái động thực vật và ảnh hƣởng trực tiếp đến đời sống con ngƣời, trong đó ô nhiễm môi trƣờng nƣớc do dầu gây ra đƣợc xem là vấn đề đáng lo ngại bởi tốc độ lan truyền, quy mô ảnh hƣởng rộng và thời gian tác động lâu dài. Ngoài những sự cố kể trên thì vấn đề bảo quản xăng dầu của các kho chứa cũng nhƣ tại các cây xăng cũng có một số lƣợng xăng dầu không nhỏ gây ảnh hƣởng đến môi trƣờng xung quanh các kho chứa và các cây xăng đó. Đứng trƣớc những hiểm họa do ô nhiễm dầu mỏ và các sản phẩm của nó, để có thể giải quyết một cách triệt để đòi hỏi phải có sự kết hợp nghiên cứu của nhiều nhà khoa học, công nghệ và các nhà quản lý môi trƣờng cũng nhƣ sự hợp tác giữa các đơn vị vận chuyển, kinh doanh và sử dụng sản phẩm từ dầu mỏ. Với mục tiêu góp phần bảo vệ môi trƣờng, ngoài việc tránh các hiện tƣợng rò rỉ dầu ra bên ngoài thì việc xử lý nƣớc thải có nhiễm dầu đƣợc đặc biệt quan tâm chú ý. Hiện nay, phân hủy sinh học (biodegradation)đã đƣợc áp dụng rộng rãi đối với xử lý ô nhiễm dầu và các chất độc hóa học cũng nhƣ các chất ô nhiễm khác. Bản chất của công nghệ phân hủy sinh học là kích thích sự phát triển của vi sinh vật bản địa có khả năng phân hủy dầu hoặc các chất gây ô nhiễm khác có sẵn trong tự nhiên, bằng cách thay đổi các yếu tố môi trƣờng nhƣ độ thông khí, các chất dinh dƣỡng, nguồn nitơ, phốt pho, các chất vi lƣợng, các chất hoạt động bề mặt sinh học …v.v. Các yếu tố này có ý nghĩa là tạo ra điều kiện tối ƣu để các vi sinh vật sử dụng các thành phần dầu mỏ phát triển và [...]... động phân hủy để góp phần xử lý ô nhiễm dầu DO (diesel oil)để góp phần giải quyết vấn đề ô nhiễm dầu DO xung quanh các kho, bể chứa các cây xăng dầu, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu khả năng phân hủy dầu diesel của các chủng vi khuẩn phân lập tại cây xăng Vi t Hoàng huyện Phú lương tỉnh Thái Nguyên * Mục tiêu nghiên cứu: Tuyển chọn đƣợc một số chủng vi sinh vật có khả năng phân hủy. .. ảnh hƣởng của một số điều kiện hóa lý tới khả năng phân hủy dầu diesel: Đánh giá khả năng phân hủy 10% dầu diesel của chủng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng muối khoáng Gost, có dải pH ( 6; 6,5; 7; 7,5; 8; 8,5 và 9) và các nồng độ muối NaCl khác nhau ( 0%; 0,5%; 1%; 1,5%; 2% ) trong điều kiện nuôi lắc 200 vòng/phút ở 37oC 3.2.6 Xác định khả năng phân hủy dầu diesel của vi khuẩn: Chủng vi khuẩn chọn... năng phân hủy dầu DO ( diesel )cao phục vụ cho công nghệ xử lý nƣớc thải xung quanh các bể chứa hay các cây xăng dầu bằng phƣơng pháp phân hủy sinh học * Nội dung nghiên cứu: - Lấy mẫu, làm giàu, phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng dầu DO - Quan sát hình thái khuẩn lạc và hình dạng tế bào vi khuẩn - Phân loại bằng sinh học phân tử - Nghiên cứu ảnh hƣởng của các điều kiện pH,... dụng dầu diesel Từ mẫu ban đầu, tiến hành làm giàu 3 lần trên 50 ml môi trƣờng muối khoáng Gost có bổ sung 0,1% vitamin,1% dầu diesel, nuôi lắc ở 200 vòng/phút ở 37oC trong 7 ngày Tìm kiếm tập đoàn vi sinh vật và phân lập một số chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng dầu diesel đƣợc truyển chọn sau 3 lần làm giàu dựa vào màu sắc và hình thái khuẩn lạc 3.2.3 Khảo sát khả năng sử dụng dầu diesel của các chủng. .. III: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Nguyên liệu, hoá chất và các thiết bị sử dụng: 3.1.1 Nguyên liệu: Mẫu đất và nƣớc nhiễm dầu đƣợc chúng tôi thu thập tại cây xăng Vi t Hoàng thuộc xã Yên Đổ huyện Phú Lƣơng tỉnh Thái Nguyên Đƣợc lƣu giữ tại phòng Công nghệ Sinh học Môi trƣờng ,Vi n Công nghệ Sinh học ,Vi n Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Vi t Nam trong vòng 24 giờ để phân tích 3.1.2 Hoá chất, môi... Nghiên cứu ảnh hƣởng của các điều kiện pH, nồng độ muối NaCl lên khả năng phân hủy dầu DO - Đánh giá khả năng phân hủy dầu DO của chủng vi khuẩn phân lập đƣợc ở điều kiện tối ƣu Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 3 CHƢƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc điểm chung của dầu mỏ 2.1.1 Cấu trúc hóa học và đặc điểm của dầu mỏ: Dầu mỏ là chất lỏng sánh, có màu từ vàng sáng đến đen, có mùi... [25] Dầu mỏ và các sản phẩm có nguồn gốc dầu mỏ thƣờng có thành phần các phân đoạn khác nhau Dầu thô, dầu nhiên liệu ( FO)thƣờng có hàm lƣợng cao thành phần phân cực, trong khi đó dầu diezen ( DO), xăng thƣờng có thành phần chính là các hydrocarbon no [1], [2], [16] Cấu tạo của hydrocarbon trong thành phần dầu mỏ cũng ảnh hƣởng đến sự phân hủy dầu của vi sinh vật Các alkan mạch thẳng dễ bị phân hủy. .. thời gian xử lý và nhân rộng ra các điểm ô nhiễm dầu khác, cần thiết có các nghiên cứu sâu hơn về công nghệ, vi sinh vật cũng nhƣ sử dụng một số kỹ thuật sinh học phân tử 2.4 Vai trò của vi sinh vật trong phân hủy dầu: Dầu mỏ là một hỗn hợp các hợp chất hữu cơ có khả năng gây ô nhiễm môi trƣờng Trong dầu mỏ, chủ yếu là các hợp chất hydrocarbon nên dễ bị vi sinh vật phân hủy trong điều kiện hiếm khí và... tự nhiên, các vi sinh vật phân hủy dầu và các sản phẩm từ dầu mỏ luôn tồn tại và phân bố rộng rãi trong các hệ sinh thái khác nhau nhƣ trong đất, nƣớc ngọt, nƣớc biển, các mẫu trầm tích, vùng cực, suối nƣớc nóng, mỏ dầu, môi trƣờng axít, kiềm hoặc nồng độ muối cao vv và vô cùng đa dạng về chủng loài, bao gồm các nhóm vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm sợi, nấm men và một số loại tảo Căn cứ vào số lƣợng của chúng... lên ở các vùng gần bờ, vừng triều và vùng rừng ngập mặn [25] Rhodococcus có khả năng phân hủy mạch cacbon trung bình (C6), mạch cacbon dài từ C16 - C18, benzene và toluene [29] Vi sinh vật có khả năng phân hủy hydrocarbon đƣợc phân bố rộng rãi trong tự nhiên nhƣ đất, nƣớc.v.v Tuy nhiên, không một vi sinh vật đơn lẻ nào có khả năng phân hủy tất cả các loại hydrocarbon có trong thành phần của dầu mỏ . nhiễm dầu DO xung quanh các kho, bể chứa các cây xăng dầu, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: Nghiên cứu khả năng phân hủy dầu diesel của các chủng vi khuẩn phân lập tại cây xăng Vi t Hoàng. HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC KHUÔNG TRƢỜNG GIANG t NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY DẦU DIESEL CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TẠI CÂY XĂNG VI T HOÀNG HUYỆN. bị nghiên cứu. 23 3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu: 24 3.2.1. Thu thập mẫu: 24 3.2.2. Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng dầu diesel. 25 3.2.3. Khảo sát khả năng sử dụng dầu diesel của