BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN THỊ YẾN CHI NGHIÊN CỨU ACYL HÓA RUTIN VỚI XÚC TÁC LIPASE VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA CÁC RUTIN ESTER KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRẦN THỊ YẾN CHI NGHIÊN CỨU ACYL HÓA RUTIN VỚI XÚC TÁC LIPASE VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA CỦA CÁC RUTIN ESTER KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC Thầy hướng dẫn: PGS TS TRẦN CÁT ĐÔNG ThS VŨ THANH THẢO Thành phố Hồ Chí Minh – 2012 LỜI CẢM ƠN Khóa luận thực phịng thí nghiệm Vi Sinh Công Nghệ Dược, Khoa Dược, Đại học Y Dược Tp HCM, hướng dẫn của: PGS.TS Trần Cát Đơng ThS Vũ Thanh Thảo Kính gửi đến PGS TS Trần Cát Đông Th.S Vũ Thanh Thảo lời biết ơn chân thành quan tâm, kiên nhẫn tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho em hồn thành khóa luận Kính gửi đến Quý Thầy Cô trường Đại học Y Dược Tp HCM lòng biết ơn kiến thức quý báu truyền đạt cho em, tảng để thực khóa luận Xin cảm ơn thầy hội đồng đóng góp cho em ý kiến q báu để khóa luận em thêm hồn chỉnh Gửi đến anh chị em Phịng thí nghiệm Vi sinh Công nghệ Dược đặc biệt anh Văn Sơn, anh Minh Thái, chị Quỳnh Hương, bạn Kim Uyên lời cảm ơn nhiệt tình giúp đỡ mặt để tơi hồn thành tốt khóa luận Cuối cùng, xin gửi trọn tình yêu thương đến bố mẹ, anh chị và người thân sát cánh bên tôi, động viên giúp đỡ nhiều suốt q trình thực khóa luận Gia đình điểm tựa vững ấm áp Xin chân thành cảm ơn! Sinh viên: Trần Thị Yến Chi Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ đại học – Năm học 2011 – 2012 NGHIÊN CỨU ACYL HÓA RUTIN VỚI XÚC TÁC LIPASE VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA CÁC RUTIN ESTER Trần Thị Yến Chi Hướng dẫn: PGS TS Trần Cát Đông Th S Vũ Thanh Thảo Mục tiêu đặt vấn đề Rutin flavonoid có tác dụng tăng độ bền thành mạch, chống oxy hóa Tuy nhiên, ứng dụng cịn bị giới hạn nhiều, độ tan độ ổn định pha dầu pha nước Do đó, với mục tiêu cải thiện tính tan rutin pha dầu cách tạo dẫn xuất acyl hóa nó, chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu acyl hóa rutin với xúc tác lipase khảo sát hoạt tính chống oxy hóa rutin ester” Vật liệu phương pháp nghiên cứu Khảo sát sơ bộ điều kiện phản ứng: xác định dung mơi loại enzym thích hợp Tối ưu hóa thơng số phản ứng acyl hóa rutin: tỷ lệ chất, thời gian phản ứng, nồng độ enzym Khảo sát ảnh hưởng chiều dài mạch carbon acid béo đến phản ứng acyl hóa Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa rutin ester in vitro Kết bàn luận Khảo sát điều kiện cho phản ứng acyl hóa rutin, xác định điều kiện tối ưu sau: dung môi tert-butanol, enzyme lipase cố định g/l, tỷ lệ rutin : acid béo (1:2), thời gian phản ứng (4,52 ngày) acid béo cho hiệu suất cao acid lauric, acid palmitic acid stearic Kết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa cho thấy rutin ester có hoạt tính rutin phương pháp đánh bắt gốc tự DPPH khử ion sắt III Ngược lại, phương pháp bảo vệ màu hệ nhũ tương, rutin ester lại có tiềm ngăn chặn peroxyd hóa lipid gấp đơi rutin Kết luận Qua thực nghiệm, xác định điều kiện tối ưu phản ứng acyl hóa rutin với xúc tác lipase Và rutin ester tạo thành giữ hoạt tính chống oxy hóa theo nhiều chế khác Final assay for the degree of BS Pharm – Academic year: 2011 - 2012 ACYLATION OF RUTIN BY LIPASE AS BIOCATALYST AND ANTIOXIDANT PROPERTIES OF RUTIN ESTERS Tran Thi Yen Chi Supervisor: Assoc Prof Tran Cat Dong Ph.D Vu Thanh Thao M.A Introduction Rutin, a flavonoid, has many biological properties such as blood vessel protection, antioxidation … However, the use of rutin was strongly limited due to their low solubility and stability in both lipophilic and aqueous media The acylation of this molecule can improve it’s lipophilic properties We, therefore, carried out the research: “Acylation of rutin by lipase as biocatalyst and antioxidant properties of rutin esters” Material and methods Initial investigation the reaction conditions: determine the solvents and the types of enzymes Optimization the reaction parameters of acylation reaction: determine substrate ratio, reaction time and enzyme ratio Investigation the effects of carbon-chain length of the fatty acids (C6 to C18) on the rutin acylation performance Investigation antioxidant properties of rutin ester in vitro Results and discussion The optimum conditions of acylation reaction in tert-butanol solvent with immobilized lipase were identified as follows the ratio of rutin and fatty acid is 1:2, the reaction time is 4.52 days, quantity of enzymes is 5g/L Besides, the suitable fatty acids for reaction are lauric, palmitic and stearic so the reactions produce the conversion yield is high The survey results suggested that lipophilic rutin esters maintain the antioxidant capacity of the initial flavonoid, but decrease reducing power and radical scavenging abilities Conversely, the potential of rutin esters in the inhibition of lipid peroxidation were twice as much as rutin Conclusion We has identified the optimum conditions of acylation reaction of rutin by lipase as biocatalyst And modified rutin esters maintain the antioxidant properties with many different mechanisms Khóa luận Dược sĩ Đại học i Mục lục MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN iii MỤC LỤC .i DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ii DANH MỤC HÌNH iii DANH MỤC BẢNG .iv ĐẶT VẤN ĐỀ Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 Chương KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .34 Chương KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 Trần Thị Yến Chi Khóa luận Dược sĩ Đại học ii Danh mục chữ viết tắt DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT LDL Lipoprotein tỷ trọng thấp MeOH Methanol EtOAc Etyl acetate HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao RSM Phương pháp đáp ứng bề mặt DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl BHT Butylated hydroxytoluene Trần Thị Yến Chi Khóa luận Dược sĩ Đại học iii Danh mục hình DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơng thức hóa học rutin Hình 1.2 Một số hình ảnh hoa hịe Hình 1.3 Vị trí acyl hóa đặc hiệu rutin xúc tác lipase chiết từ Candida antarctica 12 Hình 2.4 Sơ đồ trình thực phản ứng acyl hóa rutin .23 Hình 2.5 Sơ đồ trình chiết tách tinh chế 24 Hình 2.6 Đường chuẩn rutin 26 Hình 2.7 Cơng thức gốc tự DPPH 30 Hình 3.8 Sắc ký đồ sản phẩm sau phản ứng acyl hóa rutin enzym 35 Hình 3.9 Sắc ký đồ HPLC sản phẩm sau phản ứng acyl hóa xúc tác lipase cố định 37 Hình 3.10 Kết khảo sát ảnh hưởng chiều dài mạchf carbon acid béo đến phản ứng acyl hóa 42 Hình 3.11 Kết khảo sát khả đánh bắt gốc tự Rutin, Rutin ester, BHT 43 Hình 3.12 Kết đánh giá khả khử tồn phần rutin, rutin ester, BHT 44 Hình 3.13 Thử nghiệm bảo vệ màu hệ nhũ tương β-caroten - acid linoleic 45 Hình 3.14 Kết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa rutin, rutin ester, BHT vitamin C 46 Trần Thị Yến Chi Khóa luận Dược sĩ Đại học iv Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các phản ứng xúc tác lipase 10 Bảng 1.2 Các nguồn thu nhận lipase từ động vật có vú, vi nấm vi khuẩn [20] 10 Bảng 1.3 Phân loại chất chống oxy hóa dựa nguồn gốc chế 15 Bảng 2.4 Các acid béo sử dụng thử nghiệm .20 Bảng 2.5 Giai mẫu xác định đường chuẩn rutin 26 Bảng 2.6 Thiết kế thí nghiệm theo phương pháp RSM từ phần mềm DX7.1 .28 Bảng 2.7 Phản ứng xác định khả khử ion sắt III 31 Bảng 3.8 Kết khảo sát dung môi enzym khác .38 Bảng 3.9 Kết thí nghiệm theo phương pháp RSM 38 Bảng 3.10 Phân tích ý nghĩa thống kê mơ hình hệ số hồi qui 39 Bảng 3.11 Kết đánh giá độ tương thích mơ hình 41 Bảng 3.12 Kết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa rutin, rutin ester, BHT vitamin C 45 Trần Thị Yến Chi Khóa luận Dược sĩ Đại học Đặt vấn đề ĐẶT VẤN ĐỀ Flavonoid nhóm hợp chất lớn thường gặp thực vật, nửa rau thường dùng có chứa flavonoid Flavonoid thường có màu vàng nhạt, có 4.000 chất xác định cấu trúc Bên cạnh hoạt tính sinh học kháng khuẩn, kháng virus, kháng viêm, kháng ung thư, giảm nguy tim mạch…thì hoạt tính chống oxy hóa flavonoid khác Hoạt tính chống oxy hóa flavonoid thể thông qua khả đánh bắt gốc tự do, tạo phức với ion kim loại Rutin flavonoid dạng glycosid bao gồm aglycol quercetin đường đôi rutinose (rhamnose glucose) Rutin sử dụng rộng rãi để làm thuốc với mục đích chống lão hóa tế bào, phịng trị số bệnh liên quan đến mạch máu Một dẫn xuất quan trọng rutin quercetin sử dụng phổ biến Trong cấu trúc hai chất có nhiều nhóm OH phenol, làm cho phân tử trở nên phân cực, giảm hấp thu qua ruột Tuy nhiên, ứng dụng rutin lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm bị giới hạn, độ ổn định độ tan pha dầu pha nước Vì vậy, có nhiều nghiên cứu nhằm thay đổi cấu trúc rutin (acyl hóa glycosyl hóa), phương pháp tổng hợp hóa học, tổng hợp sinh học (enzym) … nhằm tăng độ ổn định độ tan rutin [11] Trong bào chế dược phẩm, glycosyl hóa flavonoid khiến chúng tăng tính thân nước, thích hợp để điều chế chế phẩm đường tiêm Mặt khác, dẫn xuất acyl hóa flavonoid lại có tính thân dầu cao Các phương pháp tổng hợp hóa học hay sinh học để tổng hợp dẫn xuất nghiên cứu nhiều Trong đó, phương pháp tổng hợp đường xúc tác sinh học (enzym) cho thấy có nhiều ưu điểm thích hợp phản ứng enzym có tính đặc hiệu cao Một số nghiên cứu cho thấy có nhiều yếu tố cấu trúc mạch acyl, Trần Thị Yến Chi Khả đá nh bắt gốc tự (%) Khóa luận Dược sĩ Đại học 43 Kết bàn luận 100 Rutin Rutin laurat Rutin palmitat Rutin stearat BHT 80 60 40 20 25 50 100 Nồng độ (µM) Hình 3.11 Kết khảo sát khả đánh bắt gốc tự Rutin, Rutin ester, BHT Nhận xét : Ở nồng độ thấp mà ta khảo sát (25 µM), rutin có khả đánh bắt gốc tự cao hẳn (68,82%) so với rutin ester Khi tăng nồng độ lên 50 µM khả rutin rutin ester tăng mạnh Và nồng độ cao (100 µM) rutin rutin ester có kết xấp xỉ (79,3 đến 84,08 %) Trong đó, BHT lại có khả đánh bắt gốc tự thấp đáng kể so với rutin rutin ester, có 33,33% 100 µM Kết thử nghiệm cho thấy, dẫn xuất acyl hóa rutin có hoạt tính chống oxy hóa, khơng lớn rutin lớn BHT xấp xỉ rutin nồng độ cao Trong đó, rutin laurat có hoạt tính cao 3.1.4.2 Kết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa rutin dẫn xuất acyl hóa rutin thử nghiệm đánh giá khả khử ion sắt III Kết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa rutin rutin ester thử nghiệm đánh giá khả khử ion sắt III biểu diễn đồ thị Hình 3.5 Trần Thị Yến Chi Khóa luận Dược sĩ Đại học 44 Kết bàn luận Độ hấp thu 700 nm 0.30 Rutin Rutin laurat Rutin palmitat Rutin stearat BHT 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00 25 50 100 Nồng độ (µM) Hình 3.12 Kết đánh giá khả khử toàn phần rutin, rutin ester, BHT Nhận xét : Ở tất nồng độ, rutin cho thấy chất có khả khử ion sắt III mạnh chất khảo sát, lớn so với rutin ester Trong đó, rutin laurat có khả khử (0,153 100 µM) cao rutin palmitat (0,131 100 µM) rutin stearat (0,123 100 µM) Khả khử BHT thấp rutin ester khảo sát 3.1.4.3 Kết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa rutin dẫn xuất acyl hóa rutin thử nghiệm bảo vệ màu hệ nhũ tương β-caroten - acid linoleic Tiến hành thực theo bước cụ thể mô tả phần 2.2.5.3 Hoạt tính chống oxy hóa T (%) tính sau:  A − At T (%) = 100 × 1 − '  A0 − At'  A0 : Độ hấp thu mẫu thử thời điểm phút At : Độ hấp thu mẫu thử thời điểm t = 90 phút ' Ao : Độ hấp thu mẫu đối chiếu thời điểm phút Trần Thị Yến Chi     Khóa luận Dược sĩ Đại học 45 Kết bàn luận At' : Độ hấp thu mẫu đối chiếu thời điểm t = 90 phút ' Ao = 0,803; At' = 0,265 Các chất thử nghiệm tiến hành với BHT vitamin C (làm chất so sánh) Bảng 3.12 Kết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa rutin, rutin ester, BHT vitamin C STT Chất thử nghiệm Rutin A0 At T (%) 0,792 0,473 40,70 Rutin laurat 0,814 0,731 84,57 Rutin palmitat 0,838 0,761 85,68 Rutin stearat 0,810 0,766 91,82 BHT 0,836 0,830 98,88 Vitamin C 0,735 0,220 4,27 Hình 3.13 Thử nghiệm bảo vệ màu hệ nhũ tương β-caroten - acid linoleic 0: mẫu đối chiếu; 1: rutin; 2: rutin laurat; 3: rutin palmitat; 4: rutin stearat; 5: vitamin C; 6: BHT Trần Thị Yến Chi 46 Kết bàn luận 100 90 80 70 60 50 40 30 20 C in m Vi ta B H T st ea t ita t R ut in pa lm R ut in R ut in la ur at 10 R ut in Hoạt tính chống oxy hóa (%) Khóa luận Dược sĩ Đại học Hình 3.14 Kết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa rutin, rutin ester, BHT vitamin C Nhận xét : Các dẫn chất acyl hóa rutin nghiên cứu có hoạt tính chống oxy hóa cao (84,57 đến 91,82%) gần BHT (98,88%) thử nghiệm bảo vệ màu hệ nhũ tương β-caroten - acid linoleic điều đáng ý chúng cao gấp lần so với rutin (40,70%) Trong đó, hoạt tính tăng từ ester acid béo có mạch carbon ngắn (rutin laurat 84,57%) đến ester acid béo có mạch carbon dài (rutin stearat 91,82%) 3.2 BÀN LUẬN KẾT QUẢ 3.2.1 Về khảo sát yếu tố ảnh hưởng lên phản ứng acyl hóa rutin Tác giả Ardhaoui cộng có tài liệu nghiên cứu phản ứng acyl hóa flavonoid, đó, tert-amyl-acohol cho dung mơi thích hợp với phản ứng [11, 12] Tuy nhiên, khơng tìm mua dung mơi thị trường nên tiến hành khảo sát dung môi thử nghiệm Nghiên cứu Trần Thị Yến Chi Khóa luận Dược sĩ Đại học 47 Kết bàn luận Kontogianni cộng ghi nhận dung môi cho hiệu suất phản ứng acyl hóa flavonoid mức cao aceton tert-butanol [21] Trong đó, Nakajima N cộng lại cho acetonitril aceton dung mơi thích hợp cho tác dụng xúc tác phản ứng ester hóa enzym lipase chiết từ Candida antarctica [28] Tuy nhiên, aceton lại dung mơi có đăc tính bất lợi cho phản ứng khả bay cao, độc dễ cháy Ngoài ra, tiến hành thử nghiệm, nhận thấy dung môi acetonitril hòa tan chất (rutin) nhiều so với tert-butanol Kết thử nghiệm cho thấy hiệu suất phản ứng acyl hóa dung mơi tert-butanol (47%) cao acetonitril (34%) Vì vậy, chúng tơi định chọn tert-butanol dung môi phù hợp cho phản ứng acyl hóa rutin Yếu tố ảnh hưởng mà khảo sát loại enzym (tự cố định) Kết cho thấy enzym tự (lipase chiết từ Candida rugosa) cho hiệu suất phản ứng thấp hơn, đồng thời chi phí cao enzym cố định (lipase chiết từ Candida antarctica) thu hồi để tái sử dụng Nhiều nghiên cứu gần phản ứng acyl hóa flavonoid sử dụng enzym xúc tác lipase cố định Đặc biệt, Novozym 435 chế phẩm enzym cố định (lipase chiết từ Candida antarctica) sử dụng rộng rãi thị trường Kết khảo sát chiều dài mạch carbon acid béo cho thấy có ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng acyl hóa rutin Kết khác với nghiên cứu Kontogianni cộng Trong nghiên cứu, tác giả tiến hành phản ứng acyl hóa flavonoid (rutin, naringin) Novozym 435® với acid béo khác (C8, C10, C12) kết chiều dài mạch carbon không ảnh hưởng đến hiệu suất phản ứng [21] Tuy nhiên, nghiên cứu khác, Ardhaoui cộng lại cho hiệu suất phản ứng có bị ảnh hưởng chiều dài mạch carbon acid béo hiệu suất thấp gặp acid béo mạch ngắn (