I GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Đặt vấn đề Chi Goniothalamus (tên Tiếng Việt Giác đế) thuộc họ Na (Annonaceae) có 160 lồi phân bố vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới, đặc biệt Châu Á, tập trung nhiều Đơng Nam Á Nhiều lồi số sử dụng thuốc y học cổ truyền Theo tác giả Nguyễn Tiến Bân, chi Goniothalamus Việt Nam có 19 lồi Một số lồi chi sử dụng chữa vết thương, làm thuốc trị đòn ngã tổn thương, gãy xương, làm thuốc bổ, kích thích tiêu hóa Cho đến có khoảng 30 loài số 160 loài thuộc chi Goniothalamus nghiên cứu hoá thực vật Các nghiên cứu cho thấy styryl-lactone, alkaloid acetogenin lớp chất có lồi Goniothalamus; nhiều styryl-lactone acetogenin thể hoạt tính sinh học phong phú hoạt tính gây độc tế bào, chống khối u, trừ sâu, chống nấm, kháng trùng sốt rét, kháng lao hoạt tính chống oxi hóa Trong khn khổ Đề tài nghiên cứu khoa học mã số 104.01.76.09 dự án Hợp tác Quốc tế Pháp - Việt “Nghiên cứu hóa thực vật thảm thực vật Việt Nam”; số loài Goniothalamus Việt Nam thu hái thử hoạt tính sơ Kết cho thấy dịch chiết EtOAc vỏ Goniothalamus macrocalyx Ban có khả ức chế 50,2%; 43,1% dòng tế bào ung thư biểu mô KB nồng độ μg/mL Dịch chiết EtOAc Goniothalamus gracilipes Ban có khả ức chế 29,7%; 17,0% dòng tế bào KB nồng độ 1,0 μg/mL Cho đến có lồi Goniothalamus Việt Nam (G tamirensis, G vietnamensis) nghiên cứu thành phần hóa học chưa có cơng trình nước hay quốc tế nghiên cứu hóa học hai lồi G macrocalyx Ban G gracilipes Ban Do lựa chọn hai loài Goniothalamus làm đối tượng nghiên cứu Luận án:  Cây Giác đế đài to (Goniothalamus macrocalyx Ban, Annonaceae)  Cây Giác đế cuống dài (Goniothalamus gracilipes Ban, Annonaceae) Nhiệm vụ luận án  Thu hái mẫu thực vật  Điều chế cặn chiết từ mẫu thực vật  Phân lập tinh chế hợp chất thiên nhiên từ cặn chiết  Xác định cấu trúc hợp chất phân lập  Thử hoạt tính chống ung thư hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hợp chất phân lập Ý nghĩa khoa học đóng góp luận án 3.1 Ý nghĩa khoa học - Luận án đóng góp hiểu biết thành phần hóa học hoạt tính sinh học lồi Goniothalamus macrocalyx Ban (Giác đế đài to) Goniothalamus gracilipes Ban (Giác đế cuống dài) Việt Nam - Ứng dụng phương pháp nghiên cứu cấu trúc tinh thể hợp chất hữu cơ, phương pháp phổ khối xác định cấu trúc acetogenin 3.2 Những đóng góp luận án Hai loài Goniothalamus họ Na: Giác đế đài to (Goniothalamus macrocalyx Ban) Giác đế cuống dài (Goniothalamus gracilipes Ban) Việt Nam lần đầu nghiên cứu cách có hệ thống thành phần hóa học hoạt tính sinh học:  Từ Giác đế đài to phân lập hợp chất 8hydroxygoniofupyrone A (GM11) furano-pyrone cấu trúc hợp chất khẳng định thông qua phương pháp nhiễu xạ tia X Hợp chất 4-deoxycardiobutanolide (GM12) lần phân lập từ tự nhiên, hợp chất acetogenin annonacin (GM14), cis+trans-solamin (GM15), isoannonacin (GM16), trans-murisolinone (GM17) xác định cấu trúc phương pháp phổ khối lượng (HPLC-Li-(+)ESI-LTQ/Orbitrap HPLC-Li(+)ESI/QTOF)  Từ Giác đế cuống dài phân lập gracilipin A (GG2) hợp chất linear-acetogenin methylsaccopetrin A (GG3) hợp chất linear-acetogenin lần phân lập từ tự nhiên  Từ Giác đế cuống dài phân lập gracilipin B (GG13), gracilipin C (GG14), gracilipin D (GG15) hợp chất cấu trúc gracilipin B (GG13) khẳng định phương pháp nhiễu xạ tia X  Về hoạt tính sinh học hợp chất phân lập: Hợp chất styryllactone goniothalamin (GM5), altholactone (GM1); 7-acetylaltholactone (GM13) thể hoạt tính dòng tế bào KB, HepG2, Lu-1 Trong 7-acetylaltholactone (GM13) có hoạt tính mạnh dịng tế bào KB (IC50 = 3,60 µg/mL) mạnh altholactone (GM1) dòng tế bào thử nghiệm Hợp chất acetogenin annonacin (GM14) thể hoạt tính mạnh dòng tế bào KB (IC50 = 3,50 µg/mL) Hợp chất linear-acetogenin gracilipin A (GG2) saccopetrin A (GG1) thể hoạt tính ức chế phát triển dòng tế bào KB tốt với giá trị IC50 = 4,40; 4,70 g/mL tương ứng Hợp chất benzopyran-sesquiterpene Gracilipin C (GG14) thể hoạt tính yếu dòng tế bào KB chủng Gram (+) Staphylococus aureus Bố cục luận án Luận án dày 160 trang với 11 bảng số liệu, 49 hình 108 tài liệu tham khảo kết cấu sau: Mục lục, Danh mục kí hiệu chữ viết tắt, Danh mục bảng, Danh mục hình Danh mục phụ lục Đặt vấn đề (3 trang) Chương 1: Tổng quan (30 trang) Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu (4 trang) Chương 3: Thực nghiệm (33 trang) Chương 4: Kết thảo luận (73 trang) Kết luận kiến nghị (3 trang) Danh mục cơng trình có liên quan đến luận án (2 trang) Phần tài liệu tham khảo (12 trang) Ngồi ra, luận án cịn có phần phụ lục gồm phổ hợp chất phân lập II NỘI DUNG LUẬN ÁN ĐẶT VẤN ĐỀ Phần đặt vấn đề cập đến ý nghĩa khoa học, tính thực tiễn, đối tượng nhiệm vụ nghiên cứu luận án CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Giới thiệu sơ lược thực vật học họ Na (Annonaceae) Giới thiệu thực vật chi Giác đế (Goniothalamus), đặc điểm thực vật lài Giác đế đài to (Goniothalamus macrocalyx Ban) Giác đế cuống dài (Goniothalamus gracilipes Ban) Các nghiên cứu nước giới hóa học hoạt tính sinh học chi Goniothalamus CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thu hái mẫu xác định tên khoa học Mẫu vỏ loài Giác đế đài to (Goniothalamus macrocalyx Ban, Annonaceae) thu hái Phú Linh, Hà Giang Mẫu Giác đế cuống dài (Goniothalamus gracilipes Ban, Annonaceae) thu hái Văn Lang, Đồng Hỷ, Thái Nguyên Hai mẫu nhà thực vật học Nguyễn Hữu Hiến định tên 2.2 Phương pháp xử lý chiết mẫu Các mẫu thực vật sau thu hái thái nhỏ, phơi bóng mát, sấy khơ nhiệt độ 40-45 oC, sau đem nghiền nhỏ Các mẫu vỏ, Giác đế đài to mẫu Giác đế cuống dài ngâm chiết theo quy trình chung: Ngâm chiết với dung mơi CH2Cl2, MeOH nhiệt độ phịng; gộp dịch chiết lọc, cất loại dung môi áp suất thấp thu cặn chiết CH2Cl2, MeOH tương ứng Mẫu Giác đế cuống dài ngâm chiết với dung mơi MeOH nhiệt độ phịng Dịch chiết sau cất loại dung mơi áp suất thấp thu dịch chiết thô Thêm hỗn hợp MeOH nước theo tỉ lệ thể tích 1/1 vào dịch chiết thô chiết dung môi n-hexane, EtOAc 2.3 Phương pháp phân tích, phân tách hỗn hợp phân lập hợp chất từ mẫu thực vật Việc phân tích, phân tách dịch chiết thực phương pháp kết tinh phương pháp sắc ký khác như: sắc ký lớp mỏng (TLC, dùng để khảo sát, điều chế lượng nhỏ), sắc ký cột thường (CC) với pha tĩnh silica gel (Merck) sephadex LH-20 Dung môi rửa giải chủ yếu dùng hệ dung môi n-hexane/CH2Cl2, n-hexane/EtOAc, nhexane/acetone, CH2Cl2/MeOH,… với tỉ lệ thích hợp 2.4 Các phương pháp xác định cấu trúc hợp chất phân lập Các phương pháp phổ như: phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại-khả kiến (UV-vis), phổ khối phun bụi điện tử (ESI-MS), phổ khối phân giải cao (HRMS), phổ khối nhiều lần MS/MS phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân chiều (1H-NMR, 13C-NMR DEPT) hai chiều (HSQC, HMBC, COSY, NOESY) sử dụng để nhận dạng xác định cấu trúc hóa học chất phân lập Phương pháp phổ khối phân giải cao sàng lọc ion gắn thiết bị sắc ký lỏng hiệu cao sử dụng muối lithium ion hóa phân tử HPLC-Li-(+)ESILTQ/Orbitrap, HPLC-Li-(+)ESI-QTOF cho tín hiệu số khối ion mảnh đặc trưng cho phép xác định vị trí nhóm hydroxyl, vịng THF phân tử acetogenin Trong số trường hợp có sử dụng phương pháp nhiễu xạ tia X đơn tinh thể để khẳng định cấu trúc hợp chất Bên cạnh cịn kết hợp với việc so sánh số số vật lý độ quay cực, điểm nóng chảy chất 2.5 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào: Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro Viện Ung thư Quốc gia Hoa kỳ (NCI) xác nhận phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát chất có khả ức chế phát triển tế bào ung thư điều kiện in vitro Bốn dòng tế bào ung thư người cung cấp ATTC gồm: KB ung thư biểu mô (CCL – 17TM); Hep G2 - ung thư gan (HB – 8065TM); MCF-7 ung thư vú (HTB – 22TM) LU-1 - ung thư phổi (HTB-57TM) Sử dụng phương pháp MTT assay Phép thử tiến hành Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Một số chất phân lập cịn thử hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào KB dòng tế bào phổi nguyên bào sợi người MRC-5 Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên - Cộng hịa Pháp Phương pháp thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định: Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định thử theo phương pháp pha loãng đa nồng độ F Hadacek H Greger Vi khuẩn nấm kiểm định gây bệnh người sử dụng phép thử gồm: Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Lactobacillus fermentum, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica, Candida albicans CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM Chương mô tả chi tiết trình: - Xử lý mẫu thực vật loài Goniothalamus (Giác đế đài to, Giác đế cuống dài), điều chế phần chiết phân lập hợp chất - Hằng số vật lí kiện phổ hợp chất phân lập từ loài Goniothalamus nghiên cứu - Khảo sát hoạt tính chống ung thư hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chất phân lập 3.1 Tách chiết, phân lập chất từ Giác đế đài to 3.1.1 Vỏ Giác đế đài to Từ vỏ Giác đế đài to phân lập xác định cấu trúc hóa học 10 hợp chất gồm styryl-lactone: altholactone (GM1), goniopypyrone (GM2), goniofufurone (GM3), cardiobutanolide (GM4), goniothalamin (GM5); sesquiterpene (+)-T-cadinol (GM6), α-cadinol (GM7); alkaloid aristolactam BII (GM8), 3-methyl-1H-benz[f]indole-4,9-dione (GM9) acid béo acid nonacosanoic (GM10) Hình 3.1 Sơ đồ ngâm chiết vỏ Giác đế đài to Hình 3.2 Sơ đồ phân lập dịch chiết CH2Cl2 vỏ Giác đế đài to Hình 3.3 Sơ đồ phân lập dịch chiết MeOH vỏ Giác đế đài to Dữ kiện phổ chất phân lập từ vỏ Giác đế đài to: Altholactone (GM1): Chất dầu màu vàng nhạt; Rf = 0,67 (n-hexaneEtOAc 30/70, v/v); []D25 + 233,5o (c 0,65; EtOH) FT-IR (film) νmax (cm1): 3432, 3070, 2928, 1726, 1637, 1454, 1368, 1252, 1093, 1022, 823, 704, 640, 448 UV maxMeOH nm (log ): 207 (4,34) (+)-ESI-MS: m/z 255 [M+Na]+ H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 7,29 (5H, m, C6H5); 6,98 (1H, dd, J=5,0 10,0 Hz, H-4); 6,20 (1H, d, J=10,0 Hz, H-3); 4,90 (1H, dd, J=2,5; 5,5 Hz, H-6); 4,73 (1H, d, J=5,5 Hz, H-8); 4,61 (1H, t, J=5,0 Hz; H-5); 4,42 (1H, m, H7); 3,62 (1H, d, J=3,5 Hz, OH) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 161,6 (C-2); 140,5 (C-4); 138,1 (C9); 128,6 (C-11, C-13); 128,3 (C-12); 126,1 (C-10, C-14); 123,6 (C-3); 86,6 (C6); 86,0 (C-8); 83,5 (C-7); 68,1 (C-5) Goniopypyrone (GM2): Tinh thể hình kim màu trắng; đnc 179-181 oC; Rf = 0,42 (n-hexane-EtOAc 30/70, v/v); []D25 + 61,7 o (c 0,3; EtOH) FT-IR (KBr) νmax (cm1): 3400, 3272, 2986, 2872, 1741, 1447, 1346, 1223, 1169, 1058, 830, 740, 708, 513, 450 UV maxMeOH nm (log ): 206 (3,93); 252 (2,44) (+)-ESI-MS: m/z 273 [M+Na]+ H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 7,42 (4H, m); 7,37 (1H, m); 5,01 (1H, br s, H-8); 4,80 (1H, m, H-5); 4,46 (1H, m, H-4); 4,14 (2H, m, H-7, OH); 4,02 (1H, m, H-6); 3,08 (1H, dd, J=1,5; 19,5 Hz, H-3a); 3,00 (1H, dd, J=5,0; 19,5 Hz, H-3b); 2,37 (1H, d, J=3,5 Hz, OH) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 167,8 (C-2); 135,9 (C-9); 129,0 (C11, C-13); 128,6 (C-12); 126,2 (C-10, C-14); 72,7 (C-6); 70,9 (C-4); 70,4 (C-8); 70,1 (C-7); 64,5 (C-5); 35,2 (C-3) Goniofufurone (GM3): Tinh thể hình kim màu trắng; đnc 152-153 oC; Rf = 0,39 (n-hexane-EtOAc 30/70, v/v); []D25 + 11,5o (c 0,4, EtOH) FT-IR (KBr) νmax (cm1): 3420, 3350, 2996, 2862, 1746, 1450, 1342, 1191, 1046, 905, 702, 635, 493 UV maxMeOH nm (log ): 206 (3,95); 258 (2,31) (+)-ESI-MS: m/z 273 [M+Na]+ H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 7,43 (2H, d, J=7,5 Hz, H-10, H14); 7,35 (2H, t, J=7,5 Hz, H-11, H-13); 7,28 (1H, t, J=7,5 Hz, H-12); 4,94 (2H, m, H-4, H-5); 4,89 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-8); 4,47 (1H, m, H-6); 3,98 (1H, dd, J=2,0; 8,0 Hz, H-7); 2,81 (1H, dd, J=6,0; 18,5 Hz, H-3a); 2,42 (1H, d, J=18,5 Hz, H-3b) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 178,1 (C-2); 143,6 (C-9); 129,2 (C-11, C-13); 128,7 (C-12); 128,0 (C-10, C-14); 89,5 (C-5); 85,2 (C-7); 78,4 (C-4); 74,7 (C-6); 72,3 (C-8); 36,3 (C-3) Cardiobutanolide (GM4): Chất bột rắn màu trắng; đnc 188-190 oC; Rf = 0,41 (CH2Cl2-MeOH 90/10); []D24 +1,3o (c 0,15; MeOH) FT-IR (KBr) νmax (cm1): 3476, 2937, 2852, 1743, 1629, 1581, 1400, 1206, 1113, 985, 645, 608, 500, 452 UV maxMeOH nm (log ): 208 (3,43); 260 (2,06) (+)-ESI-MS: m/z 291 [M+Na]+ H-NMR (500 MHz, CD3OD): δ (ppm) 7,46 (1H, d, J=7,5 Hz, H-10, H14); 7,35 (2H, t, J=7,5 Hz, H-11, H-13); 7,27 (1H, td, J=1,5; 7,5 Hz, H-12); 4,78 (1H, d, J=8,0 Hz, H-8); 4,59 (1H, dd, J=3,5; 8,0 Hz, H-5); 4,53 (1H, td, J=0,5; 4,5 Hz, H-4); 4,41 (1H, dd, J=1,5; 8,0 Hz, H-6); 3,90 (1H, dd, J=1,5; 8,0 Hz, H-7); 2,92 (1H, dd, J=5,0; 17,5 Hz, H-3a), 2,45 (1H, dd, J=0,5; 17,5 Hz, H3b) 13 C-NMR (125 MHz, CD3OD): δ (ppm) 178,6 (C=O); 144,2 (C-9); 129,1 (C-11, C-13); 128,5 (C-12); 128,4 (C-10, C-14); 88,2 (C-5); 75,4 (C-8); 74,4 (C-7); 70,3 (C-6); 68,8 (C-4); 40,9 (C-3) Goniothalamin (GM5): Chất rắn màu vàng nhạt; đnc 82-84 oC; Rf = 0,44 (n-hexane-CH2Cl2 20/80, v/v); []D27 +81,0o (c 0,2; EtOH) FT-IR (KBr) νmax (cm1): 2925, 1707, 1664, 1627, 1454, 1382, 1244, 1066, 966, 822, 759, 699, 584, 512, 440 UV maxMeOH nm (log ): 210 (4,43); 251 (4,32); 282 (3,25); 290 (3,03) (+)-ESI-MS: m/z 223 [M+Na]+ H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 7,40 (2H, m, H-10, H-14); 7,34 (2H, m, H-11, H-13); 7,27 (1H, m, H-12); 6,92 (1H, ddd, J=4,0; 5,0; 9,5 Hz, H-4); 6,73 (1H, d, J=16,0 Hz, H-8); 6,27 (1H, dd, J=6,5; 16,0 Hz, H-7); 6,09 (1H, dt, J=2,0; 10,0 Hz, H-3); 5,10 (1H, ddd, J=1,0; 6,5; 15,5 Hz; H-6); 2,54 (2H, m, H5) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 163,8 (C-2); 144,5 (C-4); 135,8 (C9); 133,1 (C-8); 128,7 (C-11, C-13); 128,3 (C-12); 126,7 (C-10, C-14'); 125,7(C-7); 121,7(C-3); 77,9 (C-6); 29,9 (C-5) (+)-T-Cadinol (GM6): Chất dầu không màu; Rf = 0,50 (n-hexane-CH2Cl2 20/80, v/v) []D24 +8,3o (c 0,69; EtOH) (+)-ESI-MS: m/z 205 [M-H2O+H]+ (CTPT: C15H26O) FT-IR (film) νmax (cm1): 3457; 2928; 2872; 1637; 1458; 1370; 1100; 1010; 885; 724; 642; 566 H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 5,55 (1H, br s, H-5); 2,18 (1H, dquint, J=3,1; 7,0 Hz; H-11); 1,98 (2H, m, H-3); 1,96 (1H, m, H-6); 1,92 (1H, m, H-2ax); 1,74 (1H, dt, J=2,8; 2,8; 13,0 Hz; H-9ax); 1,66 (3H, s, CH3-15); 1,47 (1H, dq, J=3,0; 12,5 Hz; H-8ax); 1,41 (1H, m, H-9eq); 1,37 (1H, m, H-2eq); 1,34 (1H, m, H-8eq); 1,22 (3H, s, CH3-14); 1,07 (1H, ddd, J=2,0; 10,3; 12,3 Hz; H1); 1,01 (1H, m, H-7); 0,91 (3H, d, J=7,0 Hz; CH3-13); 0,79 (3H, d, J=7,0 Hz; CH3-12) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 134,4 (C-4); 122,7 (C-5); 70,7 (C10); 48,0 (C-1); 46,7 (C-7); 40,3 (C-9); 37,8 (C-6); 30,9 (C-3); 28,5 (C-14); 26,2 (C-11); 23,8 (C-15); 22,6 (C-2); 21,4 (C-13); 19,8 (C-8); 15,2 (C-12) α-Cadinol (GM7): Chất dầu không màu; Rf = 0,34 (n-hexane-CH2Cl2 20/80, v/v); []D27 10,0o (c 0,3; EtOH) FT-IR (film) νmax (cm1): 3392; 2933; 2876; 1654; 1457; 1378; 1122; 1037; 922; 819; 715; 614; 523 (+)-ESI-MS: m/z 205 [M-H2O+H]+ (CTPT: C15H26O) H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 5,50 (1H, br s, H-5); 2,16 (1H, td, J=3,0; 7,0 Hz; H-11); 1,99 (3H, m, H-3, H-2a); 1,81 (1H, dt, J=3,5; 12,5 Hz; H9a); 1,72 (1H, m, H-6); 1,67 (3H, s, CH3-15); 1,62 (1H, m, H-8a); 1,41 (1H, dt, J=4,0; 12,5 Hz; H-9b); 1,24 (3H, m, H-1, H-2b); 1,09 (3H, s, CH3-14); 1,06 (1H, dt, J=3,0; 11,0 Hz; H-7); 0,92 (3H, d, J=7,0 Hz; CH3-13); 0,77 (3H, d, J=7,0 Hz; CH3-12) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3): δ (ppm) 135,0 (C-4); 122,3 (C-5); 72,4 (C10); 50,0 (C-1); 46,7 (C-7); 42,2 (C-9); 39,9 (C-6); 31,0 (C-3); 26,0 (C-11); 23,8 (C-15); 22,7 (C-2); 22,0 (C-8); 21,5 (C-13); 20,8 (C-14); 15,1 (C-12) Aristolactam BII (GM8): Tinh thể hình kim màu vàng; đnc 248-250 oC; Rf = 0,38 (n-hexane-acetone 67/33, v/v) FT-IR (KBr) νmax (cm1): 3449, 3194, 2926, 2855, 1717, 1644, 1607, 1462, 1379, 1031, 838, 720, 624, 530, 466 UV maxMeOH nm (log ): 205 (3,59); 232 (3,56); 263 (3,49); 276 (3,54); 286 (3,53); 317 (2,97); 385 (2,94) (+)-ESI-MS: m/z 302 [M+Na]+; 581 [2M+Na]+ H-NMR (500 MHz, CDCl3+ CD3OD): δ (ppm) 9,12 (1H, m, H-5); 7,72 (1H, s, H-2); 7,72 (1H, m , H-8); 7,47 (2H, m, H-6, H-7); 7,00 (1H, s, H-9); 4,02 (3H, s, 4-OCH3); 3,98 (3H, s, 3-OCH3) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3+ CD3OD): δ (ppm) 170,2 (C=O); 154,4 (C3); 151,5 (C-4), 134,8 (C-8a), 134,2 (C-10), 128,9 (C-8), 127,4 (C-5), 127,4 (C7), 126,9 (C-5a), 125,8 (C-6), 124,2 (C-10a), 121,2 (C-1), 120,8 (C-4a), 109,5 (C-2), 106,2 (C-9), 60,2 (4-OCH3), 56,8 (3-OCH3) 3-Methyl-1H-benz[f]indole-4,9-dione (GM9): Chất rắn màu vàng; đnc 248-249 oC; Rf = 0,44 (n-hexane-CH2Cl2 25/75, v/v) ()-ESI-MS: m/z 210 [MH], (+)-ESI-MS: m/z 212 [M+H]+; (+)-HR-ESI-MS m/z 212,0710 [M+H]+ tương ứng với CTPT C13H9NO2 (theo tính tốn lý thuyết [M+H]+ có m/z 212,0706) FT-IR (KBr) νmax (cm1): 3429, 3322, 2938, 1647, 1588, 1507, 1403, 1238, 1031, 932, 714 UV (MeOH) max nm (log ): 258 (4,07); 330 (3,32) H-NMR (500 MHz, CDCl3+ CD3OD): δ (ppm) 8,08 (1H, m, H-5); 8,01 (1H, m, H-8); 7,59 (2H, m, H-6, H-7); 6,83 (1H, m, H-2); 2,34 (3H, s, CH3-10) H-NMR (500 MHz, DMSO): δ (ppm) 12,65 (1H, br s, H-1); 8,18 (2H, m, H-5, H-8); 7,76 (2H, m, H-6, H-7); 7,13 (1H, m, H-2); 2,31 (3H, s, CH3-10) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3+ CD3OD): δ (ppm) 182,3 (C-9); 175,7 (C-4); 134,5 (C-8a); 133,4 (C-4a); 133,2 (C-6, C-7); 132,7 (C-9a); 126,5 (C-5); 126,0 (C-8); 125,5 (C-2); 125,1 (C-3a); 122,8 (C-3); 11,0 (CH3-10) Acid nonacosanoic (GM10): 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δ (ppm) 2,34 (2H, t, J=7,5 Hz, CH2-2); 1,62 (2H, quint, J=7,5 Hz, CH2-3); 1,26 (50H, m, 25 x CH2); 0,88 (3H, t, J=7,5 Hz, CH3) 3.1.2 Quả Giác đế đài to Từ Giác đế đài to phân lập xác định cấu trúc hóa học 10 hợp chất gồm styryl-lactone 8-hydroxygoniofupyrone A (GM11), 4deoxycardiobutanolide (GM12), 7-acetylaltholactone (GM13); acetogenin annonacin (GM14), cis+trans-solamin (GM15), isoannonacin (GM16), transmurisolinone (GM17), hợp chất sesquiterpene β-caryophyllene oxide (GM18), hợp chất ceramide 2-(2’-hydroxytetracosanoylamino)octadecane1,3,4-triol (GM19) acid béo acid palmitic (GM20) Hình 3.4 Sơ đồ ngâm chiết Giác đế đài to Hình 3.5 Sơ đồ phân lập chất từ dịch chiết CH2Cl2 Giác đế đài to Dữ kiện phổ chất phân lập từ Giác đế đài to: 8-Hydroxygoniofupyrone A (GM11): Tinh thể không màu (MeOH); đnc 210,3-211,0oC; Rf = 0,50 (n-hexane/EtOAc 20/80, v/v); []D20 38,5o (c 0,32; EtOH) FT-IR (KBr) νmax (cm1): 3445, 2945, 1728, 1661, 1441, 1371, 1210, 1029, 862, 704, 619, 488 UV maxMeOH nm (log ): 206 (4,01); 257 (2,30) ()ESI-MS: m/z 249 [M-H], HR-ESI-MS: m/z 273,0724 [M+Na]+ tương ứng với CTPT C13H14O5 (theo tính tốn lý thuyết [M+Na]+ có m/z 273,0733) 1HNMR (500 MHz, acetone d6) 13C-NMR (125 MHz, acetone d6) (Bảng 4.1) 4-Deoxycardiobutanolide (GM12): Chất dầu không màu; Rf = 0,53 (nhexane-acetone 45/55, v/v); []D20 3,4o (c 0,44; CHCl3) FT-IR (film) νmax (cm1): 3378, 2926, 1754, 1634, 1414, 1194, 1046, 925, 702, 603, 491 UV maxMeOH nm (log ): 207 (4,25); 257 (2,66) ()-ESI-MS: m/z 251 [M-H], HRESI-MS: m/z 275,0895 [M+Na]+ tương ứng với CTPT C13H16O5 (theo tính tốn lý thuyết [M+Na]+ có m/z 275,0890) 10 3.2.2 Lá Giác đế cuống dài Từ Giác đế cuống dài phân lập xác định cấu trúc hợp chất, có hợp chất benzopyran-sesquiterpene gracilipin B (GG13), gracilipin C (GG14), gracilipin D (GG15) hợp chất biết squalene (GG16), benzyl benzoate (GG17), acid benzoic (GG18) Hình 3.8 Sơ đồ ngâm, chiết phân bố Giác đế cuống dài Hình 3.9 Sơ đồ phân lập chất từ Giác đế cuống dài 18 Dữ kiện phổ chất phân lập từ Giác đế cuống dài: Gracilipin B (GG13): Tinh thể không màu, đnc 189-190oC; Rf = 0,69 (nhexane/EtOAc 97/3, v/v) []D27 +30,6o (c 0,17; EtOH) FT-IR (KBr) νmax (cm1): 3488, 2990, 2934, 1610, 1583, 1489, 1373, 1247, 1190, 1061, 958, 756, 610, 549, 489 UV (EtOH) max nm (log ): 204 (4,53); 219 (4,31); 277 (3,85) HR-ESI-MS: m/z 417,2793 [M+H]+ tương ứng với CTPT C29H36O2 (theo tính tốn lý thuyết [M+H]+ có m/z 417,2788) H-NMR (500 MHz, CDCl3) 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) (Bảng 4.5.) Gracilipin C (GG14): Chất dầu không màu; Rf = 0,47 (n-hexane 100%) 25 []D 42,9o (c 0,275; EtOH) FT-IR (KBr) νmax (cm1): 3450, 3133, 2936, 1645, 1554, 1487, 1383, 1194, 1067, 997, 829, 759, 645, 541, 477 UV (EtOH) max nm (log ): 205 (4,24); 226 (3,79); 277 (3,31) ()-ESI-MS: m/z 309[MH], (+)-ESI-MS: m/z 311[M+H]+ HR-ESI-MS: m/z 311,2374 [M+H]+ tương ứng với CTPT C22H30O (theo tính tốn lý thuyết [M+H]+ có m/z 311,2369) H-NMR (500 MHz, CDCl3) 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) (Bảng 4.5.) Gracilipin D (GG15): Chất dầu không màu; Rf = 0,78 (n-Hexane 100%) 25 []D 3,8o (c 0,4; EtOH) FT-IR (KBr) νmax (cm1): 2959, 1586, 1489, 1455, 1239, 1114, 1017, 823, 757, 628, 547, 482 UV (EtOH) max nm (log ): 204 (4,32); 221 (3,89); 277 (3,38) HR-ESI-MS: m/z 311,2385[M+H]+ tương ứng với CTPT C22H31O (theo tính tốn lý thuyết [M+H]+ có m/z 311,2369) H-NMR (500 MHz, CDCl3) 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) (Bảng 4.5.) Squalene (GG16): Chất lỏng không màu, Rf = 0,78 (n-Hexane 100%) FTIR (KBr) νmax (cm 1): 3464, 2928, 1720, 1658, 1571, 1452, 1377, 1075, 928, 810, 688, 627, 516 UV (EtOH) max nm (log ): 204 (4,41) (+)-ESI-MS: m/z 411 [M+H]+ (CTPT: C30H50) H-NMR (500 MHz, CDCl3)  (ppm): 5,08-5,15 (6H, m, H-3, H-7, H-11, H-14, H-18, H-22); 1,96-2,10 (20H, m, CH2-4, CH2-5, CH2-8, CH2-9, CH2-12, CH2-13, CH2-16, CH2-17, CH2-20, CH2-21); 1,68 (6H, s, CH3-25, CH3-30); 1,60 (18H, s, CH3-1, CH3-24, CH3-26, CH3-27, CH3-28, CH3-29) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3)  (ppm): 135,1 (C-6, C-19); 134,9 (C-10, C15); 131,3 (C-2, C-23); 124,4 (C-3, C-22); 124,33 (C-7, C-18); 124,30 (C-11, C-14); 39,8 (C-5, C-20); 39,7 (C-9, C-16); 28,3 (C-12, C-13); 26,8 (C-4, C-21); 26,7 (C-8, C-17); 25,7 (C-1, C-24); 17,7 (C-25, C-30); 16,1 (C-26, C-29); 16,0 (C-27, C-28) Benzyl benzoate (GG17): Chất lỏng không màu, mùi thơm nhẹ ; Rf = 0,44 (n-hexane-CH2Cl2 75/25, v/v) FT-IR (KBr) νmax (cm 1): 3471, 3234, 3074, 2935, 1721, 1649, 1591, 1457, 1269, 1107, 1036, 956, 808, 717, 637, 585, 514 UV (EtOH) max nm (log ): 206 (4,12); 230 (4,17); 272 (2,97) (+)-ESI-MS: m/z 235 [M+Na]+ H-NMR (500 MHz, CDCl3)  (ppm): 8,10 (2H, br d, J = 8,0 Hz, H-2, H6); 7,35- 7,59 (8H, m, H-3H-5, H-2’H-6’); 5,39 (2H, s, CH2) 19 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3)  (ppm): 166,4 (C=O); 136,1 (C-1’); 133,0 (C-4); 130,1 (C-1); 129,7 (C-2, C-6); 128,6 (C-3, C-5); 128,4 (C-4’); 128,1 (C2’, C-6’); 66,7 (OCH2) Acid benzoic (GG18): Tinh thể hình kim khơng màu, đnc 122-123 oC; Rf = 0,34 (n-hexane-EtOAc 70/30, v/v) FT-IR (KBr) νmax (cm 1): 3060-2565, 1682, 1577, 1423, 1291, 1186, 1054, 935, 803, 714, 652, 543, 466 UV (EtOH) max nm (log ): 228 (4,10); 272 (2,96) ()-ESI-MS: m/z 121 [M-H]; (+)ESIMS: m/z 123 [M+H]+ (CTPT: C7H6O2) H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 8,14 (2H, dd, J=1,0; 8,0 Hz, H-2, H6); 7,62 (1H, t, J=8,0 Hz, H-4); 7,49 (2H, t, J=8,0 Hz, H-3, H-5) 13 C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ (ppm): 172,3 (C=O); 133,8 (C-4); 130,2 (C-2, C-6); 129,4 (C-1); 128,5 (C-3, C-5) 3.3 Hoạt tính gây độc tế bào hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chất phân lập Kết thử hoạt tính gây độc tế bào hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định trình bày phần 4.3 CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Các hợp chất phân lập từ Giác đế đài to 4.1.1 Từ vỏ Giác đế đài to Từ cặn dịch chiết CH2Cl2 MeOH vỏ Giác đế đài to (Goniothalamus macrocalyx Ban) sau tiến hành kết tinh, sắc kí cột nhiều lần cột sephadex silica gel thu 10 hợp chất GM1-GM10 gồm styryl-lactone, sesquiterpene, alkaloid acid béo (Hình 4.1.) Hình 4.1 Cấu trúc hợp chất phân lập từ vỏ Giác đế đài to Cấu trúc hợp chất xác định phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1, chiều, phổ khối lượng, phổ hồng ngoại phổ tử ngoạikhả kiến Dữ kiện phổ chất GM1-GM10 trình bày Chương (trang 6-9) 20 4.1.2 Từ Giác đế đài to Từ cặn dịch chiết CH2Cl2 Giác đế đài to (Goniothalamus macrocalyx Ban) sau tiến hành kết tinh, sắc kí cột nhiều lần cột sephadex silica gel thu 10 hợp chất GM11-GM20 gồm hợp chất styryl-lactone, hợp chất acetogenin, hợp chất sesquiterpene, hợp chất ceramide acid béo (Hình 4.2.) Hình 4.2 Cấu trúc hợp chất phân lập từ Giác đế đài to Dữ kiện phổ chất GM11-GM20 trình bày Chương (trang 10-13) Trong số hợp chất phân lập từ Giác đế đài to có hợp chất 8-hydroxygoniofupyrone A (GM11) 21 Bảng 4.1 Dữ kiện phổ 13C-, 1H-NMR (125/500 MHz, Acetone-d6) GM11 C ppm 81,5 168,7 40,4 77,9 86,0 74,3 Vị trí H ppm, mult (J, Hz) 4,72 dd (2,0; 4,0 Hz) 2,82 dd (2,5; 18,5 Hz) 2,74 dd (3,0; 18,5 Hz) 4,17 ddd (2,5; 2,5; 4,0 Hz) 4,34 dd (2,5; 9,0 Hz) 4,54 dd (2,0; 4,0 Hz) 10 11,15 C H ppm ppm, mult (J, Hz) 72,5 4,66 dd (4,5; 9,0 Hz) 143,9 128,0 7,46 d (7,5 Hz) 12,14 128,9 7,33 dd (7,5; 7,5 Hz) 13 8-OH 9-OH 128,2 7,26 m 4,91 d (4,0 Hz) 4,70 d (4,5 Hz) Vị trí Cấu trúc GM11 khẳng định phương pháp đo nhiễu xạ tia X (Hình 4.3.) Hình 4.3 Cấu trúc không gian qua nhiễu xạ tia X hợp chất GM11 Hợp chất 4-deoxycardiobutanolide (GM12) hợp chất lần phân lập từ tự nhiên Bảng 4.2 Dữ kiện phổ 13C-, 1H-NMR (125/500 MHz, CD3OD) GM12 Vị C H trí ppm ppm, mult, (J, Hz) - 180,1 29,5 2,59 m 2,30 dddd (4,5; 7,0; 9,5; 12,5 Hz) 25,3 2,04 dddd (8,5; 9,5; 9,5; 12,5 Hz) 84,3 4,71 ddd (7,0; 7,0; 8,5 Hz) 73,9 3,93 dd (2,3; 6,8 Hz) Vị trí C H ppm ppm, mult, (J, Hz) 74,6 3,66 dd (2,0; 8,0 Hz) 75,2 4,74 d (8,0 Hz) 144,0 - 10-14 128,4 7,44 m 11-13 129,1 7,36 m 12 128,5 7,28 m Các hợp chất acetogenin GM14-GM17 xác định cấu trúc phương pháp phổ khối lượng HPLC-Li-(+)ESI-LTQ/Orbitrap HPLC-Li(+)ESI/QTOF (Hình 4.4.) 22 Hình 4.4 Phân mảnh MS/MS GM14  GM17 4.2 Các hợp chất phân lập từ Giác đế cuống dài 4.2.1 Từ Giác đế cuống dài Từ cặn dịch chiết CH2Cl2 Giác đế cuống dài (Goniothalamus gracilipes Ban) sau tiến hành kết tinh, sắc kí cột nhiều lần cột sephadex silica gel thu 12 hợp chất GG1GG12 gồm linear acetogenin, hợp chất flavonoid hợp chất phenolic khác (Hình 4.5.) Dữ kiện phổ chất GG1GG12 trình bày Chương (trang 14-17) 23 Hình 4.5 Cấu trúc hợp chất phân lập từ Giác đế cuống dài Trong số hợp chất phân lập từ Giác đế cuống dài, gracilipin A (GG2) hợp chất linear acetogenin Bảng 4.3 Dữ kiện phổ 13C-, 1H-NMR (125/500 MHz, CDCl3) GG2 Vị trí C, ppm H , ppm, mult, (J, Hz) 179,7 39,6 2,69 (1H, m) 31,3 1,83 (1H, m); 1,46 (1H, m) 4-10 27,2-29,4 1,27-1,42 11 28,3 1,54 (2H, quint, J = 7,0 Hz) 12 19,6 2,32 (2H, t, J = 7,0 Hz) 13 85,0 14 71,9 15 65,2 16 78,5 17 108,6 5,49 (1H, d, J = 11,0 Hz) 18 146,6 6,03 (1H, dt, J = 7,5; 11,0 Hz) 19 29,9 2,43 (2H, q, J = 8,0 Hz) 20 32,8 2,17 (2H, m) 24 Vị trí C, ppm H , ppm, mult, (J, Hz) 21 22 23 24 25 137,6 115,2 29,6 78,5 64,6 5,81 (1H, ddt, J = 6,5; 10,5; 17,0 Hz) 5,04 (1H, ddt, J = 1,5; 1,5; 17,0 Hz); 4,99 (1H, dd, J =1,5; 10,0 Hz) 2,29 (1H, m); 2,00 (1H, ddd, J = 8,0; 8,0; 13,0 Hz) 4,59 (1H, m) 3,86 (1H, dd, J = 3,0; 12,0 Hz); 3,64 (1H, dd, J = 4,5; 12,0 Hz) Methylsaccopetrin A (GG3) hợp chất lần đầu phân lập từ thiên nhiên Bảng 4.4 Dữ kiện phổ 13C-, 1H-NMR (125/500 MHz, CDCl3) GG1, GG3 C, ppm GG3 GG1 179,6 179,8 39,3 39,6 31,2 31,3 4-10 27,3-29,5 27,2-29,6 11 27,3-29,5 27,2-29,6 12 18,8 18,7 13 80,3 80,3 14 80,2 80,2 15 18,8 18,7 16 27,3-29,5 27,2-29,6 17-19 27,3-29,5 27,2-29,6 20 33,7 33,7 21 139,1 139,1 Vị trí 22 114,2 23 30,5 24 25 76,8 74,3 OMe 59,5 H , ppm, mult, (J, Hz) GG3 GG1 2,68 (m) 2,69 (m) 1,84 (m); 1,42-1,50 (m) 1,83 (m); 1,42-1,49 (m) 1,27-1,40 (m) 1,26-1,41 (m) 1,50 (m) 1,49 (m) 2,13 (t, J=6,3 Hz) 2,12 (t, J=6,5 Hz) 2,13 (t, J=6,3 Hz) 2,12 (t, J=6,5 Hz) 1,50 (m) 1,49 (m) 1,27-1,40 (m) 1,26-1,41 (m) 2,04 (dt, J=7,0; 7,0 Hz) 2,01 (m) 5,81 (ddt, J=6,5; 10,5; 5,80 (ddt, J=6,5; 10,0; 17,0 Hz) 17,0 Hz) 114,1 4,99 (ddt, J=1,5; 2,0; 4,99 (ddt, J=1,5; 2,0; 17,0 Hz); 4,93 (d, J= 17,0 Hz); 4,92 (dd, 10,0 Hz) J=2,0; 10,5 Hz) 27,2-29,6 2,28 (ddd, J=3,8; 9,3; 2,29 (m) 2,00 (m) 13,0 Hz); 1,99 (ddd, J=8,5; 8,5; 12,5 Hz) 78,5 4,59 (m) 4,58 (m) 64,6 3,55 (dd, J=3,8; 10,8 3,85 (dd, J=3,0; 12,5 Hz) 3,49 (dd, J=4,0; Hz); 3,63 (dd, J=4,5; 10,5 Hz) 12,5 Hz) 3,38 (3H, s, OMe) - 4.2.2 Các hợp chất phân lập từ Giác đế cuống dài Từ cặn dịch chiết n-hexane Giác đế cuống dài (Goniothalamus gracilipes Ban), sau tiến hành kết tinh, sắc kí cột nhiều lần cột sephadex silica gel thu hợp chất kí hiệu GG13-GG18 gồm hợp 25 chất benzopyran-sesquiterpene gracilipin B (GG13), gracilipin C (GG14), gracilipin D (GG15); hợp chất triterpene squalene (GG16) hợp chất phenolic benzyl benzoate (GG17), acid benzoic (GG18) (Hình 4.6.) 4'' 3'' 15 6' 7' 5' O 4' 3' 2' 1' H H 5'' 2'' 6'' 1'' 3' 7'' 10 3' O H 4' H 14 11 1' 5' 7' 6' GG13 2' 15 O 12 H H GG14 13 H 7' 6' 12 12 GG15 13 26 25 5' O O H 14 10 11 H 13 6' 27 H 10 11 4' 14 15 1' 2' 4' O O OH 2' 10 14 30 29 28 18 22 6 GG16 GG17 4 GG18 Hình 4.6 Các hợp chất phân lập từ Giác đế cuống dài Cấu trúc hợp chất xác định phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1, chiều, phổ khối lượng, phổ hồng ngoại, phổ tử ngoạikhả kiến nhiễu xạ tia X Dữ kiện phổ chất GG13-GG18 trình bày Chương (trang 19-20) Bảng 4.5 Dữ kiện phổ 13C-, 1H-NMR (125/500 MHz, CDCl3) GG13-GG15 Vị trí GG13 C 32,2 27,5 36,1 78,3 35,0 29,0 27,7 17,0 38,5 10 11 12 13 14 80,8 16,7 16,6 29,9 20,0 H (J, Hz) 2,28; m 2,07; m 1,36; m 2,63; m 1,77; m 2,07; m 0,37; m 0,65; m 1,86; m 1,20; m 2,20 m 1,86; m 1,00; s 1,10; s 1,14; s GG14 C H (J, Hz) 127,6 5,22; dd (4,0; 10,5) 23,2 2,32; m 2,00; m 39,3 1,85; m 1,59; m 36,8 80,0 3,53; d (6,5) 26,8 0,78; dd (7,5; 8,0) 30,7 0,52; m 22,6 1,85; m 1,08; m 38,2 2,07; m 2,00; m 131,2 18,9 18,5 1,16; s 30,5 1,18; s 17,7 1,61; s 26 GG15 C 51,8 17,1 H (J, Hz) 2,35; m 1,65; m 35,7 1,69; m 39,1 87,5 27,7 30,0 24,7 0,59; d (10,0) 0,76; m 1,96; m 1,44; m 1,55; m 1,44; m 1,88; m 1,32; s 1,07; s 0,84; d (7,0) 32,8 34,2 21,4 17,4 30,8 22,3 Vị trí GG14 GG13 C 15 22,9 1’ 29,0 H (J, Hz) 1,24; s 2,70; d (9,0) C 21,4 37,7 2’ 3’ 4’ 5’ 6’ 7’ 1” 122,1 129,3 119,6 127,1 117,0 153,9 31,6 122,3 129,9 119,8 126,5 116,2 155,0 2” 3” 4” 5” 6” 7” 121,9 128,9 119,4 127,0 116,9 153,8 7,02; m 6,82; m 7,08; m 6,82; m 2,63; m 2,49; m 6,97; m 6,75; m 7,02; m 6,75; m - H (J, Hz) 0,97; s 3,20; d (16,0) 2,17; d (16,0) 7,06; m 6,83; m 7,06; m 6,73; m - GG15 C 22,4 38,9 120,3 129,8 119,1 127,0 116,1 153,0 H (J, Hz) 1,04; s 2,90; d (16,5) 2,47; d (16,5) 7,00; br d (7,5) 6,80; m 7,08; m 6,80; m - Hình 4.7 Cấu trúc nhiễu xạ tia X hợp chất GG13 4.3 Hoạt tính sinh học hợp chất phân lập 4.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào chất phân lập Cặn dịch chiết CH2Cl2 (GMED) phân đoạn nhỏ tương ứng GMEDF1-GMEDF9 vỏ Giác đế đài to thử hoạt tính gây độc tế bào sơ dịng tế bào ung thư biểu mơ KB, tế bào phổi nguyên bào sợi người MRC-5 Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên-Cộng hịa Pháp Kết trình bày Bảng 4.6 27 Bảng 4.6 Hoạt tính gây độc tế bào dịch chiết CH2Cl2 vỏ Giác đế đài to TT 10 KB Kí hiệu mẫu GMED GMEDF1 GMEDF2 GMEDF3 GMEDF4 GMEDF5 GMEDF6 GMEDF7 GMEDF8 GMEDF9 10µg/mL1 21 36 42 26 % Ức chế tương ứng nồng độ thử MRC-5 1 1 1µg/mL 10µg/mL 1µg/mL1 27 10 36 49 18 37 2 0 11 Kết cho thấy dịch chiết CH2Cl2 vỏ Giác đế đài to phân đoạn nhỏ hoạt tính gây độc tế bào có hoạt tính gây độc tế bào yếu dòng tế bào ung thư biểu mô KB, tế bào phổi nguyên bào sợi người MRC-5 nồng độ thử Kết thử hoạt tính gây độc tế bào cặn dịch chiết MeOH vỏ Giác đế đài to (GMEM) phân đoạn nhỏ GMEMF1-GMEMF10; cặn dịch chiết CH2Cl2 (GMFrD) phân đoạn nhỏ tương ứng GMFrDF1- GMFrDF9; cặn dịch chiết MeOH (GMFrM) phân đoạn nhỏ GMFrMF1-GMFrMF7 Giác đế đài to dòng tế bào KB trình bày Bảng 4.7 Bảng 4.7 Hoạt tính gây độc tế bào KB dịch chiết MeOH phần vỏ dịch chiết CH2Cl2 phần Giác đế đài to TT 10 11 Kí hiệu mẫu GMEM GMEMF1 GMEMF2 GMEMF3 GMEMF4 GMEMF5 GMEMF6 GMEMF7 GMEMF8 GMEMF9 GMEMF10 % Ức chế nồng độ 10 µg/mL1 92 100 100 100 94 0 16 59 TT 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Kí hiệu mẫu GMFrD GMFrDF1 GMFrDF2 GMFrDF3 GMFrDF4 GMFrDF5 GMFrDF6 GMFrDF7 GMFrDF8 GMFrDF9 % Ức chế nồng độ 10 µg/mL1 96 74 89 100 100 54 97 54 Kết cho thấy phân đoạn nhỏ GMEMF2-F6 cặn dịch chiết MeOH vỏ Giác đế đài to; dịch chiết CH2Cl2 Giác đế đài to GMFrD phân đoạn nhỏ tương ứng GMFrDF2, F4-F6, F-8 thể hoạt tính mạnh ức chế dịng tế bào KB nồng độ thử 10 µg/mL1 28 Một số hợp chất phân lập từ vỏ Giác đế đài to, từ Giác đế cuống dài thử hoạt tính gây độc tế bào dòng tế bào ung thư KB, HepG2 (ung thư gan), Lu-1 (ung thư phổi), MCF7 (ung thư vú) Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Viện Hóa học hợp chất thiên nhiên-Cộng hịa Pháp (Bảng 4.8.) Bảng 4.8 Hoạt tính gây độc tế bào hợp chất từ Giác đế đài to Giác đế cuống dài STT Ký hiệu chất GM1(**) GM2 GM3 GM4 GM5 GM6 GM7 GM8 GM10 10 GM11 11 GM12 12 GM13 13 GM14(*) 14 GM15(*) 15 GM16(*) 16 GM17(*) 17 GG1 18 GG2 19 GG3 20 GG13(*) 21 GG14(*) Ellipticin Nồng độ ức chế 50% phát triển tế bào ung thư IC50 (µg/mL) KB HepG2 Lu-1 MCF7 5,70 7,85 9,25 24,14 >40 >40 >40 >40 >40 >40 >40 >40 >40 >40 >40 >40 4,18 8,62 8,04 13,31 >40 >40 >40 >40 5,23 >40 >40 >40 >40 >40 >40 >40 >40 >40 >40 >40 >40 >40 >40 >40 >40 3,60 6,54 7,27 16,55 3,50 >9 >9 >9 4,70 4,40 110,54 nd 18,5 0,62-1,25 (*) Thử nghiệm Viện Hóa học Hợp chất thiên nhiên – Cộng hịa Pháp; (-) Khơng thử nghiệm nd: Khơng xác định (**) % Ức chế tế bào MRC-5 58%, 12% nồng độ 10; µg/mL tương ứng - Hợp chất styryl-lactone goniothalamin (GM5), altholactone (GM1); 7acetylaltholactone (GM13) thể hoạt tính dịng tế bào KB, HepG2, Lu-1 Trong 7-acetylaltholactone (GM13) có hoạt tính mạnh dịng tế bào KB (IC50 = 3,60 µg/mL) mạnh altholactone (GM1) dòng tế bào thử nghiệm Hợp chất acetogenin annonacin (GM14) thể hoạt tính mạnh dịng tế bào KB (IC50 = 3,50 µg/mL) Hợp chất sesquiterpene -Cadinol (GM7) có hoạt tính trung bình dịng tế bào KB với giá trị IC50 = 5,23 g/mL; epimer (+)-T-Cadinol (GM6) khơng thể hoạt tính gây độc tế bào thể hoạt tính yếu chủng Gram (+) Bacillus subtilis 29 - Hợp chất linear-acetogenin gracilipin A (GG2) saccopetrin A (GG1) thể hoạt tính ức chế phát triển dòng tế bào KB tốt với giá trị IC50 = 4,40; 4,70 g/mL tương ứng Hợp chất benzopyran-sesquiterpene Gracilipin C (GG14) thể hoạt tính yếu dịng tế bào KB chủng Gram (+) Staphylococus aureus - Altholactone (GM1) thể hoạt tính gây độc tế bào phân lập từ phân đoạn nhỏ F5 (GMEDF5) dịch chiết CH2Cl2 vỏ Giác đế đài to phù hợp với kết phân đoạn F5 thể hoạt tính gây độc tế bào trội hẳn phân đoạn nhỏ khác Goniothalamin (GM5) thể hoạt tính mạnh dịng tế bào KB phân lập từ phân đoạn nhỏ có hoạt tính F3 (GMEMF3) từ dịch chiết MeOH vỏ Giác đế đài to Tương tự hợp chất 7-Acetylaltholactone (GM13) Annonacin (GM14) có hoạt tính mạnh dòng tế bào KB phân lập từ phân đoạn nhỏ F4, F8 có hoạt tính dịch chiết CH2Cl2 Giác đế đài to 4.3.2 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chất phân lập Các hợp chất styryl-lactone, sesquiterpene số hợp chất phân lập từ Giác đế đài to Giác đế cuống dài thử nghiệm hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định Kết trình bày Bảng 4.9 Bảng 4.9 Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định hợp chất từ Giác đế đài to Giác đế cuống dài Nồng độ ức chế 50% phát triển vi sinh vật kiểm định, IC50 (µg/mL) Gram (+) Nấm Gram () S Ký hiệu TT chất Staphylococcus Bacillus Lactobacillus Salmonella Escherichia Pseudomonas Candida aureus 10 11 12 13 GM1 GM2 GM3 GM4 GM5 GM6 GM8 GM10 GM11 GM12 GM13 GG13 GG14 14 GG15 Ampicillin Streptomycin subtilis fermentum enterica coli aeruginosa albican >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >128 20,00 32,00(*) >128 0,0015 >64 >64 >64 >64 >64 43,42 >64 >64 >64 >64 >64 >128 >128 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >128 >128 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >128 >128 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >128 >128 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >128 >128 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >64 >128 >128 >128 0,0078 >128 1,11 >128 0,138 >128 >128 >128 0,186 15,56 Amphotericin B (*) Giá trị MIC (µg/mL) 0,263 30 Kết cho thấy hợp chất sesquiterpene (+)-T-Cadinol (GM6) thể hoạt tính yếu chủng Gram (+) Bacillus subtilis với giá trị IC50 = 43,42 g/mL hợp chất benzopyran-sesquiterpene Gracilipin C (GG14) có hoạt tính trung bình chủng Gram (+) Staphylococcus aureus với giá trị IC50 = 20,00 g/mL (MIC = 32,00 g/mL) KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Hai loài Goniothalamus họ Na: Giác đế đài to (Goniothalamus macrocalyx Ban) Giác đế cuống dài (Goniothalamus gracilipes Ban) Việt Nam lần đầu nghiên cứu cách có hệ thống thành phần hóa học hoạt tính sinh học: (1) Về thành phần hóa học lồi Giác đế đài to (G macrocalyx Ban):  Từ vỏ Giác đế đài to phân lập xác định cấu trúc 10 hợp chất gồm styryl-lactone: altholactone (GM1), goniopypyrone (GM2), goniofufurone (GM3), cardiobutanolide (GM4), goniothalamin (GM5); sesquiterpene (+)-T-cadinol (GM6), α-cadinol (GM7); alkaloid aristolactam BII (GM8), 3-methyl-1H-benz[f]indole-4,9-dione (GM9) acid nonacosanoic (GM10)  Từ Giác đế đài to phân lập xác định cấu trúc 10 hợp chất gồm hợp chất styryl-lactone: 8-hydroxygoniofupyrone A (GM11), 4deoxycardiobutanolide (GM12), 7-acetylaltholactone (GM13); hợp chất acetogenin annonacin (GM14), cis+trans-solamin (GM15), isoannonacin (GM16), trans-murisolinone (GM17); hợp chất sesquiterpene βcaryophyllene oxide (GM18), hợp chất ceramide 2-(2’hydroxytetracosanoylamino)octadecane-1,3,4-triol (GM19) acid palmitic (GM20) Trong hợp chất 8-hydroxygoniofupyrone A (GM11) furano-pyrone Hợp chất 4-deoxycardiobutanolide (GM12) lần phân lập từ tự nhiên, hợp chất annonacin (GM14), cis+trans-solamin (GM15), isoannonacin (GM16), trans-murisolinone (GM17) xác định cấu trúc phương pháp phổ khối lượng (HPLC-Li-(+)ESI-LTQ/Orbitrap HPLC-Li-(+)ESI/QTOF) (2) Về thành phần hóa học loài Giác đế cuống dài (G gracilipes Ban):  Từ Giác đế cuống dài phân lập xác định cấu trúc 12 hợp chất gồm linear acetogenin saccopetrin A (GG1), gracilipin A (GG2), methylsaccopetrin A (GG3); hợp chất flavonoid 7,3’,4’-trimethylquercetin (GG4), rhamnazin (GG5), casticin (GG6), isokanugin (GG7), melisimplexin (GG8), 5-hydroxy-3,7-dimethoxy-3’,4’-methylenedioxyflavone (GG9) hợp chất khác 1-phenylpropan-1,2-diol (GG10), acid vanillic (GG11), phenylmethanol (GG12) Trong gracilipin A (GG2) hợp chất methylsaccopetrin A (GG3) hợp chất lần phân lập từ tự nhiên  Từ Giác đế cuống dài phân lập xác định cấu trúc hợp chất gồm hợp chất benzopyran-sesquiterpene gracilipin B (GG13), gracilipin C (GG14), gracilipin D (GG15); hợp chất triterpene squalene (GG16) 31 hợp chất khác benzyl benzoate (GG17), acid benzoic (GG18) Trong hợp chất gracilipin B (GG13), gracilipin C (GG14), gracilipin D (GG15) hợp chất (3) Về hoạt tính sinh học hợp chất phân lập:  Hợp chất styryl-lactone goniothalamin (GM5), altholactone (GM1); 7acetylaltholactone (GM13) thể hoạt tính dịng tế bào ung thư KB, HepG2, Lu-1 Trong 7-acetylaltholactone (GM13) có hoạt tính mạnh dịng tế bào KB (IC50 = 3,60 µg/mL) mạnh altholactone (GM1) dòng tế bào thử nghiệm Hợp chất acetogenin annonacin (GM14) thể hoạt tính mạnh dịng tế bào KB (IC50 = 3,50 µg/mL) Hợp chất sesquiterpene -Cadinol (GM7) có hoạt tính trung bình dịng tế bào KB với giá trị IC50 = 5,23 g/mL; epimer (+)-T-Cadinol (GM6) khơng thể hoạt tính gây độc tế bào thể hoạt tính yếu chủng Gram (+) Bacillus subtilis  Hợp chất linear-acetogenin gracilipin A (GG2) saccopetrin A (GG1) thể hoạt tính ức chế phát triển dịng tế bào KB tốt với giá trị IC50 = 4,40; 4,70 g/mL tương ứng Hợp chất benzopyran-sesquiterpene Gracilipin C (GG14) thể hoạt tính yếu dịng tế bào KB chủng Gram (+) Staphylococcus aureus Kết luận chung: Các kết Luận án làm rõ mục tiêu đề đề tài xác định thành phần hóa học lồi Goniothalamus họ Na hoạt tính sinh học chúng Trong tổng số 38 chất phân lập xác định cấu trúc tìm hợp chất hợp chất lần đầu phân lập từ tự nhiên; hợp chất thể hoạt tính chống ung thư hợp chất có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định chủng Gram (+) Các lớp chất phân lập từ hai lồi Goniothalamus phù hợp với thành phần hóa học lồi thuộc chi Goniothalamus cơng bố KIẾN NGHỊ: - Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học, hoạt tính chống ung thư phận cịn lại hai loài Goniothalamus loài Goniothalamus khác nhằm tìm kiếm hợp chất có hoạt tính chống ung thư hoạt tính sinh học khác từ loài thuộc chi Goniothalamus Việt Nam - Tổng hợp toàn phần, bán tổng hợp hợp chất styryl-lactone, acetogenin, benzopyran-sesquiterpene từ hai loài Goniothalamus nhằm làm sáng tỏ đường sinh tổng hợp hợp chất tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học tốt 32 ... Giác đế (Goniothalamus) , đặc điểm thực vật lài Giác đế đài to (Goniothalamus macrocalyx Ban) Giác đế cuống dài (Goniothalamus gracilipes Ban) Các nghiên cứu nước giới hóa học hoạt tính sinh học. .. thành phần hóa học hoạt tính sinh học: (1) Về thành phần hóa học lồi Giác đế đài to (G macrocalyx Ban):  Từ vỏ Giác đế đài to phân lập xác định cấu trúc 10 hợp chất gồm styryl-lactone: altholactone... (Goniothalamus macrocalyx Ban) Giác đế cuống dài (Goniothalamus gracilipes Ban) Việt Nam lần đầu nghiên cứu cách có hệ thống thành phần hóa học hoạt tính sinh học:  Từ Giác đế đài to phân lập hợp chất