Glucose Axit fotfoenol pyruvic Eritrozo-4- P Axit skimic Axit corismic Axit antranilic Triptophan Axit prephenic Axit phenylpyruvic Axit hydroxyphenylpyruvic Phenylalanine Tirozin Sơ ñ 5: Cơ ch t ng h p triptophan, phenilalanin, tirozin t bào vi sinh v t ð t ng h p th a triptophan ngư i ta dùng ch ng e coli tr dư ng tirozin phenylalanine CHƯƠNG V: S N XU T CH PH M ENZYM 5.1 Nh ng tính ch t ưu vi t c a enzyme Enzym m t ch t xúc tác sinh h c Nó có đ y đ tính ch t c a ch t xúc tác hố h c, ngồi cịn có nh ng ưu vi t sau: Có tính chun hố cao (tính ñ c hi u): m i enzyme ch tác d ng lên m t ch t nh t ñ nh theo ý mu n mà khơng gây nên m t bi n đ i khác Ví d : amylaza ch thu phân tinh b t, proteaza ch thu phân protein.v.v Cư ng l c xúc tác l n: v i m t lư ng nh enzyme có th làm xúc tác đ chuy n hố m t lư ng ch t l n Ví d : 1g pepxin có kh thu phân 50kg tr ng, 1g rennin có th làm đơng t 72 t n s a, 1mol catalaza có th làm chuy n hoá 5x106mol H2O2 giây Tác d ng m t ñi u ki n êm d u: ph n l n enzyme ho t ñ ng nhi t đ khơng cao, pH thư ng trung tính áp su t thư ng Enzym khơng đ c h i: t t c lo i enzyme đ u có ngu n g c t sinh v t nên khơng đ c h i đ i v i s c kh e ngư i Chính nh ng ưu vi t mà nh ng năm g n ñây ch ph m enzyme ñư c s d ng r ng rãi ngành cơng nghi p enzyme đư c phát tri n khơng ng ng 5.2 Ngu n ngun li u đ thu nh n enzyme: Enzyme có th thu nh n t nhi u ngu n nguyên li u khác như: ñ ng v t, th c v t vi sinh v t 5.2.1 ð ng v t: Enzyme n m quan n i t ng c a ñ ng v t: - Tu t ng: ch a nhi u enzyme amylaza, maltaza, proteaza, esteraza, lipaza.v.v - D dày ch a nhi u enzyme pepxin, enzyme tiêu hoá (trong ngăn th tư c a d dày bị có lo i vi khu n có kh sinh t ng h p xenlulaza), d dày c a bê nghé có ch a enzyme rennin làm đơng t s a - Ru t: ch a ch y u enzyme enterokinaza có kh phá v liên k t peptit - Gan: quan ch a r t nhi u enzyme Không th thu enzyme t ñ ng v t qui mơ cơng nghi p đư c th i gian ni đ ng v t q dài nên khơng kinh t 5.2.2 Th c v t: Ngư i ta có th thu đư c m t s enzyme th c v t thư ng ñ ng thu papain t ñu ñ , bromelain t d a, amylaza t malt, plazmin (c papain) t h ficus (sung, v ) Trong h đ u có enzyme ureaza Trong thu c có ch a enzyme amylaza, esteraza, pectinaza, proteaza Trong chè có ch a nhi u enzyme oxy hoá kh polyphenoloxydaza Trong rau qu ch a nhi u lo i enzyme khác Thu enzyme t th c v t khơng kinh t mu n có nhi u th c v t ph i tr ng nên ph i có đ t chi phí t n vi c chăm bón 5.2.3 Vi sinh v t: So v i ñ ng v t th c v t vi c thu nh n enzyme t vi sinh v t có nhi u l i th - T vi sinh v t có th thu nh n đư c nhi u enzyme khác nhau, có nh ng lo i khơng th thu nh n đư c t đ ng v t ho c th c v t - B ng cách thay ñ i ñi u ki n ni c y ho c dùng tác nhân u ch nh ngư i ta có th u n trình sinh t ng h p enzyme c a vi sinh v t theo ý mu n - Vi sinh v t có kh sinh s n phát tri n nhanh, t ng h p enzyme v i t c ñ c c kỳ l n m t th i gian ng n Chính th vi c s n xu t enzyme t vi sinh v t t n th i gian - Enzyme thu nh n t vi sinh v t có ho t tính r t m nh, vư t xa enzyme t ngu n sinh v t khác - Vi sinh v t có kh sinh s n, phát tri n t ng h p enzyme mơi trư ng dinh dư ng đơn gi n, d ki m r ti n (có th ph li u c a ngành s n xu t khác nhau) Cho nên vi c s n xu t enzyme t vi sinh v t r t kinh t Chính l i th nên ngu n enzyme t vi sinh v t có th đưa vào ngành s n xu t ch ph m enzyme công nghi p B ng 1: Kh s d ng lo i enzyme t vi sinh v t Lo i enzyme Vi sinh v t S d ng Amylaza Bacillus Subtilis, Bacillus Bia rư u (phân hu tinh b t Stearotherophilus thành ñư ng lên men, s n xu t nha) Asp.niger S n xu t bánh mì, bánh ng t α-amylaza Asp.oryzac (thu phân m t ph n tinh b t) Glucoamylaza Asp.niger S n xu t glucoza, bia (làm Asp.oryzac gi m hàm lư ng dextrin) Endomycopsis bispora Pectnaza Asp.niger S n xu t làm d ch qu , Asp.oryzac ch ph m rau cho dinh Sclerotinia libertina dư ng tr sơ sinh Các xenluloza Trichoderma viride CN th c ph m (làm tan thành t bào th c v t rau), rư u (thu nh n ñư ng t xenluloza) ðextranaza Penicillium funiculorum S n xu t dexran v i kích thư c phân t nh t đ nh Ch t b sung cho thu c ñánh Invectaza Sacch.Cerevisiac D ch hố đư ng đ làm keo, s n xu t m t ong nhân t o Các proteaza Bacil.Subtilis, Bacil.Cereus B sung vào b t gi t ñ lo i Bacil.Stearotheroopilus, protein, làm m m th t, ch t tr Streptomyces griseus, tiêu hoá, dùng cơng ngh Asp.oryzac làm phim Enzym làm đơng Mucor pusillus S n xu t fomat s a Keratinaza Streptomyces fradiac Ngành da (kh lông) B o qu n th c ph m (lo i O2) β-galactozidaza Asp.niger, Pen.notatum Xác ñ nh glucoza (ch n đốn b nh đái đư ng) Streptokinaza Streptococcus, ði u tr (tiêu c c ngh n) Spec.chotridium ði u tr v t thương, v t histolyticum b ng L-asparaginaza Eschericha coli, Erivinia ði u tr b nh b ch c u aroidac Penixilinazylaza Escherichia coli SX penixilin bán t ng h p 5.3 S n xu t enzym t vi sinh v t: Quá trình s n xu t g m giai đo n: - Tuy n ch n vi sinh v t c i t o gi ng - Nuôi c y vi sinh v t - Tách tinh ch enzym 5.3.1 Tuy n ch n vi sinh v t c i t o gi ng: Tuy n ch n: Kh t o enzym c a vi sinh v t r t ña d ng phong phú M i lo i enzym có th thu nh n ñư c t nhi u ch ng vi sinh v t khác ngư c l i m t ch ng vi sinh v t có kh sinh nhi u lo i enzym Ví d : Aspergillus oryzae Amylaza có th thu nh n nh Bacillus Subtilis Bac.Stearothermophilus α-Amylaza Asp.niger Asp.oryzae Asp.awamori Glucoamylaza Asp.oryzae, niger Endomycopsis, awamori Asp.niger Pectinaza Asp oryzae Asp.awamori Asp.oryzae Proteaza Bac.Subtilis Streptomyces griseus Proteinaza Asp.awamori, flavus, Candidus Bac.mesentericus, Bac.Subtilis Xenlulaza Trichoderma viride Asp.terreus Kh sinh enzym c a ch ng vi sinh v t không gi ng khác c m t ch ng Vì v y, n ch n vi sinh v t ph i ti n hành tìm ki m, phân l p, l a ch n hàng ch c, hàng trăm th m chí đ n hàng nghìn gi ng vi sinh v t khác m i có đư c nh ng ch ng vi sinh v t có ho t l c cao vi c t o nh ng enzym c n thi t C i t o gi ng: ð nâng cao s c s n xu t enzym c a vi sinh v t làm tăng cư ng ho t tính c a enzym ngư i ta ph i s d ng phương pháp khác ñ c i t o gi ng, ñ c bi t phương pháp gây ñ t bi n B ng phương pháp ñ t bi n nhi u nư c ñã thu ñư c nh ng ch ng vi sinh v t có nh ng đ c tính t t, ch t ng h p m t ho c vài ba enzym ñ u có ho t tính cao so v i ch ng ngun thu ban đ u 5.3.2 Ni vi sinh v t: 5.3.2.1 Các y u t nh hư ng t i s t ng h p enzym: nh hư ng c a thành ph n môi trư ng dinh dư ng: Là y u t quan tr ng có nh hư ng l n đ n s phát tri n t ng h p enzym c a vi sinh v t Cùng m t lo i vi sinh v t n u nuôi c y mơi trư ng có thành ph n dinh dư ng khác m c đ t o thành enzym thành ph n enzym ñư c t o thành khác Ví d : ni Asp.oryzae b ng phương pháp b m t môi trư ng cám đ i m ch có th t o ñư c nhi u enzym, ñó có lo i enzym có ho t tính cao amylaza, proteaza, maltaza, pectinaza, invectaza, ribonucleaza Nhưng n u nuôi môi trư ng Kzapek c i ti n v i nitrat tinh b t ch t o thành ch y u α-amylaza, enzym khác t o thành v i lư ng khơng đáng k Hi n tư ng đư c gi i thích b ng lý thuy t sinh t ng h p c m ng enzym Hi n tư ng c m ng ch th y vi sinh v t ch không th y ñ ng th c v t Khi mơi trư ng có nh ng ch t khó ñ ng hoá vi sinh v t ph i ti t vào môi trư ng m t ho c nh ng enzym tương ng đ phân hu thành nh ng ch t có th đ ng hố đư c Cho nên thêm ch t c m ng vào mơi trư ng dinh dư ng kh sinh t ng h p enzym c a vi sinh v t có th tăng lên g p nhi u l n so v i trư ng h p bình thư ng ð nh nghĩa: M t trình sinh t ng h p ñư c g i c m ng n u ch x y m c đ đáng k mơi trư ng có ch t đ c hi u c a enzym ho c ch t trao ñ i có c u trúc tương t ch t Các enzym thu c lo i g i enzym c m ng, ch t kích thích trình t ng h p g i ch t c m ng Mu n t ng h p ñư c enzym c m ng c n có ñi u ki n: - Th nh t: Có gen tương ng nhi m s c th - Th hai: Có ngun li u đ y đ đ xây d ng phân t enzyme (các axit amin, h p ph n coenzyme) -Th ba: Có lư ng c n thi t cho vi c t ng h p enzyme - Th tư: Có ch t c m ng N u có đ u ki n thi u ch t c m ng enzyme khơng đư c t o thành Trong công ngh s n xu t enzyme c n ph i l a ch n ch t c m ng thích h p xác đ nh n ng đ t i ưu c a mơi trư ng đ có hi u su t sinh t ng h p cao nh t nh hư ng c a đ m: Trong phương pháp ni c y b m t, đ m c a mơi trư ng có v trí đ c bi t quan tr ng Khi ñ m th p vi sinh v t b rơi vào tình tr ng b t l i cho ho t đ ng s ng nên có khuynh hư ng t o bào t h n ch s t ng h p enzyme Khi đ m q cao đ tơi x p thống khí c a canh trư ng b gi m, s t ng h p enzyme khó khăn ð m cho phép vi sinh v t t ng h p enzyme t t thư ng t 53÷65%, ph thu c vào đ c ñi m sinh lí c a vi sinh v t, vào c u trúc h c c a môi trư ng u ki n m c a môi trư ng nuôi c y pH c a môi trư ng: So v i phương pháp nuôi chìm phương pháp b m t ch u nh hư ng c a pH mơi trư ng đ n trình sinh t ng h p enzyme q trình ni pH c a mơi trư ng n đ nh V i phương pháp ni c y chìm pH mơi trư ng bi n đ i rõ r t q trình ni gây nh hư ng l n t i s t ng h p enzyme Do đó, ngư i ta thư ng ñi u ch nh pH ñ thu ñư c enzyme v i hi u su t cao M i lo i enzyme thư ng ñư c t ng h p m nh m t vùng pH xác ñ nh ñ i v i t ng lo i vi sinh v t Ví d : amylaza pectinaza c a n m m c ñư c t ng h p m nh mơi trư ng có pH=4,5÷5, cịn proteaza mơi trư ng có pH=6÷6,5 Nhi t đ : Ph n l n vi sinh v t có kh t ng h p m nh enzyme ñ u thu c lo i ưa nhi t trung bình, có nhi t đ t i thích 22÷320C V i vi khu n có lo i thích nhi t đ cao (35÷550C) chúng có kh t ng h p enzyme có đ b n nhi t cao Khi nâng nhi t đ mơi trư ng t i q m c thích h p kh sinh t ng h p enzyme b gi m rõ r t Oxy: ð vi sinh v t sinh trư ng phát tri n ñư c ph i có oxy Do đó, th i kỳ tích lu sinh kh i ph i cung c p đ y đ oxy cho mơi trư ng Th i gian nuôi: Th i gian nuôi c y thích h p c a m i lo i vi sinh v t ñư c xác ñ nh b ng th i gian cho phép tích t enzyme t i ña Th i gian ñó ph thu c vào ch ng vi sinh v t ph thu c vào enzyme chúng t ng h p 5.3.2.2 L a ch n môi trư ng nuôi c y: Thành ph n môi trư ng dinh dư ng m t nh ng y u t có nh hư ng quy t ñ nh ñ n ho t ñ ng s ng c a vi sinh v t kh sinh t ng h p enzyme c a chúng ð b o ñ m nh ng yêu c u t i thi u cho vi sinh v t phát tri n t ng h p enzyme mơi trư ng c n có ch t ch a cacbon, nitơ, hydro, oxy ch t khoáng Mg, Ca, P,S , Fe, K v.v - Ngu n cung c p cacbon thư ng dùng gluxit Khi s d ng ñư ng c n nh r ng m t s đư ng có tác d ng kìm hãm s sinh t ng h p m t s enzyme thu phân Ví d : đư ng glucose có th kìm hãm sinh t ng h p m t s enzyme h amylaza Ngồi gluxit có th s d ng ngu n cacbon khác m , d u, axit h u cơ, rư u Trong s axit h axit lactic đư c vi sinh v t h p th d dàng c Axit có nhi u nư c chi t ngơ Cho nên cao ngơ đư c dùng v a ngu n b sung ñ m v a ngu n cung c p cacbon cho vi sinh v t phát tri n - Ngu n cung c p nitơ có th h p ch t h u ho c vô Các h p ch t h u nh ng h p ch t giàu đ m cao ngơ, b t đ u tương, khơ đ u, khơ l c… Ngu n nitơ vô urê, NH3, mu i amơn Ngồi ra, m t s axit amin, bazơ purin (adenine, guanine…), pyrimidin ñư c b sung vào môi trư ng nuôi c y Các axit amin có tác d ng khác đ i v i vi sinh v t vi c sinh t ng h p enzyme Nhi u axit amin có kh tăng cư ng sinh t ng h p enzyme, m t s khác l i kìm hãm ho c khơng có nh hư ng rõ r t - Các ngun t khống có nh hư ng rõ r t đ n q trình sinh t ng h p enzyme Các nguyên t bao g m c nguyên t ña lư ng vi lư ng Vi lư ng s t, k m, ñ ng, coban Các nguyên t thư ng có nư c ho c thành ph n h u khác c a môi trư ng (b t, cao ngô) khơng c n b sung ho c ch b sung d ng v t N ng ñ c a nguyên t tăng s kìm hãm m nh s phát tri n c a vi sinh v t Các nguyên t ña lư ng ñư c ñưa vào dư i d ng mu i vô c n tính c hàm lư ng c a chúng có s n thành ph n c a môi trư ng Trong nguyên t c n lưu ý đ n P S ngun t thành ph n c u t o c a nhi u ch t quan tr ng, nh t nucleotit, lipit, vitamin… - Các y u t sinh trư ng: vitamin ch y u dùng ñ kích thích sinh trư ng c a vi sinh v t Tuy nhiên c n nh r ng, nhi u trư ng h p mơi trư ng thích h p cho s sinh trư ng c a vi sinh v t chưa h n thích h p đ sinh t ng h p enzyme Có mơi trư ng kìm hãm s tích lu sinh kh i t bào v n tăng cư ng sing t ng h p enzyme ð xác ñ nh thành ph n mơi trư ng dinh dư ng thích h p cho m i vi sinh v t có th ti n hành l a ch n s kinh nghi m ho c dùng phương pháp toán h c qui ho ch th c nghi m Khi l a ch n nguyên li u ñ chu n b môi trư ng c n ý r ng, nguyên li u t nhiên có ch a nhi u ch t khác nhau, k c nguyên t khống đa lư ng vi lư ng có c y u t sinh trư ng Do v y, nhi u trư ng h p không c n b sung thêm lo i mu i vô M t khác, nguyên li u r ti n v y thư ng dùng cơng nghi p đ s n xu t ch ph m enzyme t vi sinh v t Các nguyên li u t nhiên thư ng dùng ñ chu n b môi trư ng cám g o, b t ngơ, b t đ u tương, khơ l c ho c ph li u men bia, r ñư ng… Trong nguyên li u cám g o b t ngô ngu n cacbon t t nh t Còn n m men bia t phân, khô l c ngu n nitơ t t nh t Khi chu n b mơi trư ng cịn c n ph i ý ñ n ch t có tác d ng u hồ sinh t ng h p enzyme, ñ c bi t ch t c m ng ð i v i m i lo i enzyme có th có nhi u ch t c m ng ph i l a ch n ch t c m ng có hi u qu nh t Ví d ch t c m ng c a sinh t ng h p amylaza tinh b t, dextrin; c a proteaza protein có tr ng lư ng phân t nh S d ng ch t c m ng thư ng làm tăng ñáng k lư ng enzyme ñư c t ng h p Tuy nhiên, l a ch n ch t c m ng c n tính tốn c n th n v giá thành c a 5.3.2.3 Các phương pháp ni c y vi sinh v t: Có nhi u phương pháp khác đ ni vi sinh v t t ng h p enzyme Phương pháp b m t: Phương pháp thích h p đ ni lo i n m m c kh phát tri n c a nhanh, m nh nên t p nhi m • Qui trinh cơng ngh : Môi trư ng ph i tr n làm m h p ñánh tơi làm ngu i gieo m c gi ng vào thi t b nuôi vào phịng ni ni m c canh trư ng Các ch t dinh dư ng thư ng nguyên li u t nhiên ch t th i c a công ngh th c ph m ho c h n h p c a nhi u ch t Trong môi trư ng c n thêm ch t c m ng c n thi t cho s t ng h p enzym ho c b sung thêm ch t dinh dư ng ngu n nitơ, photpho nư c chi t ngô, khoai tây, d ch t phân n m men…ð b o ñ m ñ x p c a mơi trư ng c n có ch t làm x p tr u (10÷20%) Trư c gieo c y c n trùng mơi trư ng đ đ m b o không b nhi m vi sinh v t l Q trình ni c y kéo dài t 33÷48h Có hi n tư ng: - Th i nhi t, c n gi to=28÷32oC - Gi m m, gi ϕphịng=96÷100% - Cung c p O2: q trình m c phát tri n l y O2 th i CO2 c n cung c p khơng khí vơ trùng • Ưu c m c a phương pháp: Ưu: - Cho n ng ñ enzym cao so v i phương pháp b m t - Có th s y khơ nhanh chóng mơi trư ng (d ng thơ) mà khơng nh hư ng đ n ho t l c enzym - Tránh s nhi m trùng toàn b kh i canh trư ng - T n n Như c: - Khó gi i hố, t đ ng hố - Năng su t th p - T n nhi u lao ñ ng - T n nhi u m t b ng Phương pháp ni c y chìm: • V i phương pháp vi sinh v t phát tri n mơi trư ng l ng có s c khí khu y ñ o liên t c Ngu n cacbon s d ng phương pháp tinh b t, ch t th i có đư ng r ñư ng nguyên li u khác Ngu n nitơ hay dùng ch t h u cao ngô, d ch men bia, d ch thu phân, khơ l c…Ngồi thành ph n môi trư ng c n b sung thêm ch t khống Mơi trư ng c n đư c trùng b ng cách s c tr c ti p to=121÷125oC th i gian 60÷90 phút đ i v i môi trư ng ch a nguyên li u b t, đ m thơ 20÷30 phút v i lo i mơi trư ng có ch a đư ng Trong q trình ni c y chìm c n ph i s c khí vơ trùng khu y đ o liên t c N u có b t ph i dùng d u phá b t Th i gian t 1÷4 ngày tuỳ ch ng Ph i ý u ch nh pH • Ưu, c: + Ưu: - Ti t ki m di n tích - D gi i hố, t đ ng hố - S d ng h p lí ch t dinh dư ng, tránh lãng phí - Thu enzym t p ch t - ð m b o v sinh, vơ trùng nên nhi m vi sinh v t l + Như c: - N ng ñ enzym th p, c n làm ñ c canh trư ng trư c tách nên giá thàcao - T n n s c khí - N u khơng đ m b o vơ trùng s nhi m hàng lo t Phương pháp ni chìm bư c: - Bư c 1: vi sinh v t nuôi thi t b ñ phát tri n t i ña - Bư c 2: chuy n sinh kh i sang thi t b khác ñ sinh t ng h p enzym 5.3.3 Tách tinh ch enzym: Trong th c t enzym ñư c s d ng nhi u d ng khác M t s lĩnh v c có th s d ng dư i d ng canh trư ng khô mà ch t lư ng s n ph m khơng thay đ i (như s n xu t rư u, công ngh thu c da) ða s ngành công nghi p (ch y u th c ph m cơng nghi p nh ) địi h i ph i s d ng ch ph m enzym s ch (g i ch ph m k thu t) Còn y h c ph i s d ng ch ph m enzym tinh t Tuy nhiên, cho đ n chưa tìm đư c m t phương pháp chung ñ tách m t enzym mà ph i ph i h p nhi u phương pháp khác Quá trình làm s ch enzym g m giai ño n chi t enzym tách enzym 5.3.3.1 Chi t enzym: M c đích c a cơng đo n tách enzym kh i canh trư ng sau lên men Quá trình ph thu c vào lo i enzym (ngo i bào hay n i bào) môi trư ng lên men (l ng ho c r n) mà ti n hành khác ð i v i enzym ngo i bào n m canh trư ng l ng ti n hành tách sinh kh i ñ thu dung d ch có ch a enzyme N u enzym ngo i bào n m canh trư ng r n (x p) dùng nư c vơ trùng ho c dung d ch đ m thích h p ñ chi t enzym ð thu enzym n i bào ph i ti n hành phá v t bào b ng m t phương pháp sau: - Phương pháp đ ng hố (nghi n máy đ ng hố) - Nghi n v i b t thu tinh, cát… - T phân - Làm l nh đơng tan giá l p l p l i nhi u l n - Nh tác ñ ng c a siêu âm - Dùng áp su t th m th u cao - Phương pháp khuy ch tán Sau phá v t bào dùng nư c c t ho c dung d ch mu i lỗng ho c dung d ch đ m thích h p đ chi t enzym 5.3.3.2 Tách enzym: M c đích c a giai đo n làm s ch tách enzym kh i h n h p ph thu c vào m c ñ tinh s ch c a ch ph m enzym mà trình tách r t khác Thu nh n ch ph m k thu t: Ch ph m enzym k thu t ch ph m enzym đư c tinh ch sơ b có th ch a m t ho c vài enzym ch y u ð thu ch ph m enzym k thu t đ u tiên ph i đ c dung d ch enzym nhi t ñ 30oC cho ñ n đ t n ng đ 20g/lit Sau ti p t c nhi t đ 40oC cho đ t n ng đ 30÷50g/lit Khi có th cho thêm ch t b o qu n ho c ch t n ñ nh Ti p theo ñem s y phun v i nhi t đ khơng vư t q 70oC Ngồi đ thu ch ph m enzym k thu t ngư i ta có th k t t a b ng dung môi h u ho c mu i trung tính sau cho ch t n đ nh vào s y khơ r i nghi n Dung môi h u thư ng dùng rư u etylic, izopropylic, axeton…k t t a b ng dung môi h u d a nguyên t c thêm dung môi vào dung d ch enzym l c hút gi a phân t protein-enzym tích n phân t nư c bao quanh chúng b gi m Khi n ng ñ dung mơi thêm vào đ t đ n m c làm cho lư ng hydrat hoá gi a phân t nư c protein nh lư ng liên h p gi a phân t protein-enzym lúc phân t proteinenzym liên h p l i t o k t t a Tuỳ theo tính ch t c a enzym dung mơi h u mà m i m t lo i enzym ñư c k t t a m t n ng đ dung mơi khác Ví d proteaza k t t a etanol 76÷78%, α-amylaza k t t a etanol 70%, glucoamylaza k t t a etanol 45% axeton 70% Dùng dung môi h u có ưu m c t thu h i đư c Nhưng dung mơi d làm cho enzym b vô ho t ð kh c ph c c m ph i ti n hành k t t a enzym nhi t ñ th p (5oC) th i gian ng n Các mu i trung tính thư ng dùng đ k t t a enzym là: (NH4)2SO4, NaCl…tuỳ theo tính ch t t ng lo i enzym mà ngư i ta dùng n ng ñ mu i khác Ví d amylaza thư ng k t t a (NH4)2SO4 n ng ñ 0,75% đ bão hồ; glucoamylaza n ng đ 0,8÷0,9% đ bão hồ Phương pháp dùng mu i trung tính k t t a cịn g i diêm tích Phương pháp d a nguyên t c ion mu i có tác d ng phá v l p hydrat bao quanh phân t protein s hút phân t trái d u v phía K t qu làm phân t protein b m t nư c đơng t Sau k t t a ph i lo i mu i trung tính kh i enzym b ng phương pháp th m tích ð th c hi n ngư i ta cho enzym vào màng bán th m (xenlofan) r i cho vào dung d ch đ m thích h p ngâm 24 gi sau th l i n u lo i h t mu i ñưa ñi x lí ti p Thu nh n ch ph m tinh t: ð thu nh n ch ph m tinh t ph i k t h p nhi u phương pháp qua nhi u giai ño n ð u tiên ph i ti n hành lo i b protein khơng ho t đ ng b ng phương pháp bi n tính ch n l c Các protein bi n tính có th tách b ng cách l c ho c ly tâm Sau enzym đư c k t t a b ng dung môi h u ho c mu i trung tính Ti p theo dùng s c kí (s c kí trao đ i ion, h p ph , phân b , gel phân t v.v ) ñ thu phân đo n enzym có ho t l c cao nh t Sau tinh ch xong ph i dùng phương pháp ñi n di ñ ki m tra m c ñ ñ ng nh t c a enzym 5.4 ðánh giá ch t lư ng c a enzym: 5.4.1 Phương pháp ñánh giá: Ch t lư ng c a enzym ñư c ñánh giá b ng m c ñ ho t đ ng c a t c ho t ñ c a enzyme Th c t ngư i ta đo ho t đ c a enzym thơng qua vi c xác ñ nh lư ng ch t m t ñi hay lư ng s n ph m ñư c t o thành ph n ng V nguyên t c có th chia làm nhóm phương pháp xác đ nh ho t đ enzym: ðo lư ng ch t b m t ñi hay lư ng s n ph m ñư c t o thành m t th i gian nh t ñ nh v i m t n ng ñ enzym xác ñ nh ðo th i gian c n thi t ñ thu ñư c m t lư ng bi n thiên nh t ñ nh c a ch t hay s n ph m ng v i m t n ng ñ enzym nh t ñ nh ðo n ng ñ enzym c n thi t ñ làm bi n ñ i m t lư ng ch t hay thu nh n m t lư ng s n ph m nh t ñ nh m t th i gian nh t ñ nh 5.4.2 ðơn v : ð ño ho t ñ c a enzym ngư i ta dùng ñơn v ho t ñ - ðơn v enzym qu c t (kí hi u UI): lư ng enzym có kh xúc tác làm chuy n hóa m t micromol ch t sau m t phút ñi u ki n tiêu chu n ( pHopt, toopt ñ i v i enzym c n xác ñ nh) - ðơn v Katal (Kat): lư ng enzym có kh xúc tác làm chuy n hoá m t mol ch t m t giây ñi u ki n tiêu chu n 1UI= -6 × 10 Kat=16,67 nKat (nanoKat) 60 - Ho t ñ riêng c a ch ph m enzym: s ñơn v UI ho c s ñơn v Kat ng v i 1ml ch ph m (n u dung d ch) ho c 1mg ch ph m (n u b t) N u enzym ñã tinh s ch ho t đ đư c bi u th b ng s UI ho c s Kat 1mg enzym - Ho t ñ phân t : s phân t ch t ñư c chuy n hoá b i m t phân t enzym m t ñơn v th i gian 5.4.3 Nh ng ý ñánh giá ch t lư ng enzym: ð ñánh giá xác ñ ho t ñ ng c a enzym xác đ nh ho t đ c a c n ý: - N ng ñ ch t ph n ng ph i m t gi i h n thích h p đ th a đ bão hồ enzym khơng q cao đ n m c kìm hãm enzym - V i nh ng enzym c n có ch t ho t hố ho c ch t làm b n ph i cho ch t vào enzym trư c cho ch t vào ph n ng - Xác ñ nh ho t ñ c n ti n hành pHopt c ñ nh pH thư ng thay ñ i ph thu c vào ch t thành ph n dung d ch ñ m - Nhi t ñ dùng xác ñ nh ho t ñ ph i nh nhi t ñ t i ưu c a enzym đ đ phịng s kìm hãm c a enzym nhi t ñ cao - Th i gian xác ñ nh ho t ñ thư ng 5÷30 phút Nhưng có trư ng h p kéo dài đ n 24 gi n u ho t ñ c a enzym th p Trong th i gian dài ph i cho thêm nh ng ch t di t khu n ñ tránh hi n tư ng t p nhi m 5.5 Enzym khơng tan: Enzym khơng tan hay cịn g i enzym c ñ nh enzym n m m t không gian b gi i h n S gi i h n linh ho t c a enzym đ t đư c b ng cách đưa vào m t pha cách li, tách r i kh i pha dung d ch t v n có kh ti p xúc đư c v i phân t ch t Pha ch a enzym thư ng không tan nư c có th polymer cao phân t ưa nư c 5.5.1 Ưu c m c a enzym khơng tan: Ưu ñi m: - Gi m giá thành có th s d ng l p l i nhi u l n m t lư ng enzym xác ñ nh - Enzym không l n s n ph m tránh đư c nh hư ng khơng t t c a đ i v i s n ph m - Có th làm ng ng nhanh chóng ph n ng c n thi t - Enzym không tan b n enzym tan k t h p t n d ng y u t nhi t ñ , pH… - Dùng enzym c đ nh có th d dàng thay th trình lên men b ng ph n ng enzym t bào Như c m: Enzym khơng tan có ho t đ riêng nh enzym tan 5.5.2 Phương pháp s n xu t enzym khơng tan: G m có phương pháp: 5.5.2.1 G n liên k t đ ng hố tr : ða s enzym khơng tan đư c s n xu t b ng phương pháp Nó chia làm hai phương pháp g n enzym vào ch t khơng hồ tan ho c g n phân t enzym v i ñ t o thành đ i phân t khơng hồ tan G n phân t enzym vào ch t mang khơng hồ tan: • Yêu c u v ch t mang: - Có ñ hoà tan th p b n v ng v i tác ñ ng cơ, nhi t hố h c - Các ch t mang khơng gây tác đ ng kìm hãm enzym - Khơng h p ph phi ch n l c ñ i v i protein - Nên háo nư c ch t mang k nư c có th gây c ch v i enzym ñư c mang - Vi c g n s có hi u qu n u ch t mang enzym có n tích trái d u • Nh ng ch t mang thư ng dùng: + Ch t mang h u cơ: polypeptit, polysaccarit, d n xu t c a xenlulo (DEAE-xenlulo: dietyl animoetyl xenlulo, CM-xenlulo: cacboxyl metyl xenlulo), d n xu t c a dextran (DEAE-sephadex, CM-sephadex) ho c agaroza (aga khác v i agaroza, thành ph n c a agaroza có g c sunfat) Ch t mang thông d ng c detran có liên k t ngang g i sephadex agaroza d ng h t g i sepharoza Nói chung c lo i ñ u có c u trúc l x p làm cho phân t l n có th xâm nh p vào gel m t cách d dàng Ngoài cịn có polymer t ng h p khác polyacrylamit, polysterol, polyamit + Ch t mang vô cơ: so v i ch t mang h u ch t mang vô b n v nhi t, h c, hoá h c, vi sinh v t nh t khơng thay đ i c u hình c a khn thay đ i tính ch t c a môi trư ng xung quanh Các ch t mang vô như: silicagen, pentonit, nhôm hydroxyt … G n enzyme v i Ngư i ta có th g n nh ng enzyme l i v i nh nh ng tác nhân ña hay lư ng ch c ñ t o thành nh ng đ i phân t enzyme khơng hồ tan V i phương pháp thu ñư c nhi u d n xu t enzyme khơng tan, ví d thu d n xu t tripxin không tan b ng cách dùng andehyt glutaric (OHC-(CH2)3-CHO) 1% ñ liên k t phân t enzyme Phương pháp có ưu m: - Ít t n th t enzyme gi i phóng môi trư ng - Tăng kh ch ng ch u c a enzyme ñ i v i y u t bi n tính nên đưa vào s n xu t ñư c Như c ñi m c a phương pháp s enzyme c đ nh 5.5.2.2 “Gói”enzyme khn gel Ph i ti n hành trùng h p hố gel đ ng th i v i s có m t c a enzyme Sau ñó enzyme ñư c gi l i gel gel có enzyme có th làm nh b ng cách nghi n máy đ ng hố ho c ép qua l rây r i ñem s y khơ nhi t đ khơng q 400C Có th “gói” enzyme b ng phương pháp sau: - Các gel đư c hình thành s polymer hố t ng h p - Các enzyme b nh t l nh c a s i t ng h p - Gói bao vi th - Phương pơháp ti n polymer 5.5.2.3 Phương pháp h p ph v t lí Phương pháp h p ph v t lí khơng thơng qua liên k t hố tr g n enzyme ch t mang Quá trình th c hi n h p ph ñơn gi n: ch t h p ph enzyme ñư c tr n l n v i m t kho ng th i gian cho phép s h p ph x y nh tương tác c a liên k t ion, k nư c, hydrogen l c Van der Wals Phương pháp có c m trình gi i h p ph enzyme d dàng x y b i s thay ñ i pH, nhi t ñ thành ph n ion 5.5.3 M t s tính ch t c a enzyme khơng tan: - Enzyme khơng tan có ho t đ riêng nh enzyme tan - Enzyme không tan tuân theo ñ nh lu t Michaelis Menten (s nh hư ng c a n ng ñ ch t ñ n ho t tính enzyme) Tuy nhiên có hi n tư ng c nh tranh gi a ch t ch t mang, hi n tư ng khuy ch tán nên có nh ng sai khác ñáng k v t c ñ ph n ng c a enzyme: ch t mang ch t tích n cùnh d u Khơngm khơng tan > Km tan, n u tích n trái d u ngư c l i (Km - H ng s Michaielis) - Enzyme khơng tan có tính b n nhi t cao enzyme tan - Enzyme không tan có s d ch chuy n pH t i ưu sang mi n ki m ho c axit so v i enzyme tan - Enzyme khơng tan có th i gian b o qu n lâu b n v i ch t kìm hãm tác nhân gây bi n tính CHƯƠNG VI: S N XU T AXIT H U CƠ Axit h u ñư c s d ng r ng rãi ch bi n b o qu n th c ph m công ngh vi sinh v t Chính th mà hi n axit h u ñư c nghiên c u s xu t r ng rãi 6.1 Các phương pháp s n xu t axít h u cơ: ð s n xu t axít h u ngư i ta có th dùng nhi u phương pháp khác như: - Phương pháp t ng h p hoá h c - Phương pháp chi t tách t nguyên li u th c v t - Phương pháp sinh t ng h p nh vi sinh v t Trong phương pháp phương pháp sinh t ng h p nh vi sinh v t r t có ý nghĩa q trình s n xu t nhanh, s d ng nguyên li u s n có r ti n có th t o đư c nhi u lo i axít h u khác 6.2 K thu t s n xu t m t s axít h u nh vi sinh v t: 6.2.1 S n xu t axít axetic: Axit axetic có th thu nh n b ng cách lên men đư ng ho c oxy hố rư u etylic Sau xét q trình s n xu t axit axetic t rư u etylic Ch ng vi sinh v t: ð oxy hoá rư u etylic thành axít axetic ngư i ta có th s d ng nhi u lo i vi khu n khác Nhưng s d ng nhi u c ch ng vi khu n: Bacterium schuzenbachi, Bacterium curvum Các lo i vi khu n có kh oxy hóa r t l n Phương trình lên men: CH3CH2OH + O2 CH3COOH + H2O + Q K thu t lên men: Có th s d ng phương pháp lên men liên t c ho c gián ño n ð trình lên men ti n tri n đư c t t c n ý ñi m sau: - Nguyên li u h n h p dinh dư ng: có th s d ng c n thô ho c c n tinh ch ñ làm môi trư ng Theo kinh nghi m cho th y s n xu t t c n thô ... t g m giai ño n: - Tuy n ch n vi sinh v t c i t o gi ng - Nuôi c y vi sinh v t - Tách tinh ch enzym 5. 3.1 Tuy n ch n vi sinh v t c i t o gi ng: Tuy n ch n: Kh t o enzym c a vi sinh v t r t ña... c: + Ưu: - Ti t ki m di n tích - D gi i hố, t đ ng hố - S d ng h p lí ch t dinh dư ng, tránh lãng phí - Thu enzym t p ch t - ð m b o v sinh, vô trùng nên nhi m vi sinh v t l + Như c: - N ng ñ... ho c th c v t - B ng cách thay ñ i ñi u ki n nuôi c y ho c dùng tác nhân ñi u ch nh ngư i ta có th u n q trình sinh t ng h p enzyme c a vi sinh v t theo ý mu n - Vi sinh v t có kh sinh s n phát