BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ****** TRỊNH MINH HỢP NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN ĐỂ TẠO DÒNG BÔNG (GOSSYPIUM HIRSUTUM L.) KHÁNG SÂU XANH (HELICOVERPA ARMIGERA HÜBNER) TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng Mã số: 62. 62. 05. 01 HÀ NỘI - 2012 Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: 1. GS. TS. Lê Trần Bình 2. PGS. TS. Phan Hữu Tôn Phản biện 1: PGS. TS. Đặng Trọng Lương Viện Di truyền Nông nghiệp Phản biện 2: PGS. TS. Nguyễn Văn Hoan Hội Giống cây trồng Phản biện 3: TS. Nguyễn Thanh Thuỷ Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Luận án được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Trường họp tại Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội vào hồi 8 giờ 30 phút ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại: 1. Thư viện Quốc gia Việt Nam 2. Thư viện Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội 3. Thư viện Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển Nông nghiệp Nha Hố 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Ở Việt Nam, bông là cây trồng truyền thống. Tuy nhiên, diện tích và sản lượng rất thấp. Có nhiều nguyên nhân hạn chế mở rộng diện tích và tăng sản lượng bông nước ta, nhưng quan trọng nhất vẫn là sâu hại. Trong số đó, sâu xanh là loài nguy hiểm nhất, có mặt và gây hại nặng ở hầu hết các vùng trồng bông và là đối tượng cần phòng trừ. Trong đó, biện pháp phòng trừ bằng giống kháng đã được đặt ra. Tuy nhiên, đến nay, chúng ta vẫn chưa tạo ra giống kháng sâu tốt. Theo Chương trình phát triển cây bông, Việt Nam cần phát triển theo hướng tăng cường đầu tư thâm canh nâng cao năng suất, chất lượng, đảm bảo hiệu quả kinh tế, nâng cao sức cạnh tranh của cây bông và bảo vệ môi trường sinh thái; với chỉ tiêu đến năm 2015, đạt 20 nghìn tấn và đến 2020 là 60 nghìn tấn bông xơ. Để thực hiện điều này, bên cạnh áp dụng các giải pháp quy hoạch, đầu tư, tài chính…, thì giải pháp khoa học công nghệ mà trong đó ứng dụng phương pháp chuyển gen để tạo giống bông Bt kháng sâu là rất cần thiết. Xuất phát từ những cơ sở trên, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng phương pháp chuyển gen để tạo dòng bông (Gossypium hirsutum L.) kháng sâu xanh (Helicoverpa armigera Hübner)” được tiến hành. 2. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2.1. Ý nghĩa khoa học của đề tài - Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp dẫn liệu khoa học và phương pháp cơ bản về tái sinh và chuyển gen cây bông; sàng lọc, đánh giá và chọn lọc cây bông chuyển gen kháng sâu xanh; và góp phần phát triển lĩnh vực khoa học chọn tạo giống cây trồng kháng sâu. - Đưa kỹ thuật chuyển gen cây bông trở thành công cụ hỗ trợ đắc lực cho công tác chọn tạo giống bông truyền thống và làm cơ sở áp dụng để chọn tạo các loại giống cây trồng kháng sâu khác. 2.2. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài - Kết quả nghiên cứu của đề tài tạo ra dòng bông chuyển gen kháng sâu xanh để làm vật liệu quý cho chương trình chọn tạo giống bông kháng sâu, nhằm cung cấp cho sản xuất bông hàng hóa trong nước. - Nhờ có giống bông chuyển gen kháng sâu xanh sử dụng trong sản xuất, góp phần giảm thiểu rủi ro cho nông dân, giảm chi phí sản xuất, hạ giá thành sản phẩm, tăng thu nhập cho người trồng bông và bảo vệ môi trường sống. 2 3. Mục đích và yêu cầu của đề tài 3.1. Mục đích của đề tài - Ứng dụng được phương pháp chuyển gen để chuyển thành công gen CryIAc vào một số giống bông, đặc biệt là giống bông Việt Nam. - Tạo ra một số dòng bông chuyển gen kháng sâu xanh cao (tỷ lệ giết sâu ≥ 80%) làm vật liệu quý cho chọn tạo giống bông kháng sâu trong nước. 3.2. Yêu cầu của đề tài - Chuyển được gen CryIAc vào một số giống bông bằng phương pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens và vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn. - Sàng lọc, đánh giá và chọn lọc được một số dòng bông chuyển gen kháng sâu xanh cao. 4. Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 4.1. Đối tượng nghiên cứu của đề tài Giống bông SSR60F, Coker310, Coker312, VN36P, C118, LRA5166, MCU9 và TM1; Gen CryIAc, vector chuyển gen pC1300-Ubi-CryIAc và pIBT- CryIAc, vi khuẩn E.coli chủng DH5 và A. tumefaciens chủng C58; Sâu xanh (Helicoverpa armigera Hübner). 4.2. Phạm vi nghiên cứu của đề tài - Phạm vi nội dung nghiên cứu là chuyển gen CryIAc vào cây bông bằng phương pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens và vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn; và sàng lọc, đánh giá, chọn lọc cây chuyển gen bằng kháng sinh, PCR và bio-test (nuôi sâu đánh giá tính kháng trong phòng). - Phạm vi không gian và thời gian là phòng thí nghiệm, nhà kính và nhà lưới của Phòng Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Phòng Nghiên cứu Bảo vệ Thực vật - Viện Nghiên cứu Bông và Phát triển Nông nghiệp Nha Hố - Nhơn Sơn - Ninh Sơn - Ninh Thuận; từ năm 2005 đến 2011. 5. Đóng góp mới của luận án Lần đầu tiên ở Việt Nam: (i) Tái sinh thành công một số giống bông bằng phương pháp tái sinh thông qua tạo phôi soma và tạo đa chồi; (ii) Chuyển thành công gen CryIAc vào một số giống bông bằng phương pháp chuyển gen thông qua A. tumefaciens và vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn; (iii) Tạo được 87 dòng bông chuyển gen kháng sâu xanh. Đặc biệt, tạo được 50 dòng kháng sâu cao làm vật liệu quý cho chương trình chọn tạo giống bông kháng sâu trong nước. 3 6. Cấu trúc của luận án Luận án có 121 trang, gồm phần mở đầu, phần nội dung (3 chương), phần kết luận và đề nghị; với 35 bảng số liệu, 22 hình, 12 phụ lục. Đã tham khảo 151 tài liệu, trong đó có 16 tài liệu tiếng Việt và 135 tài liệu tiếng Anh. Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 1.1. Sơ lược về cây bông, tình hình sản xuất bông thế giới và Việt Nam 1.2. Sâu hại bông và tổn thất gây ra 1.3. Tình hình sản xuất, sử dụng bông chuyển gen và bông Bt kháng sâu 1.4. Ý nghĩa của trồng bông Bt kháng sâu 1.5. Sơ lược lịch sử khám phá gen Bt 1.6. Tái sinh cây bông 1.6.1. Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma được sử dụng nhiều hơn tái sinh thông qua tạo đa chồi, vì cây tái sinh có nguồn gốc từ tế bào đơn, nên tránh được cây chuyển gen dạng khảm. Nghiên cứu quy trình nuôi cấy mô cây bông bắt đầu sớm nhất vào năm 1972 bởi Schenk và Hildebrandt (1972) và quy trình này được xây dựng trong báo cáo tái sinh đầu tiên từ mô nuôi cấy của Davidonis và Hamilton (1983). Quy trình được thiết lập từ môi trường MS bổ sung 100 mg/l myo-inositol, 0,4 mg/l thiamine HCl, glucose và tổ hợp nồng độ auxin và cytokinin là 2 mg/l NAA và 0,5 mg/l BA để cảm ứng tạo mô sẹo từ mô lá mầm và thân dưới lá mầm. Khi mô sẹo lớn, chúng được cấy chuyển sang môi trường cảm ứng phân hóa phôi không chứa auxin và cytokinin. Sau 3-4 tháng, tiền phôi hình thành và lần lượt phát triển thành phôi trưởng thành và cây tái sinh khi được cấy chuyển sang môi trường có nồng độ muối thấp cùng với giảm hoặc không chứa NH 4 + , tăng nồng độ KNO 3 và bổ sung 5 g/l glucose. Quy trình trên tốn công lao động, thời gian tái sinh dài, phát sinh nhiều biến dị soma. Hơn nữa, chỉ giống thuộc họ Coker dễ tái sinh. Nhược điểm này, thúc đẩy nhiều nghiên cứu mới cải tiến quy trình tái sinh ban đầu như của Chaudhary et al. (2003), Kumar et al. (1998), Kumria et al. (2003)… 1.6.2. Tái sinh cây bông thông qua tạo đa chồi Để khắc phục hạn chế của tái sinh thông qua tạo phôi soma, các nhà khoa học thế giới đã nghiên cứu tái sinh thông qua tạo đa chồi từ đốt lá mầm, mô phân sinh đỉnh chồi hoặc phôi hạt như của Banerjee et al. (2003), Morre et al. (1998)… 4 1.7. Chuyển gen cây bông 1.7.1. Chuyển gen thông qua A. tumefaciens Chuyển gen vào cây bông thông qua A. tumefaciens được báo cáo đầu tiên bởi Umbeck et al. (1987) và Firoozabady et al. (1987). Họ sử dụng phương pháp nuôi cấy mô và chuyển gen như nhau. Umbeck et al. chuyển vào mẫu mô thân mầm giống Coker312, còn Firoozabady et al. chuyển vào mẫu mô lá mầm giống Coker210. Họ sử dụng A. tumefaciens chủng LBA4404 chứa vector mang gen nptII. Họ nhiễm mẫu mô với dung dịch vi khuẩn trong vài giây (Firoozabady et al.) hoặc qua đêm (Umbeck et al.), sau đó, đồng nuôi cấy vi khuẩn và mẫu mô 3 ngày trên môi trường không chứa kháng sinh để kích thích vi khuẩn sinh trưởng. Sau đó, mẫu mô được đặt lên môi trường MS chứa 50 mg/l kanamycin, 500 mg/l cefotaxime (Umbeck et al.) hoặc 500 mg/l carbenicillin (Firoozabady et al.), 0,1 mg/l kinetin + 0,1 mg/l 2,4D và nuôi 4-6 tuần (Umbeck et al.) hoặc 5 mg/l 2iP + 0,1 mg/l NAA và nuôi 2-3 tuần (Firoozabady et al.) để cảm ứng mô sẹo chuyển gen. Họ cảm ứng phân hóa phôi trên môi trường không chứa chất điều hòa sinh trưởng, trong khi vẫn duy trì kháng sinh kanamycin và cefotaxime hoặc carbencillin. Cây chuyển gen được tái sinh và ra rễ trên môi trường có nồng độ muối thấp, không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng (Umbeck et al.) hoặc có bổ sung 0,1 mg/l NAA + 0,1 mg/l GA 3 (Firoozabady et al.). Phương pháp chuyển gen này được sử dụng rất rộng rãi, vì không đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt, số bản sao gen chuyển ít, di truyền ổn định, thao tác dễ dàng và chi phí thấp. 1.7.2. Chuyển gen bằng vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn (pollen tube pathway - PTP): là chuyển trực tiếp gen vào tế bào mầm (germline cell). Cơ chế của chuyển gen PTP: Sau khi hoàn thành quá trình thụ tinh kép, một lượng lớn chất dinh dưỡng và năng lượng được yêu cầu cho sự phân chia đầu tiên của hợp tử. Ở giai đoạn này, các tế bào có màng nhân, màng và thành tế bào chưa hoàn chỉnh, nên trao đổi chất giữa các tế bào hợp tử và tế bào xung quanh xảy ra thường xuyên. Vì vậy, có thể cho phép các đoạn DNA đi vào túi phôi, hợp tử và kết hợp với genom theo một cơ chế chưa rõ ràng. Tiến bộ của chuyển gen PTP ở cây bông: Từ năm 1993, Ni et al. (1996) đã chuyển gen mã hóa Bt, Bt + CpTi, chitinase,  -glucanase, glucose oxidase, protein kháng nấm bằng PTP vào các giống Zhongmiansuo 12, Zhongzhi 372, Simian 3, Sumian 8, Siyang 167, Shiyuan 321, Xinluzao 4, Liaomian 15, 541, 916, C6524, Q010, Suyin A, B, C… Kết quả, nhiều giống bông chuyển gen được tạo ra, có khả năng kháng với sâu xanh hoặc bệnh nấm. 5 Theo Ni et al. (2004) chuyển gen PTP có thuận lợi sau: (i) Tránh được biến dị soma và sự phụ thuộc vào kiểu giống; (ii) Mở rộng phạm vi loài nhận gen; (iii) Rút ngắn thời gian của quá trình chuyển gen; (iv) Tần suất chuyển gen khá cao, 0,5-1%; (v) Thao tác bằng tay đơn giản và dễ dàng; và (vi) Thích hợp với chuyển gen quy mô lớn để có quần thể lớn cây chuyển gen. 1.8. Sàng lọc và đánh giá cây chuyển gen 1.8.1. Sàng lọc tế bào, mô hoặc cây chuyển gen nhờ gen chỉ thị chọn lọc Có thể tạo ra cấu trúc DNA plasmid, trong đó, ngoài gen khởi động, gen của A. tumefaciens giúp cho DNA plasmid gắn vào genom thực vật, gen mục tiêu cần chuyển…, còn có gen giúp sàng lọc tế bào, mô hoặc cây tiếp nhận gen. Gen lắp ghép với mục đích như vậy gọi là gen chỉ thị. Có 2 loại gen chỉ thị là gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker gene) và gen báo cáo (reporter gene). 1.8.2. Xác định sự có mặt của gen chuyển trong tế bào cây chuyển gen Cây được chuyển gen, sinh trưởng trên môi trường chọn lọc, thì chưa đủ cơ sở khẳng định chuyển gen thành công, vì tính kháng có thể xuất hiện tự nhiên do đột biến. Vì vậy, cần có phân tích bổ sung bằng PCR và Southern blot. Trong chuyển gen, PCR được sử dụng để xác định nhanh sự có mặt của gen chuyển trong tế bào, vì phương pháp rất nhạy và cho kết quả chính xác; còn Southern blot được sử dụng để chứng minh gen chuyển gắn kết vào genom, vì phương pháp rất nhạy, cho kết quả rất chính xác, ít bị ảnh hưởng bởi DNA lẫn tạp, đồng thời có thể nhận được thông tin vị trí và số bản sao gen gắn kết. 1.8.3. Đánh giá sự biểu hiện của gen chuyển trong cây chuyển gen PCR và Southern blot xác định được sự có mặt, gắn kết và số bản sao gen chuyển trong genom. Tuy nhiên, với thông tin này, chưa thể kết luận chuyển gen thành công, vì gen chuyển cần phải hoạt động phiên mã và dịch mã. Ngày nay, nhờ sự ra đời các phương pháp phân tích phân tử như Northern blot và Western blot cho phép xác định các hoạt động này một cách nhanh chóng và chính xác. 1.8.4. Đánh giá tính kháng sâu của cây bông chuyển gen Bt Kết quả xác định sự có mặt và gắn kết gen dương tính chỉ là điều kiện cần, tính kháng sâu trên đồng ruộng mới là điều kiện đủ. Do đó, phân tích sinh học cần thực hiện để chọn dòng chuyển gen kháng sâu cao. Đánh giá tính kháng sâu của cây chuyển gen Bt ở 3 mức (i) trong phòng: sử dụng lá cây trong nhà lưới, nhà kính để nuôi sâu; (ii) trong lồng lưới: trồng cây trong lồng lưới, thả sâu, điều tra nụ và quả bị hại; và (iii) trên đồng ruộng: trồng cây trên đồng, điều tra mật độ sâu, đo đếm mức độ và tỷ lệ đỉnh ngọn, nụ, quả bị hại để xác định mức độ kháng. 6 Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu 2.1.1. Giống bông: Có 8 giống được sử dụng trong nghiên cứu là SSR60F, Coker310, Coker312, VN36P, C118, LRA5166, MCU9 và TM1. 2.1.2. Gen, vector chuyển gen và chủng vi khuẩn: Gen CryIAc được thiết kế trong 2 vector chuyển gen pC1300-Ubi-CryIAc (cho chuyển gen thông qua A. tumefaciens) và pIBT-CryIAc (cho vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn). Hai vector được biến nạp vào E.coli chủng DH5 và A. tumefaciens chủng C58. 2.1.3. Cặp mồi đặc hiệu: Sử dụng 3 cặp mồi đặc hiệu để PCR nhân gen hpt, nptII và CryIAc. Trình tự 3 cặp mồi và kích thước 3 đoạn DNA nhân ở bảng 2.1. 2.1.4. Hoá chất: Ở phụ lục 1; 2.1.5. Máy móc, thiết bị: Ở phụ lục 2. 2.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Chuyển gen vào cây bông thông qua A. tumefaciens 2.2.1.1. Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma: Cho 6 giống SSR60F, Coker310, Coker312, VN36P, C118 và TM1 theo phương pháp của Chaudhary et al. (2003), Kumar et al. (1998), Kumria et al. (2003), Trolinder và Goodin (1987) và Trolinder và Xhixian (1989). Gồm (a) Tạo nguyên liệu tái sinh bằng khử trùng hạt, tách vỏ, đặt lên môi trường G gồm 1/2 MSB 5 (phụ lục 3) + 20 g/l sucrose + 2,5 g/l gelrite, nuôi 7 ngày; (b) Cảm ứng mô sẹo trên 9 môi trường CI gồm MSB 5 + 30 g/l glucose + 2,5 g/l gelrite + 9 tổ hợp nồng độ 2,4D (0,05; 0,1; 0,3 mg/l) và kinetin (0,1; 0,3; 0,5 mg/l) (bảng 2.2), nuôi 4 tuần; (c) Nhân mô sẹo trên môi trường CP gồm MSB 5 + 30 g/l glucose + 2,5 g/l gelrite, nuôi 8 tuần; (d) Cảm ứng phân hoá phôi trên môi trường EI gồm MSB 5 + 1,9 g/l KNO 3 + 30 g/l glucose + 2,5 g/l gelrite, nuôi 8 tuần; (e) Phát triển và chín phôi trên môi trường ED gồm MSB 5 + 1 g/l glutamine + 0,5 g/l l-asparagine + 30 g/l glucose + 2,5 g/l gelrite, nuôi 4 tuần; (f) Nảy mầm và tái sinh cây hoàn chỉnh trên môi trường GR gồm MSB 5 + 30 g/l glucose + 2,5 g/l gelrite, nuôi 3-4 tuần; và (g) Huấn luyện, trồng cây tái sinh trong nhà kính và nhà lưới theo hai phương pháp 1 và 2. 2.2.1.2. Tái sinh cây bông thông qua tạo đa chồi: Cho 4 giống LRA5166, VN36P, C118 và TM1 theo phương pháp của Banerjee et al. (2003) và Morre et al. (1998). Gồm (a) Tạo nguyên liệu tái sinh, gồm khử trùng hạt theo phương pháp ở mục 2.2.1.1-a, tách vỏ và lá mầm, thu phôi hạt; (b) Cảm ứng đa chồi trên 12 môi trường MSI gồm MSB 5 + 20 g/l sucrose + 2,5 g/l gelrite + 12 tổ hợp nồng 7 độ 2,4D (0,1; 0,2 mg/l), BA (0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3 mg/l) và NAA (0,1 mg/l) (bảng 2.4), nuôi 1 tuần; (c) Tạo cụm chồi trên 4 môi trường S gồm MSB 5 + 30 g/l sucrose + 8,5 g/l agar + 4 tổ hợp nồng độ BA (0,5; 1 mg/l) và NAA (0,05; 0,1 mg/l) (bảng 2.5), nuôi 4 tuần; (d) Kéo dài cụm chồi trên môi trường E gồm MSB 5 + 30 g/l sucrose + 8,5 g/l agar, nuôi 9 tuần; (e) Tạo rễ - tái sinh cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm trên 4 môi trường R (bảng 2.6); (f) Huấn luyện, trồng cây tái sinh trong nhà kính và nhà lưới theo phương pháp kết luận ở mục 2.2.1.1-g. 2.2.1.3. Chuyển gen vào cây bông thông qua A. tumefaciens: cho 2 giống Coker312 và SSR60F theo phương pháp của Umbeck et al. (1987), gồm: 1) Xác định thông số chuyển gen: (a) Xác định nồng độ hygromycin chọn lọc mô sẹo chuyển gen; (b) Xác định nồng độ cefotaxime ức chế A. tumefaciens; (c) Xác định mật độ tế bào và thời gian nhiễm A. tumefaciens; và (d) Xác định thời gian và nhiệt độ đồng nuôi cấy. 2) Thực hiện chuyển gen: (a) Cảm ứng mô sẹo chuyển gen trên môi trường CI kết luận ở mục 2.2.1.1-b bổ sung hygromycin và cefotaxime ở nồng độ kết luận ở mục 2.2.1.3-1-a và b; (b) Nhân và chọn lọc mô sẹo chuyển gen trên môi trường CP bổ sung hygromycin và cefotaxime ở nồng độ đã kết luận ở mục 2.2.1.3-1-a và b; (c) Cảm ứng phân hóa phôi chuyển gen trên môi trường EI; (d) Phát triển và chín phôi chuyển gen trên môi trường ED; (e) Nảy mầm và tái sinh cây chuyển gen trong ống nghiệm trên môi trường GR; và (f) Huấn luyện, trồng cây chuyển gen trong nhà kính và nhà lưới theo phương pháp kết luận ở mục 2.2.1.1-g. 2.2.2. Chuyển gen vào cây bông bằng vi tiêm vào bầu nhụy qua đường ống phấn: cho 4 giống C118, LRA5166, MCU9 và TM1. 2.2.2.1. Xác định thông số vi tiêm: Gồm: (i) Xác định thời điểm vi tiêm trong ngày; và (ii) Xác định độ sâu kim tiêm theo phương pháp của Ni et al. (2004). 2.2.2.2. Vi tiêm tạo hạt chuyển gen thế hệ T 0 - DNA plasmid mang gen CryIAc sử dụng vi tiêm được tách chiết từ vi khuẩn E. coli chủng DH5α theo kít “Aurum TM plasmid mini” của Hãng Bio-Rad. - Vi tiêm chuyển gen theo quy trình của Ni et al. (2004) có sửa đổi (phụ lục 4), gồm (1) trồng và chăm sóc cây trước khi vi tiêm; (2) tự thụ phấn trước khi hoa nở; (3) chọn hoa vi tiêm; (4) chuẩn bị ống tiêm và dung dịch DNA plasmid; (5) loại bỏ cánh hoa và làm bằng vòi nhụy; (6) vi tiêm chuyển gen; (7) nhỏ dung dịch GA 3 kích thích đậu quả và buộc biển đánh dấu; và (8) chăm sóc và thu hoạch. - Tiến hành vi tiêm 10 µl dung dịch DNA plasmid nồng độ 10, 20, 30 µg/ml cho mỗi bầu nhụy của 4 giống bông để tạo hạt chuyển gen thế hệ T 0 . 8 2.2.3. Sàng lọc, đánh giá cây bông chuyển gen 2.2.3.1. Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kháng sinh: Gồm: ( 1) Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng hygromycin: Sàng lọc cây chuyển gen thế hệ T 1 và T 2 bằng hygromycin; và (2) Sàng lọc cây bông chuyển gen bằng kanamycin: Sàng lọc cây chuyển gen thế hệ T 1 và T 2 bằng kanamycin. 2.2.3.2. Đánh giá cây bông chuyển gen bằng PCR: Đánh giá cây chuyển gen thế hệ T 2 bằng PCR các gen hpt, nptII và CryIAc. 2.2.3.3. Đánh giá tính kháng sâu xanh của cây chuyển gen: Theo phương pháp nuôi sâu đánh giá tính kháng trong phòng của Wang et al. (2004) có sửa đổi bởi Phòng NC Bảo vệ Thực vật - Viện NC Bông và PTNN Nha Hố (phụ lục 10), gồm: (1) Chuẩn bị sâu xanh; (2) Chuẩn bị lá bông; và (3) Nuôi thả cho sâu xanh ăn lá. Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Chuyển gen CryIAc vào cây bông thông qua A. tumefaciens Để chuyển gen thông qua A. tumefaciens cần phải tái sinh được cây in vitro. Vì vậy, đề tài tiến hành nghiên cứu tái sinh cây bông theo 2 phương pháp: 3.1.1. Tái sinh cây bông thông qua tạo phôi soma: cho 6 giống SSR60F, Coker310, Coker312, VN36P, TM1 và C118. - Cảm ứng mô sẹo: Từ kết quả cảm ứng mô sẹo, đề tài rút ra (i) 3 giống có cảm ứng mô sẹo tốt là SSR60F, Coker310 và Coker312; (ii) nồng độ 2,4D 0,1 mg/l và kinetin từ 0,1 đến 0,3 mg/l cho chất lượng mô sẹo cảm ứng tốt hơn; và (iii) môi trường CI 4 cho chất lượng mô sẹo cảm ứng tốt nhất, nên được chọn để cảm ứng mô sẹo cho 3 giống SSR60F, Coker310 và Coker312. - Nhân mô sẹo: Kết quả sau 8 tuần, các dòng mô sẹo CI 4 , CI 5 và CI 6 của cả 3 giống đều lớn rất nhanh, từ ++++ (SSR60F) đến +++++ (Coker310 và Coker312); các dòng mô sẹo CI còn lại lớn chậm hơn, từ + đến ++++ (bảng 3.2). Đa số mô sẹo nhân mềm, hơi ướt, màu vàng nhạt, vàng xanh nhạt (hình 3.2.b và c); chúng lớn rất nhanh và hầu hết thuộc các dòng mô sẹo CI 4 , CI 5 và CI 6 . Một số mô sẹo nhân chuyển hóa thành màu xanh và trắng (hình 3.2.a); những mô sẹo này cứng, chậm lớn và đều thuộc các dòng mô sẹo CI 1 , CI 2 và CI 3 ; về sau chúng bị loại bỏ. - Cảm ứng phân hóa phôi: Kết quả mô sẹo đã phân hóa thành tiền phôi, với tỷ lệ 29,5-100%. Trong đó, Coker310 có tỷ lệ phân hóa phôi cao nhất (84,8- 100%), kế đến Coker312 (52,3-86,7%) và thấp nhất là SSR60F (29,5-61,4%). Các dòng mô sẹo CI 4 , CI 5 và CI 6 có tỷ lệ phân hóa phôi cao hơn các dòng mô [...]... được 50 dòng chuyển gen thế hệ T2 kháng sâu cao (LRA5166: 7 dòng, MCU9: 38 dòng và TM1: 5 dòng) (bảng 3.33) Các dòng kháng sâu cao này tiếp tục được đánh giá tính kháng sâu bằng phương pháp nuôi thả sâu trong lồng lưới, đánh giá đặc điểm nông sinh học ở thế hệ sau để chọn dòng kháng sâu cao và ổn định, có năng suất cao và chất lượng xơ tốt 3.3.3.3 Đặc tính kháng sâu xanh của các dòng chuyển gen thế... sâu chết Kết quả đánh giá cũng cho thấy, có tới 38 dòng kháng sâu cao, 17 dòng kháng trung bình và chỉ có 9 dòng kháng yếu Trong đó, có tới 11 dòng (M-T2/40, M-T2/44, M-T2/59, M-T2/60, M-T2/62, M-T2/64, M-T2/65, M-T2/66, M-T2/67, M-T2/70, M-T2/73) kháng sâu rất cao, với tỷ lệ gây chết sâu xanh 95-100% - Tính kháng sâu của 9 dòng chuyển gen thế hệ T2 giống TM1: Tương tự kết quả đánh giá tính kháng sâu. .. bình Trong đó, 3 dòng C-T2/1, S-T2/1 và S-T2/2 kháng yếu; 4 dòng C-T2/2, C-T2/3, C-T2/5 và C-T2/8 kháng trung bình 3.3.3.2 Kết quả đánh giá tính kháng sâu xanh của 80 dòng chuyển gen thế hệ T2 giống LRA5166, MCU9 và TM1 - Tính kháng sâu của 7 dòng chuyển gen thế hệ T2 giống LRA5166: Kết quả ở bảng 3.30 cho thấy, 7 dòng chuyển gen thế hệ T2 giống LRA5166 đều kháng sâu xanh cao, với tỷ lệ sâu chết 81,4-100%,... tính kháng sâu xanh của cây bông chuyển gen Thu lá của 748 cây chuyển gen thế hệ T2 nuôi sâu xanh đánh giá tính kháng trong phòng Kết quả thu được ở bảng 3.29, 30, 31 và 32 cho thấy, 87 dòng chuyển gen thế hệ T2 đều có tính kháng sâu xanh, với tỷ lệ sâu chết dao động 40-100%, tương đương biến động mức độ kháng sâu từ yếu đến cao, trong khi, tỷ lệ sâu chết trên các giống ĐC chỉ 0-3,3% 3.3.3.1 Kết quả đánh... M-T2/73) kháng sâu rất cao, với tỷ lệ gây chết sâu xanh 95-100% Đây là những vật liệu rất quý cung cấp cho chương trình chọn tạo giống bông kháng sâu của Việt Nam 2 Đề nghị 1) Tiếp tục đánh giá, chọn lọc và làm thuần các dòng chuyển gen thế hệ T2 kháng sâu xanh cao để chọn dòng thuần chủng hơn về các đặc tính nông sinh học, có tính kháng sâu cao và ổn định 2) Sử dụng phương pháp chuyển gen thông qua... 2 gen hpt, CryIAc trong tế bào 7 dòng chuyển gen thế hệ T2 kháng hygromycin; và 2 gen nptII, CryIAc trong tế bào của 80 dòng chuyển gen thế hệ T2 kháng kanamycin Kết quả PCR cùng với kết quả xác định tính kháng kháng sinh và sự di truyền tính kháng kháng sinh duy trì liên tục từ thế hệ T0, T1 đến T2 cho thấy, gen chuyển đã gắn kết vào genom cây bông và di truyền bền vững cho thế hệ sau 20 3.3.3 Đánh... đánh giá cây chuyển gen bằng kháng sinh, PCR và bio-test thu được 87 dòng chuyển gen thế hệ T2 có tính kháng sâu xanh, với tỷ lệ giết chết sâu 40-100% Trong đó, có 50 dòng kháng sâu xanh cao (LRA5166: 7 dòng, MCU9: 38 dòng và TM1: 5 dòng) Trong số 50 dòng này, có 14 dòng (LT2/21, L-T2/26, L-T2/81, M-T2/40, M-T2/44, M-T2/59, M-T2/60, M-T2/62, MT2/64, M-T2/65, M-T2/66, M-T2/67, M-T2/70 và M-T2/73) kháng. .. 64 dòng T2 giống MCU9: 20-100%; và 9 dòng T2 giống TM1: 42,6-99,1% (bảng 3.26, 27, 28) Như vậy, kết quả sàng lọc bằng kháng sinh, thu được 87 dòng chuyển gen thế hệ T2 kháng kháng sinh, gồm 7 dòng kháng hygromycin (của Coker312 và SSR60F) và 80 dòng kháng kanamycin (của LRA5166, MCU9 và TM1) Các dòng này tiếp tục được đánh giá sự có mặt và gắn kết gen chuyển trong genom cây 3.3.2 Đánh giá cây bông chuyển. .. 3.3.3.1 Kết quả đánh giá tính kháng sâu xanh của 7 dòng chuyển gen thế hệ T2 giống Coker312 và SSR60F Số liệu ở bảng 3.29 cho thấy, 7 dòng chuyển gen thế hệ T2 đều kháng sâu xanh, với tỷ lệ sâu chết 48-70%, trong khi, tỷ lệ sâu chết trên 2 ĐC (Coker312 và SSR60F) rất thấp, chỉ 3,3% số sâu chết (Coker312) hoặc sâu không chết (SSR60F) Tuy nhiên, mức độ kháng sâu của 7 dòng chuyển gen thế hệ T2 này không cao,... (77,7%); và 1 dòng kháng yếu là T-T2/16 (50%) (bảng 3.32) Cũng như tỷ lệ kháng kháng sinh, tỷ lệ sâu chết trên các dòng chuyển gen thế hệ T2 rất khác nhau Sự khác nhau này, ngoài nguyên nhân do giống, vector chuyển gen khác nhau, thì cũng có thể do số bản sao gen và đặc biệt là vị trí gắn kết của gen chuyển trong genom khác nhau, như kết luận của Tian et al (1991) Từ kết quả đánh giá tính kháng sâu xanh, đề . từ những cơ sở trên, đề tài Nghiên cứu ứng dụng phương pháp chuyển gen để tạo dòng bông (Gossypium hirsutum L. ) kháng sâu xanh (Helicoverpa armigera Hübner) được tiến hành. 2. Ý nghĩa khoa. TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ****** TRỊNH MINH HỢP NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN ĐỂ TẠO DÒNG BÔNG (GOSSYPIUM HIRSUTUM L. ) KHÁNG SÂU XANH (HELICOVERPA ARMIGERA. đường ống phấn; (iii) Tạo được 87 dòng bông chuyển gen kháng sâu xanh. Đặc biệt, tạo được 50 dòng kháng sâu cao l m vật liệu quý cho chương trình chọn tạo giống bông kháng sâu trong nước. 3