Luận văn Thạc sĩ Sinh học Page 1 of 96 1 MỞ ĐẦU Hàng năm, trên thế giới và Việt Nam, các vụ ngộ độc thực phẩm không ngừng gia tăng. Nguyên nhân chính gây ra ngộ độc thực phẩm được xác định là do vi sinh vật gây bệnh và các yếu tố độc (độc tố nấm hay thuốc trừ sâu có trong rau quả ). Các vi sinh vật gây bệnh đều có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt trong các loại thực phẩm như thịt lợn, thịt gia cầm, trứng, hải sản và các sản phẩm sữa. Ngộ độc thực phẩm ảnh hưởng trực tiếp đến sức khỏe và tính mạng con người, đồng thời gây tác động không nhỏ đến nền kinh tế, chính trị của mỗi quốc gia. Chính vì thế, vấn đề bảo quản lương thực, thực phẩm luôn được đặt lên hàng đầu trong chính sách kinh tế, sức khỏe cộng đồng của mỗi quốc gia, đặc biệt là bảo quản tránh khỏi các vi sinh vật gây bệnh. Để khắc phục những hạn chế của các phương pháp bảo quản thực phẩm truyền thống (bảo quản theo phương pháp hóa học, vật lý), các nhà khoa học trên thế giới đã và đang nghiên cứu, ứng dụng chất bảo quản sinh học không độc hại gọi chung là bacteriocin. Đây là các peptit có hoạt tính kháng khuẩn, đặc biệt an toàn, không gây tác dụng phụ khi sử dụng do bị phân cắt nhanh chóng bởi protease trong đường tiêu hóa ở người. Nhiều bacteriocin đã được nghiên cứu nhưng hiện nay mới có nisin và pediocin PA-1/AcH được thương mại hóa, sử dụng trong công nghệ thực phẩm dưới dạng bột. Do đó, việc nghiên cứu và tìm ra các bacteriocin an toàn, ứng dụng trong bảo quản thực phẩm là rất cần thiết. Enterocin là các bacteriocin được tạo ra từ chi vi khuẩn Enterococcus rất phong phú và đa dạng, có những đặc tính đáng quan tâm trong chế biến, bảo quản thực phẩm. Điển hình là enterocin AS- 48 - mét bacteriocin cấu trúc dạng vòng, có phổ ức chế rộng cả vi khuẩn gram dương và gram âm. Những đặc trưng khác của AS-48 như tính ổn định, bền nhiệt và tính tan tiêu biểu trong phạm vi pH rộng (thích hợp với nhiều loại thực phẩm) hứa hẹn là sự lùa chọn thay thế cho các chất bảo quản hóa học trong tương lai. Từ tính ưu việt của enterocin, đặc biệt là enterocin AS-48 trong bảo quản nhiều loại thực phẩm, các nhà khoa học đã nghiên cứu nhằm thu lượng lớn peptit Luận văn Thạc sĩ Sinh học Page 2 of 96 2 này với mong muốn sử dụng thành thương phẩm. Vấn đề gặp phải là các chủng vi khuẩn Enterococcus có khả năng sinh enterocin thường tiết ra độc tè. Việc lên men và thu hồi sản phẩm theo tiêu chuẩn sạch để có thể sử dụng trong thực phẩm gặp nhiều khó khăn và đạt hiệu suất thấp. Do đó, việc tập trung nghiên cứu tạo enterocin tái tổ hợp không những khắc phục hạn chế trên mà còn chủ động được nguồn enterocin. Enterocin AS-48 hoàn toàn có thể được tổng hợp bằng con đường tái tổ hợp khi biết trình tự ADN của gen mã hóa cho AS-48 mà không cần phải phân lập từ các chủng tự nhiên. Như vậy, enterocin AS-48 có thể được tổng hợp với hiệu suất cao bằng con đường tái tổ hợp nhờ vi khuẩn E. coli. Từ thực trạng trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Tổng hợp và biểu hiện gen mã hóa cho enterocin AS-48 của vi khuẩn Enterococcus faecium trong tế bào Escherichia coli ER2566” nhằm mục đích tổng hợp enterocin AS-48 tái tổ hợp để ứng dụng làm chất bảo quản nông sản, thực phẩm sinh học. Công trình này được thực hiện tại phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Luận văn Thạc sĩ Sinh học Page 3 of 96 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ BACTERIOCIN 1.1.1. Giới thiệu chung 1.1.1.1. Ngộ độc thực phẩm Mặc dù con người đã sử dụng những công nghệ bảo quản thùc phẩm mới và an toàn (ví dụ: HACCP - hệ thống kiểm soát rủi ro về vệ sinh an toàn thực phẩm mang tính phòng ngõa) trong chế biến và bảo quản nhưng các ca ngộ độc thực phẩm vẫn không ngừng gia tăng Error! Reference source not found.. Các hóa chất, kim loại nặng, ký sinh trùng, nấm, virus và vi khuẩn đều có thể gây ngộ độc thực phẩm. Trong đó, vi khuẩn là nguyên nhân phổ biến nhất với hơn 90% các ca ngộ độc thực phẩm hàng năm, chủ yếu do Staphylococcus aureus, Salmonella, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, Bacillus cereus, Toxoplasma gondii và Escherichia coli O157:H7 6, Error! Reference source not found.. Trường hợp nhẹ là những hậu quả về rối loạn tiêu hóa, mất cân bằng điện giải, kiệt sức, trường hợp nặng có thể dẫn đến tử vong nếu không chữa trị kịp thời, đúng cách. Do đó, an toàn thực phẩm luôn là vấn đề quan tâm hàng đầu của mỗi quốc gia mà trọng tâm là bảo quản thực phẩm phòng tránh các vi sinh vật gây bệnh 6. Theo uỷ ban Khoa học và Công nghệ Hoa Kỳ, ước tính hàng năm nước này có khoảng 76 triệu ca ngộ độc thực phẩm, gây ra 5000 ca tử vong. Thực phẩm chính là thịt lợn, thịt gia cầm, trứng, hải sản và các sản phẩm sữa, tiêu tốn từ 6,5-34,9 tỷ đô la Error! Reference source not found.. Các mầm bệnh thực phẩm như Listeria spp. có khả năng chịu nhiệt độ thấp và nồng độ muối cao, gây ra hơn 2500 vụ ngộ độc thực phẩm với 500 ca tử vong chỉ riêng ở Hoa Kỳ 12. Ở Việt Nam, hàng năm cũng có hàng nghìn ca ngộ độc thực phẩm, gây tổn thất về sức khỏe và kinh tế. Trong năm 2008, tính đến tháng 7, đã có 106 vụ ngộ độc thực phẩm, gần 5000 người mắc và 43 người đã bị tử Luận văn Thạc sĩ Sinh học Page 4 of 96 4 vong. Bởi vậy, những chất bảo quản thực phẩm an toàn là vô cùng quan trọng 1, 12. Cùng với sự gia tăng nhu cầu về những thực phẩm tự nhiên và an toàn hơn, con người cần những công nghệ bảo quản mới để ngăn ngõa sự hư háng và nhiễm độc thực phẩm. Các cách truyền thống đã được thay thế bởi những công nghệ mới, cải tiến như khử trùng nhẹ bằng nhiệt, giảm không khí, đóng gói chân không, áp suất thuỷ tĩnh cao, chiếu tia tử ngoại và sử dụng chất kháng khuẩn tự nhiên - các bacteriocin 6, Error! Reference source not found.. Việc sử dụng bacteriocin một mình hoặc kết hợp với xử lý hoá lý và chất bảo quản hoá học có thể là biện pháp hiệu quả để đảm bảo hàm lượng dinh dưỡng của nguyên liệu thô và thực phẩm, kéo dài thời gian bảo quản, kìm hãm vi khuẩn làm háng, gây bệnh 2. 1.1.1.2. Bacteriocin Bacteriocin được Gratia phát hiện lần đầu tiên năm 1925 với tên là principe V bắt nguồn từ một chủng E. coli có khả năng chống lại các chủng E. coli khác trong cùng môi trường nuôi cấy. Thuật ngữ “colicin” do Gratia và Fredericq đặt ra năm 1946. Ngày nay, colicin được dùng cho protein kháng khuẩn từ các loài E. coli và có quan hệ gần với Enterobacteriaceae Error! Reference source not found.. Năm 1953, Jacob và CS. đã đặt tên cho các protein có hoạt tính kháng khuẩn đặc hiệu cao là bacteriocin. Thuật ngữ bacteriocin được giải thích đơn giản. Tương tự “ase” sử dụng trong enzyme, tiếp tố “cin” dùng để biểu thị hoạt tính tạo bacteriocin. Tiếp tố “cin” được viết thêm vào tên chi (hay đúng hơn là tên loài). Colicin được phân lập đầu tiên từ E. coli, monocins từ L. monocytogenes, subtilin được tạo ra bởi Bacillus subtilis, staphylocin từ S. aureus và nhiều loại khác. Các chữ cái theo thứ tù tìm ra được viết sau tên bacteriocin để phân biệt với bacteriocin duy nhất từ chủng khác cùng loài. Ví dụ, lactacin F là bacteriocin thứ 6 được tìm ra từ loài Lactobacilli 34. Luận văn Thạc sĩ Sinh học Page 5 of 96 5 Trong tự nhiên, vi sinh vật có khả năng tạo ra các hợp chất khác nhau nhằm hạn chế hoặc chống lại các vi sinh vật khác 44, 60. Các hợp chất này được biết đến như kháng sinh, sản phẩm trao đổi chất thứ cấp như axit lactic, các yếu tố phân giải như lysozym, các dạng exotoxin protein và bacteriocin. Bacteriocin được tổng hợp khi vi khuẩn gặp các điều kiện ức chế - tác động của môi trường sống, cạnh tranh về nguồn dinh dưỡng, không gian Các bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn cao thậm chí ở nồng độ rất thấp 69. Họ bacteriocin gồm các protein đa dạng về mặt kích thước, vi khuẩn đích, dạng hoạt động và cơ chế miễn dịch. Hiện nay, có hàng trăm loại bacteriocin. Những bacteriocin này được tìm thấy trong hầu hết các vi khuẩn, gần đây còn tìm thấy trong vi khuẩn cổ - Archaea (gọi là các Archaeocin) 60. Nhiều nghiên cứu được tiến hành với bacteriocin trên các loài vi khuẩn khác nhau cho thấy chúng được mã hóa bởi các gen trên plasmid (ví dô, Col plasmid trong E. coli). Mét số được mã hóa bởi các gen nằm trên ADN hệ gen, như plantaracin A và sakacina 674, trong khi có trường hợp được xác định trên các transposon như nisin 69. Vì cũng có hoạt tính kháng khuẩn nên trước đây, bacteriocin bị nhầm lẫn như là “các chất kháng sinh”. Năm 1965, Reeves và CS. đã tìm ra sự khác biệt của bacteriocin với các chất kháng sinh bởi đặc điểm đặc trưng: Bacteriocin có bản chất là protein. Chính sự khác biệt này đã tạo nên đặc tính ưu việt của bacteriocin trong ứng dụng bảo quản thực phẩm 34. Sù tranh luận nên được đặt vào bối cảnh khám phá ra nisin năm 1924, trước cả penicillin và colicin. Khi đó những chất kháng khuẩn protein bị xem là các chất kháng sinh. Chất kháng sinh được tạo ra bởi một nhóm hạn chế vi sinh vật, là sản phẩm trao đổi chất bậc hai. Các chất này không có chức năng rõ ràng trong sinh trưởng và sinh sản của bản thân vi khuẩn, được tiết dễ dàng ra khỏi tế bào 60. Khi khám phá ra trong cấu trúc nisin có chứa một số axit amin hiếm như de- hydroalanin, dehydrobuterin và cầu lanthion sulfur đơn, nisin không được xem là Luận văn Thạc sĩ Sinh học Page 6 of 96 6 một protein bởi riboxom không tạo những axit amin này (kÓ cả những chất tương đồng với nisin như subtilin và epidermin). Chỉ đến khi Hansen và CS. (1990) phát hiện ra rằng, nisin thực tế được tạo ra bởi riboxom qua quá trình khử nước các axit amin và sự hình thành cầu lanthion diễn ra sau dịch mã, nisin mới được công nhận là một bacteriocin. Sự có mặt của các gen riêng rẽ trong tổng hợp bacteriocin xác nhận rằng chúng là protein peptit thực sự. Như vậy, bacteriocin được phân biệt để tránh sự nhầm lẫn và liên quan tới chất kháng sinh y học - có thể gây dị ứng bị cấm sử dụng trong thực phẩm đối với con người. Đặc điểm khác biệt chính là: Bacteriocin được tổng hợp trong riboxom, không phải là các chất chuyển hóa. Do có bản chất protein (thử nghiệm với các enzyme phân giải protein như trypsin, - chymotrypsin và pepsin) 4 nên bacteriocin không gây tác dụng phụ do bị phân cắt nhanh chóng bởi protease trong đường tiêu hóa ở người. Bacteriocin có phổ kháng khuẩn tương đối hẹp, được tiết vào môi trường để ức chế sự sinh trưởng của vi khuẩn hay bào tử, đôi khi tiêu diệt các vi khuẩn quan hệ gần gũi với chủng sản xuất. Các tế bào sản xuất thì miễn dịch với hoạt tính bacteriocin. Các bacteriocin có dạng hoạt động kháng khuẩn khác với kháng sinh. Các đặc điểm trên được tổng kết trong bảng 1 12, Error! Reference source not found. . Bảng 1. Sù khác nhau giữa bacteriocin và kháng sinh Các đặc điểm Bacteriocins Các kháng sinh Ứng dông Thực phẩm Y học Tổng hợp Riboxom (sản phẩm chuyển hóa bậc 1) Sản phẩm chuyển hóa bậc 2 Hoạt tính Phổ hẹp Phổ rộng Miễn dịch tế bào chủ Có Không Sự có mặt của các tế bào miễn dịch trong tế bào chủ Có mặt Vắng mặt Luận văn Thạc sĩ Sinh học Page 7 of 96 7 Dạng hoạt động Hầu hết qua sự hình thành lỗ nhưng đôi khi cũng tác động lên sự tổng hợp sinh học thành tế bào Màng tế bào hay các đích nội bào Ảnh hưởng độc lên tế bào nhân chuẩn Không Có 1.1.2. Phân loại bacteriocin Có nhiều tiêu chuẩn phân loại bacteriocin: Theo đặc điểm cấu trúc, khối lượng phân tử, phổ kháng khuẩn, sinh vật sản xuất 56, 59. Riley và CS. (2007) đã chia bacteriocin thành hai nhóm lớn theo vi khuẩn gram dương và gram âm. Bacteriocin của vi khuẩn gram dương phong phú và đa dạng hơn ở vi khuẩn gram âm. Chúng phân biệt với bacteriocin gram âm theo hai cơ sở. Thứ nhất, quá trình tạo bacteriocin không cần sự giết chết bản thân nó như ở vi khuẩn gram âm. Đây là do cơ chế vận chuyển, giải phóng bacteriocin ở vi khuẩn gram dương. Một số tham gia vào hệ thống vận chuyển đặc hiệu bacteriocin, trong khi một số khác tham gia vào con đường vận chuyển phô thuộc chuỗi tín hiệu (signal sequences dependent export pathway). Thứ hai, vi khuẩn gram dương tạo quá trình điều hòa đặc hiệu bacteriocin, trong khi các bacteriocin từ vi khuẩn gram âm chỉ phụ thuộc vào hệ thống điều hòa của tế bào chủ 60. 1.1.2.1. Bacteriocin từ vi khuẩn gram âm Các bacteriocin tạo ra từ vi khuẩn gram âm là những protein kích thước lớn. Hơn 30 loại bacteriocin từ E. coli đã được xác định. Tuy nhiên, đến nay các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo bacteriocin và sự đa dạng của chúng vẫn chưa hoàn toàn rõ ràng. Những hiểu biết này rất cần thiết, không chỉ giúp phân loại các quần thể vi khuẩn trong môi trường tự nhiên mà còn để giải quyết vấn đề ứng dông 60. Luận văn Thạc sĩ Sinh học Page 8 of 96 8 Đại diện tiêu biểu cho bacteriocin từ vi khuẩn gram âm là colicin với phổ kháng khuẩn hẹp và hoạt động thông qua tương tác với thụ thể đặc hiệu màng ngoài của tế bào đích. Colicin có các cụm gen phân bố trên các plasmid và được sắp xếp thành gen colicin mã hóa cho protein gây độc, gen miễn dịch mã hóa cho protein chịu trách nhiệm miễn dịch đặc hiệu với tế bào sản xuất (bằng cách gắn và bất hoạt protein gây độc) và gen phân giải mã hóa cho protein tham gia vào việc giải phóng colicin thông qua phân giải tế bào chủ 12, 60. Sù tạo colicin được thông qua đơn vị điều hòa SOS (SOS regulon - là một dạng phản ứng của vi khuẩn với sự hư hại ADN, trong đó, các gen lexA và recA có vai trò chủ chốt giúp điều hòa chuỗi phản ứng SOS) 35, 73 và do đó, nã được tạo ra chủ yếu dưới những điều kiện ức chế. Colicin tiêu diệt vi khuẩn qua các cơ chế khác nhau, bằng cách ngăn chặn tổng hợp thành tế bào, tăng tính thấm của màng tế bào đích do sự hình thành lỗ hay hoạt hoá hoạt động của nuclease 60. Phân loại bacteriocin vi khuẩn gram âm Các bacteriocin từ vi khuẩn gram âm được đặt tên theo chi, loài sản xuất, như klebicin của Klebsiella pneumoniae hay theo loài như colicin của E. coli, marcescin của Serratia marcescens, alveicins của Hafnia alvei và cloacins của Enterobacter cloacae) 60. Bacteriocin từ vi khuẩn gram âm có thể được phân thành ba nhóm dùa vào kích thước: Nhóm 1 - Colicin kích thước lớn (25-80 kDa), nhóm 2 - Các microcin kích thước nhỏ hơn (<10 kDa) và nhóm 3 - Bacteriocin như phần đuôi của phage gồm các đơn vị lắp ghép peptit. Trong đó, microcin là những peptit khối lượng phân tử thấp không cảm ứng SOS, có cấu trúc tương tự bacteriocin líp II của vi khuẩn gram dương, được tổng hợp trong pha cân bằng 42. Bacteriocin như đuôi phage là các nuclease và protease kháng vi khuẩn que, tiêu diệt tế bào nhạy cảm bởi sự khử cực màng. Chúng là những phage thiếu sót hay có nguồn gốc từ phage với chức năng như bacteriocin. Ví dô: Pyocin R2 (từ Pseudomonas spp.) là một phần thừa của phage P2 trong khi pyocin F2 tương tự như phage  60. Luận văn Thạc sĩ Sinh học Page 9 of 96 9 1.1.2.2. Bacteriocin từ vi khuẩn gram dương Nisin là đại điện được nghiên cứu sớm nhất trong các bacteriocin vi khuẩn gram dương. Đây là lantibiotic được tạo ra từ Lactococcus lactis spp. gọi là “các chất ức chế nhóm N” 59. Hầu hết bacteriocin từ vi khuẩn gram dương là các peptit nhá, mang điện dương, kỵ nước hay lưỡng tính và thường không có thụ thể nhận biết đặc hiệu trên màng tế bào (trừ một số trường hợp ngoại lệ). Các bacteriocin này khác nhau ở dạng giải phóng, vận chuyển trong tế bào và sự phân cắt trình tự dẫn đầu trong quá trình chế biến tạo phân tử trưởng thành 56, 60. Phân loại bacteriocin vi khuẩn gram dương Nhiều nhà khoa học phân loại bacteriocin từ vi khuẩn gram dương theo các líp có một số điểm khác nhau. Dùa trên các kết quả của Klaenhammer et al. 1993, Kemperman et al. (2003a), Cotter et al. (2005b) … bacteriocin từ vi khuẩn gram dương được chia thành bốn líp theo hình 1: Hình 1. Sơ đồ phân loại các bacteriocin từ vi khuẩn gram dương B B a a c c t t e e r r i i o o c c i i n n t t ừ ừ v v i i k k h h u u ẩ ẩ n n g g r r a a m m d d ư ư ơ ơ n n g g Lớp II: các non- lantibiotic, Mr bé (<10 kDa) Lớp I: các lantibiotic Lớp III: các protein Mr lớn (>10 kDa) Lớp IV: các peptit vòng Loại A: mạch dài dài Loại B: hình cầu Loại C: đa thành phần AII: như SA-FF22 AI: như nisin Phân lớp IIa: như pediocin IIb: đa thành phần IIc: còn lại IIIb: không phân giải IIIa: các lysin Luận văn Thạc sĩ Sinh học Page 10 of 96 10 Líp I - Các lantibiotic (từ lanthionin - chứa antibiotic) là các peptit bền nhiệt, tác động lên cấu trúc màng (<5 kDa), chứa các axit amin hiếm, bị biến đổi sau dịch mã như lanthionin (Lan), -methyllanthion, -methyl lanthionin (MeLan), dehydroalanin và dehydrobutyrin. Líp I còn được phân nhỏ hơn thành các lantibiotic loại A, B, C theo cấu trúc hóa học và hoạt tính kháng khuẩn.  Lantibiotic loại A là các peptit có cấu trúc mạch thẳng kéo dài và linh động. Loại A được phân thành hai phân loại AI và AII dùa trên kích thước, sự tích điện và trình tự peptit dẫn đầu. Ví dụ: nisin thuộc phân loại AI, streptococcin A-FF22 (SA-FF22) tạo ra bởi S. pyogenes chủng FF22 thuộc phân loại AII.  Lantibiotic loại B là các peptit có hình cầu và kém linh động so với loại A, thường không mang điện hay mang điện âm ở pH trung tính. Hoạt động kháng khuẩn dùa trên sự can thiệp những phản ứng enzyme thiết yếu của các tế bào nhạy cảm. Mersacidin đại diện cho loại này là peptit gồm 20 axit amin.  Lantibiotic loại C là các lantibiotic đa thành phần, chủ yếu cấu tạo gồm hai peptit biến đổi sau dịch mã. Trong đó, mỗi peptit có một Ýt hay không có hoạt tính kháng khuẩn nhưng chúng có vai trò điều phối, nghĩa là chỉ khi kết hợp hai peptit mới tạo phân tử bacteriocin có hoạt tính kháng khuẩn. Ví dụ lactacin 3147 từ Lactococcus lactis DP3147 gồm hai peptit LtnA1 và LtnA2 34. Líp II - Bacteriocin <10kDa gồm các bacteriocin peptit đa dạng về khối lượng phân tử, bền nhiệt và chứa các axit amin thông thường (non-lantibiotic). Đây là líp được các nhà khoa học tập trung nghiên cứu nhất 60. Những peptit này được chia thành ba phân líp là:  Phân líp IIa gồm các bacteriocin với cấu trúc tương tù nh- pediocin- có một trình tự liên ứng đầu N của bacteriocin hoàn chỉnh - Tyr-Gly-Asn-Gly-Val- Xaa-Cys. Phân líp này được tập trung nghiên cứu nhiều do hoạt tính diệt mầm bệnh L. monocytogenes hiệu quả. Ví dụ: pediocin PA-1, mét peptit 44 axit amin từ Pediococcus acidilactici 17 . [...]... (ATP-binding cassette transporter) được mã hóa bởi as- 48C1D và as- 48EFGH, cùng được phiên mã trong mét mARN polycistronic với as- 48D1 Ba gen as- 48BC1D tạo các protein chịu trách nhiệm trong quá trình hoàn thiện và tiết của AS- 48, bao gồm: Protein vận chuyển As- Page 24 of 96 24 Luận văn Thạc sĩ Sinh học 48C1D và protein As- 48B Trong khi As- 48C1D có khả năng tạo tính miễn dịch ở mức thấp, As- 48B có thể... Gen as- 48D1 mã hóa cho mét peptit nhỏ kỵ nước, mang điện dương tạo tính kháng bacteriocin sinh ra, được xác định như quyết định tính miễn dịch 23 Đặc điểm và vai trò cụ thể của các gen trong côm gen as- 48 được tổng kết chi tiết trong bảng 4 Bảng 4 Đặc điểm của các protein trong côm gen as- 48 Gen Các đặc điểm liên quan Chức năng protein Axit amin pI as- 48A 105 10,50 Pre-propeptit AS- 48 tiền thân as- 48B... lọc bằng kỹ thuật dùa vào PCR trên 15 chủng Enterococcus sinh bacteriocin, kết quả cho thấy sự tương tự của gen cấu trúc với gen mã hóa cho AS- 48 Kết quả đạt được là 8 trên 10 chủng E faecalis và 3 trên 5 chủng E faecium nghiên cứu tạo enterocin tương tự với AS- 48 52 Ví dụ, một vài biến thể tự nhiên của AS- 48 có tên enterocin EFS2, enterocin 4 và enterocin 21 đã được tìm thấy trong nhiều chủng E faecalis... kb 25, 63 Locus tổng hợp sinh học AS- 48 là một cụm (14,8 kb) gồm 10 gen as- 48ABCC1DD1EFGH tham gia trong quá trình sản xuất enterocin AS- 48 và tạo tính miễn dịch Gen cấu tróc as- 48A, mã hoá một pre-peptit 105 axit amin chứa một đoạn peptit dẫn đầu gồm 35 axit amin Thó vị là hai gen gối lên nhau as- 48BC xác định 73 nucleotit xuôi dòng codon kết thúc TAA của as- 48A 23 Côm gen as4 8 chứa hai protein... còng nh- ở E faecium 7C5 Gần đây, một biến thể của AS- 48 (enterocin vòng AS- 48RJ) với thay sù thay thế mét axit amin Glu20 bằng Val20 đã được phân lập từ chủng E faecium RJ16 Đa số các cụm gen as- 48 được miêu tả xác định trên plasmid trừ AS- 48RJ từ E faecium RJ16 là trên ADN hệ gen Error! Reference source not found., 46, 63 1.3.1 Đặc điểm di truyền Enterocin AS- 48 được mã hóa bởi plasmid đáp ứng... mình hay phối hợp với As- 48C1D (tạo protein đa thành phần As- 48BC1D) giúp loại bỏ peptit dẫn đầu, thúc đẩy sự tạo vòng đầu đuôi đồng thời với vi c vận chuyển phân tử AS- 48 trưởng thành ra ngoài màng tế bào 62, 63 Các gen as- 48D1EFGH có vai trò tự bảo vệ tế bào sản xuất hay miễn dịch 60 Trong đó, As- 48EFGH (protein vận chuyển thứ hai) - tham gia trong quá trình tự bảo vệ chống lại AS- 48 ngoại sinh,... pH 26 Enterocin là các peptit nhỏ được tổng hợp trong riboxom, không bị biến đổi sau dịch mã, trừ vi c phân cắt peptit dẫn đầu Những nghiên cứu sâu hơn là cần thiết để xác định liệu enterocin được mã hóa bởi gen xác định trên ADN hệ gen hay ADN plasmid; xác định các đặc điểm của bacteriocin giúp cho vi c tinh sạch, nhân dòng và biểu hiện gen thuận tiện 57 1.2.1.2 Phân loại enterocin Các enterocin. .. vai trò và lợi Ých cụ thể của Enterococci trong thực phẩm xứng đáng được tập trung nghiên cứu 23, 29, 42 1.3 ENTEROCIN AS- 48 Enterocin AS- 48 đã được nghiên cứu hơn 20 năm qua, là peptit kháng khuẩn dạng vòng, được phân lập đầu tiên từ E faecalis subsp liquefacies chủng S -48 Chính cấu trúc vòng nội phân tử này tạo nên hoạt tính sinh học ưu vi t của AS- 48 so với các enterocin khác Enterocin AS- 48 có... trúc phân tử và cơ chế kháng khuẩn của enterocin AS- 48 33 Hoạt tính của AS- 48 phụ thuộc pH và trạng thái oligomer hóa của protein Mức độ liên kết của enterocin AS- 48 trong dung dịch khác nhau tùy theo môi trường hóa lý 64 AS- 48 ở dạng nhị phân (dimeric) từ pH 4,5 đến 8,5 (khối lượng phân tử trung bình là 15,50 kDa; 14,29 kDa; 15,10 kDa tương ứng ở pH 4,5; 7,5 và 8,5) Dạng nhị phân bền vững ở những... Thạc sĩ Sinh học Hình 11 Mô hình biểu hiện và tinh sạch thu protein vòng; CBD: Vùng protein gắn với hạt chitin; Target protein: Protein đÝch; MCS: Vùng đa điểm cắt 1.4.2 Chủng vi khuẩn biểu hiện E coli ER2566 Trong quá trình biểu hiện gen ngoại lai, một số protein tạo ra rất độc đối với tế bào E coli Do đó, vi c tổng hợp protein tái tổ hợp sẽ bị hạn chế Chủng biểu hiện E coli ER2566 được sử dụng có . tổ hợp nhờ vi khuẩn E. coli. Từ thực trạng trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “Tổng hợp và biểu hiện gen mã hóa cho enterocin AS-48 của vi khuẩn Enterococcus faecium trong tế bào Escherichia. các plasmid và được sắp xếp thành gen colicin mã hóa cho protein gây độc, gen miễn dịch mã hóa cho protein chịu trách nhiệm miễn dịch đặc hiệu với tế bào sản xuất (bằng cách gắn và bất hoạt. để xác định liệu enterocin được mã hóa bởi gen xác định trên ADN hệ gen hay ADN plasmid; xác định các đặc điểm của bacteriocin giúp cho vi c tinh sạch, nhân dòng và biểu hiện gen thuận tiện 57.