45 TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 52, 2009 THÀNH PH ẦN HÓA SINH VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA DNCH CHI ẾT LÁ MUỒNG TRÂU (Cassia alata L.) Võ Thị Mai Hương Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế TÓM TẮT Muồng trâu là cây thuốc được sử dụng để chữa một số bệnh, nhất là bệnh ngoài da. Nghiên cứu này cho thấy, trong lá Muồng trâu, hàm lượng protein chiếm 0,57 - 1,43 g/100g, đường khử: 4,16 - 6,00 g/100g, lipid: 7,82 - 10,51 g/100g, cellulose: 8,35 - 15,2 g/100g. Hàm lượng đường khử và lipid ở lá bánh tẻ cao hơn ở lá non và lá già. Hàm lượng Vit. C trong lá Muồng trâu chiếm 0,970 - 1,362 g/100g, cao nhất là ở lá bành tẻ. Các enzyme chống oxy hóa có hoạt độ khá cao. Hoạt độ riêng của catalase từ 12,056 - 25,034 U/mg protein. Hoạt độ riêng của peroxydase từ 1,729 - 3,874 U/mg protein. Hoạt độ của các enzyme cao nhất ở lá già. Từ dịch chiết lá Muồng trâu trong ethanol 85% thu được 6,14% cao lá. Chế phm này thể hiện hoạt tính kháng đối với tất cả 5 chủng vi khun kiểm định, trong đó kháng mạnh nhất đối với B. subtilis. I. Mở đầu Hi ện nay cùng với sự phát triển của y học, các bài thuốc từ thực vật được sử d ụng để chữa bệnh ngày càng nhiều. Các loài thực vật này có trong tự nhiên, dễ kiếm lại ít có nh ững tác dụng phụ cho con người, do đó đã thu hút sự quan tâm của các nhà nghiên c ứu hoá sinh và y dược học trong nước cũng như trên thế giới [1, 2, 8]. Trong r ất nhiều thực vật được sử dụng với mục đích chữa bệnh, cây Muồng trâu là m ột trong những loại thực vật đã và đang được quan tâm. Trong dân gian, Muồng trâu đang được sử dụng để chữa rất nhiều bệnh khác nhau như: hạt dùng làm thuốc xổ, lá dùng tr ị lác, hoa trị viêm phổi, suyển, phong lỡ, chống ung thư, vỏ thân và rễ trị lỡ ng ứa. Để tìm hiểu kỹ hơn về cây Muồng trâu làm cơ sở đề xuất hướng sử dụng đối t ượng này, chúng tôi khảo sát một số thành phần hóa sinh và thăm dò khả năng kháng khu Nn của dịch chiết của đối tượng này. II. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1. Đối tượng nghiên cứu - Cây Mu ồng trâu (Cassia alata L.) - H ọ Đậu (Fabaceae), Bộ Đậu (Fabales), 46 - Dưới lớp Hoa hồng (Rosidae), Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida), - Ngành Ng ọc lan (Magnoliophyta) [7]. Hình 1: Cây Muồng trâu (Cassia alata L.) 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Chu n bị mẫu Ch ọn lá những cây không bị sâu bệnh các giai đoạn lá non, lá bánh tẻ, lá già. 2.2.2. Ph ương pháp phân tích Các ph ương pháp xác định thành phần hóa sinh: - Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry [10]; xác định hàm l ượng đường khử theo phương pháp Bertrand [10]; xác định hàm lượng N tổng số theo ph ương pháp Kjeldahl; xác định hàm lượng lipid theo phương pháp Soxhlet [10], xác định hàm lượng cellulose theo phương pháp thuỷ phân bằng acid mạnh [10], xác định ho ạt độ enzyme Catalase (C-ase; EC 1.11.1.6) bằng phương pháp chuNn độ với KMnO4 [10]. - Xác định hoạt độ enzyme Peroxidase (P-ase; EC 1.11.1.7) bằng phương pháp so màu [10]. - Hàm l ượng vitamin C (Vit C) được xác định bằng phương pháp chuNn độ với 2,6 - dichlophenolinophenol (DPIP) [10, 12]. 2.2.3.Phương pháp chiết dịch lá Lá t ươi (300g) được rửa sạch, lau khô hoặc để khô tự nhiên, cắt nhỏ lá và ngâm vào 2 bình tam giác dung tích 1000 ml. M ỗi bình ngâm với ethanol 850 tỷ lệ dung môi và m ẫu là 3:1, thời gian ngâm là 30 ngày. Sau 30 ngày lấy mẫu lá ra, lọc dịch ngâm lá r ồi đem cô cạn trên nồi cách thuỷ cho đến khi thu được dạng cao đặc sệt như siro. 47 2.2.4. Phương pháp thử hoạt tính kháng khun Ho ạt tính kháng khuNn của dịch chiết được xác định theo phương pháp khuếch tán trên th ạch với các chủng vi khuNn kiểm định khác nhau. * Ch ủng vi khuNn: Các ch ủng vi khuNn kiểm định đại diện gây bệnh cho người do Trung tâm kiểm nghi ệm Dược, Mỹ phNm - Thừa Thiên Huế cung cấp, gồm: - Vi khu Nn: Gram (+): Staphylococcus aureus (S. aureus) Bacillus pumilus (B. pumilus) Bacillus subtilis (B. subtilis) Gram (-): Escherichia coli (E. coli) Vibrio do Vi ện Công nghệ sinh học cung cấp. III. Kết quả và bàn luận 3.1. M ột số thành phần hóa sinh của lá Muồng trâu 3.1.1. Hàm l ượng một số thành phần hóa sinh K ết quả định lượng một số thành phần hoá sinh trong lá Muồng trâu được trình bày trong b ảng 1. K ết quả ở bảng 1 cho thấy trong thành phần hóa sinh của lá Muồng trâu thì cellulose chi ếm tỷ lệ khá cao. Hàm lượng này ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau có s ự chênh lệch khá lớn và tăng dần từ lá non đến lá già. Hàm lượng cellulose trung bình c ủa lá Muồng trâu cao hơn một số đối tượng như lá nha đam trưởng thành là 9,5 (g/100g), x ương rồng bà không gai 10,48 (g/100g) [9]. + Hàm l ượng lipid: trong lá Muồng trâu hàm lượng lipid đạt từ 7,8 - 10,5 (g/100g) trong đó lá ở giai đoạn trưởng thành có hàm lượng cao nhất đạt 10,5 g/100g. + Hàm l ượng đường khử: hàm lượng đường khử trong lá Muồng trâu không cao, chi ếm từ 4,2 - 6,0 g/100g, thành phần này ở lá trưởng thành, 6,0 g/100g cao hơn ở lá non 4,2 g/100g. B ảng 1: Hàm lượng một số thành phần hoá sinh trong lá Muồng trâu M ẫu lá Đường khử (g/100g mẫu) Protein (g/100g m ẫu) Lipid (g/100g m ẫu) Cellulose (g/100g mẫu) Lá non 4,155 ± 0,133 1,428 ± 0,017 9,393 ± 0,110 8,350 ± 0,150 Lá bánh tẻ 6,002 ± 0,225 1,005 ± 0,114 10,514 ± 0,812 12,967 ± 0,353 Lá già 5,427 ± 0,104 0,566 ± 0,057 7,817 ± 0,104 15,200 ± 0,330 48 + Hàm lượng protein: Hàm lượng protein của lá Muồng trâu rất thấp, dao động trong kho ảng 0,566 - 1,428 g/100g. Hàm lượng này cao nhất ở lá non, tiếp đến là lá bánh t ẻ và thấp nhất ở giai đoạn lá già. 3.1.2. Th ăm dò hoạt độ của enzyme chống oxy hoá C-ase, P-ase, và hàm lượng Vit. C c ủa lá Muồng trâu Kh ả năng chống oxy hóa của các thực vật thể hiện qua hoạt tính của các enzyme oxy hóa kh ử như enzyme C-ase, P-ase…, hoặc một số chất có hoạt tính chống oxy hóa cao nh ư Vit. C, glutation dạng khử (GHS), chỉ số peroxyd hoá lipid… Đây là những thành ph ần quan trọng, giúp cho cơ thể thực vật khử các gốc tự do sinh ra trong quá trình trao đổi chất của cây. Hình 2: Hoạt độ enzyme C-ase và P-ase của lá Muồng trâu Hình 3: Hàm lượng Vit. C trong lá Muồng trâu + Hoạt độ C-ase (EC.1.1.1.1.6): Hoạt độ enzyme C-se được xác định bằng mức độ phân huỷ H2O2. Hoạt độ enzyme C-ase cao ở lá già, đạt 25,30 U/mg protein, ở lá non ho ạt độ enzyme này thấp hơn, chỉ đạt 12,06 U/mg protein. Hoạt độ enzyme C-ase trong lá Mu ồng trâu ở cả 3 giai đoạn đều cao hơn chỉ tiêu này ở ruột lá Nha đam (8,46 - 9,44 U/mg protein) nh ưng lại thấp hơn ở phần vỏ lá (35,06 - 54,87 U/mg protein) [8]. + Ho ạt độ P-ase: Enzyme P-ase có mặt ở động vật và thực vật, tác động lên hydrogen peroxid và peroxid h ữu cơ trong sự hiện diện của chất nhận oxy. Đặc biệt P- ase ng ăn chặn sự nhiễm độc của tế bào bằng cách phân huỷ H2O2 được tạo thành trong t ế bào. Ho ạt độ enzyme P-ase của lá Muồng trâu nằm trong khoảng 1,73 - 3,87 U/mg protein. So v ới kết quả nghiên cứu của Đỗ Quý Hai và cộng sự tiến hành trên lá chè xanh (là đối tượng được xem là có khả năng chống oxy hóa cao) ở vùng Tuần đối với lá chè 3 n ăm tuổi cho thấy, lá chè già có hoạt độ P-ase là 2,13 U/mg protein, lá chè non là 1,82 U/mg protein thì ho ạt độ enzyme này ở lá Muồng trâu cao hơn. So với lá chè già 35 n ăm tuổi hoạt độ P-ase là 5,22 U/mg protein, ở lá chè non là 3,25 U/mg protein thì ho ạt độ enzyme này ở lá Muồng trâu là thấp hơn [6]. Kết quả thực nghiệm cho thấy: ở lá Muồng trâu hoạt độ enzyme C-ase và 49 enzyme P-ase trong giai đoạn nghiên cứu là khá cao đặc biệt là enzyme C-ase cao hơn r ất nhiều so với enzyme P-ase điều đó chứng tỏ enzyme này có vai trò rất quan trọng trong vi ệc bảo vệ cây chống lại các tác dụng độc từ bên ngoài. + Hàm l ượng Vit. C: Vit.C có một vai trò rất lớn, nó có tác dụng giúp cơ thể tăng s ức đề kháng, chống đỡ bệnh tật. Hàm lượng Vit. C trong lá Muồng trâu dao động trong kho ảng 97 - 136 mg/100g trong đó lá bánh tẻ có hàm lượng Vit. C cao nhất 136 (mg/100g), th ấp nhất là lá non. Trung bình hàm lượng Vit. C của lá Muồng trâu cao hơn so v ới cây Xương rồng bà không gai 98 mg/100g và Nha đam 16,05 - 76,12 mg/100g [8]. Nh ư vậy ta thấy, đối với cây Muồng trâu thì Vit. C cũng có vai trò rất lớn trong việc ch ống oxy hóa, giải độc cho cây. 3.2. K ết quả chiết cao toàn phần trong dung môi ethanol và khả năng kháng khu n của cao chiết Ngâm lá Mu ồng trâu tươi trong ethanol 85%, sau 30 ngày dung dịch ngâm lá được rút khỏi bình ngâm, lọc và làm khô trên nồi cách thủy ta thu được dạng cao đặc sệt. Hàm l ượng cao thu được là 6,14%. Th ử hoạt tính kháng khuNn: Tính kháng khu Nn là một trong những tác dụng sinh học của các cây thuốc. Tác d ụng này có liên quan chặt chẽ tới một số hợp chất có hoạt tính sinh học như tannin, flavonoid đặc biệt là các hợp chất phenol có tính chất phytonxide. Nó được hình thành nh ư là phản ứng tự vệ đối với các vết thương do vi khuNn gây bệnh tạo nên. Ho ạt tính kháng khuNn của dịch chiết lá Muồng trâu trong dung môi là ethanol đối với 5 chủng vi khuNn kiểm định thể hiện qua kích thước vòng vô khuNn cho thấy chế ph Nm này thể hiện hoạt tính mạnh nhất đối với B.subtilis (20,25mm), tiếp đến là kháng Vibrio (18,5mm) và S. aureus (18,25mm), B. pumilus (17,75mm) và th ấp nhất là E. coli (15mm). B ảng 2: Khả năng kháng khun của dịch chiết lá Muồng trâu trong ethanol VSV ki ểm định Vibrio S. aureus E. coli B. subtilis B. pumilus Hiệu số vòng vô khu Nn D-d (mm) 18,5 ± 0,5 18,3 ± 0,75 15,0 ± 1,5 20,3 ± 0,9 17,8 ± 0,8 Theo Elysha Nur và cộng sự (2002), Somchit và cộng sự (2003), hiệu số vòng vô khu Nn của dịch chiết lá Muồng trâu đối với S. aureus là 9-12 mm, thấp hơn so với k ết quả thu được của chúng tôi ở nghiên cứu này [5, 11]. Nhìn chung ho ạt tính kháng khuNn của dịch chiết lá Muồng trâu khá cao và kháng đều đối với các chủng vi khuNn nghiên cứu. 50 Hình 4: Vòng vô khu n của dịch chiết lá Muồng trâu với E. coli Hình 5: Vòng vô khun của dịch chiết lá Muồng trâu với S. aureus K ết quả này là cơ sở ban đầu cho những nghiên cứu ứng dụng lá Muồng trâu trong vi ệc chữa một số bệnh liên quan đến các vi khuNn gây bệnh ở các đối tượng nuôi tr ồng thuỷ sản và ở người. IV. Kết luận và đề nghị 1. Hàm l ượng một số thành phần hoá sinh cơ bản của lá Muồng trâu: protein: 0,57 - 1,43 g/100g, đường khử: 4,16 - 6,00 g/100g, lipid: 7,82 - 10,51 g/100g, cellulose: 8,35 - 15,2 g/100g. Hàm l ượng đường khử và lipid ở lá bánh tẻ cao hơn ở lá non và lá già. 2. Hàm l ượng Vit. C trong lá Muồng trâu chiếm 0,970 - 1,362 g/100g, cao nhất là ở lá bành tẻ. Các enzyme chống oxy hóa có hoạt độ khá cao. Hoạt độ riêng của C-ase t ừ 12,056 - 25,034 U/mg protein. Hoạt độ riêng của P-ase từ 1,729 - 3,874 U/mg protein. Ho ạt độ của các enzyme này cao nhất ở lá già. 3. T ừ dịch chiết lá Muồng trâu trong ethanol 85% thu được 6,14 % cao lá. Dịch chi ết này thể hiện hoạt tính kháng đối với tất cả 5 chủng vi khuNn kiểm định, trong đó kháng m ạnh nhất đối với B. subtilis (20,25 mm) và yếu nhất là E. coli (15mm). TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Hà Thị Thanh Bình, Nguyễn Quốc Khang, Trần Quỳnh Hoa, Khảo sát tác dụng kháng khun và chống viêm trên thực nghiệm của flavonoid chiết từ lá chè – Camellia sinensis, Lindl O. Kuntze, Tạp chí Dược học - 8/2005, Số 352, (2005), 17. 2. Trương Văn Châu, Trần Hồng Quang, Đỗ Ngọc Liên, Đặc tính kháng khun của các chất phenolic ở một số loài cây thuộc chi Gacinia L, Tạp chí Sinh học, Tập 28, Số 4, (2004), 59 – 62. 3. Darah Ibrahim and Halim Osman, Antimicrobacterial activity of Cassia alata from Malaysia, Journal of Ethnophamacology, Vol. 45 (3), (1995), 151-156. 51 4. Triệu Duy Điệt, Nguyễn Liêm, Phạm Thanh Kỳ, Nguyễn Xuân Dũng, Nghiên cứu các loại flavonoid từ vỏ cây xoan trà (Choerospondias axillaris Burtt et Hill, Anacardiaceae). Tạp chí Dược liệu, tập 5, Số 3, (2000), 70 – 71. 5. Elysha Nur I., Somchit M. N. and Abdul Rahim M. In vitro antibacterial activity and effect of Cassaia alata in livers of mice. Proccedings of the Regional Symposium on Enviroment and natural Resources 10 - 11 th April 2002, Malaysia, Vol 1, 509 – 511 (2002). 6. Đỗ Quý Hai, Đỗ Tấn Thảo, Phan Văn Cư, Hoạt tính chống oxy hoá của cây chè xanh (Camellia sinensis O. Ktze), Tạp chí Khoa học, Đại học Huế, Số 33, (2006), 51 - 59. 7. Phạm Hoàng Hộ. Cây cỏ Việt Nam, quyển 1, tập 2. Montreat, Canada, (1991) 1036. 8. Võ Thị Mai Hương, Trần Thanh Phong. Nghiên cứu hoạt động chống oxy hóa của cây nha đam (Aloe vera), Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học, Hội nghị toàn quốc 2007, NXB KH&KT, (2007), 883 - 886. 9. Hoàng Thị Kim Hồng, Võ Thị Mai Hương, Biến động một số thành phần sinh lý - hoá sinh của cây nha đam (Aloe vera) theo thời gian sinh trưởng, Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong khoa học sự sống, Báo cáo khoa học, Hội nghị toàn quốc 2007, NXB KH&KT, (2007), 737 - 735. 10. Nguyễn Văn Mùi, Thực hành hóa sinh học, NXB KH&KT Hà Nội, 2000. 11. Somchit et al. In vitro antibacterial activity of ethanol and water extract of Cassia alata. Journal Ethnopharmacol. 84 (1), (2003), 1-4 . 12. Phan Văn Sổ, Bùi Thị Như Thuận. Kiểm nghiệm lương thực, thực phm, NXB KH & KT, 1975. 13. Gomez-Flores R., Tamez-Guerra P. , Rodriguez - Padilla C. , Monreal - Cuevas E, In vitro Antibacterial and Activities of Nopalea cochenillifera Pad Extracts, American Journal of Infectious Diseases (1), (2006), 1 – 8. BIOCHEMICAL COMPOSITIONS AND THE ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF EXTRACT FROM CASSIA ALATA Vo Thi Mai Huong College of Sciences, Hue University SUMMARY Cassia alata is a medicinal plant that has been used to treat many diseases, especially epidermal diseases. The results show that the protein content in the leaves of Cassia alata is about 0,57 - 1,43 g/100g; the reductive sugar content is changing in 4,16 - 6,00 g/100g, the lipid content is 7,82 - 10,51 % and the cellulose content is approximetaly 8,35 - 15,2 g/100g. 52 The content of reductive sugar and lipid in mature leaves are higher than that in the new and old leaves. The vitamin C content is the highest in mature leaves. The activity of antioxidant enzyme is high, especially in the old leaves. The activities of catalase and peroxidase enzyme are 12,056 - 25,034 (U/mg protein) and 1,729 - 3,874 (U/mg protein) respectively. The content of leaves’ extract in ethanol is about 6,135%. This extract has an antibacterial capacity against all of five tested bacterial in which the antibacterial capacity of Bacillus subtilis is the highest. . III. Kết quả và bàn luận 3.1. M ột số thành phần hóa sinh của l Muồng trâu 3.1.1. Hàm l ượng một số thành phần hóa sinh K ết quả định l ợng một số thành phần hoá sinh trong l Muồng trâu được. trong thành phần hóa sinh của l Muồng trâu thì cellulose chi ếm tỷ l khá cao. Hàm l ợng này ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau có s ự chênh l ch khá l n và tăng dần từ l non đến l già cellulose: 8,35 - 15,2 g/100g. Hàm l ượng đường khử và lipid ở l bánh tẻ cao hơn ở l non và l già. 2. Hàm l ượng Vit. C trong l Muồng trâu chiếm 0,970 - 1,362 g/100g, cao nhất l ở l