25 TẠP CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 55, 2009 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HÓA VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG KHU ẨN CỦA NẤM HOÀNG CHI GANODERMA COLOSSUM oàn Suy Ngh , Nguy n Th Thu Th y Tr ng i h c Khoa h c, i h c Hu TÓM TẮT K t qu nghiên c u ã xác nh c m t s ch tiêu sinh hóa c a n m Hoàng chi Ganoderma colossum: Flavonoit (7,38 ± 0,20)%; hàm l ng ng kh ((5,33 ± 0,10) %; vitamin C (0,089 ± 0,020)%. D ch chi t t n m Hoàng chi Ganoderma colossum b ng n c hay etylic u có h at tính kháng khu n i v i 2 nhóm vi khu n G + (B. pumilus, B. cereus, B. subtilis, S. aureus ) và vi khu n G - ( E. coli, S. typhi, V. parahaemaliticus ). D ch chi t Flavonoit t n m Hoàng chi có h at tính kháng khu n m nh h n so v i d ch chi t t n m Hoàng chi b ng n c hay etylic. 1. M ở đầu Lý Th ời Trân, đời nhà Minh (Trung Quốc) đã phân Linh chi ra làm 6 loại theo màu s ắc gồm: Xích chi(Linh chi đỏ), Hắc chi (Linh chi đen), Tử chi (Linh chi tím), Thanh chi (Linh chi xanh), B ạch chi(Linh chi trắng) và Hoàng chi(Linh chi vàng) [8]. N ấm Hoàng chi có tên khoa học là Ganoderma colossum đã được nuôi trồng thành công ở Khoa Sinh học - Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế [2]. Theo tài liệu [10], nấm Hoàng chi thu ộc diện quí hiếm không những ở Việt Nam mà cả ở Trung Quốc. Nghiên c ứu về nấm Hoàng chi mới chỉ được biết đến qua các tài liệu về phân loại [1], hoạt chất triterpenoid [6], thành ph ần protein [10], tác dụng chống oxy hóa [5] Tài liệu công bố v ề thành phần sinh hóa của nấm Hoàng chi hiện còn quá ít nhất là về tính kháng khuẩn c ủa nó. Đó là cơ sở để chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh hóa và khả n ăng kháng khuẩn của nấm Hoàng chi Ganoderma colossum. 2. Nguyên li ệu và phương pháp nghiên cứu - N ấm Hoàng chi (Ganoderma colossum) do TS. Ngô Anh - Khoa Sinh học, Tr ường Đại học Khoa học, Đại học Huế cung cấp. - Thu d ịch chiết nấm Hoàng chi bằng nước: Cân 20 g nấm Hoàng chi rồi cắt thành nh ững lát mỏng. Cho nấm vào ấm siêu Trung Quốc và cho vào 500 ml nước cất tr ộn đều. Đun sôi cách thuỷ cho đến khi để nguội, lọc, thu được 40 ml dịch chiết nấm Hoàng chi b ằng nước. 26 - Thu dịch chiết nấm Hoàng chi bằng cồn: Cân 20 g nấm Hoàng chi rồi cắt thành nh ững lát mỏng. Cho nấm vào bình và cho cồn etylic 960 vào bình định mức đủ 500ml, sau đó cho lên máy lắc để trong 10 ngày, sẽ thu được 30 ml dịch chiết nấm Hoàng chi b ằng cồn etylic. - Các ch ủng vi sinh vật (vsv) kiểm định: Vi khuẩn Gram dương (Bacillus pumilus, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Staphylcoccus aureus); Vi khu ẩn Gram âm (Escherichia coli, Salmonella typhi, Vibrio parahaemaliticus) - Định lượng Flavonoid tổng số của nấm Hoàng chi theo quy trình B. C. Talli [7]. - Định lượng đường khử bằng phương pháp Bertrand [9]. - Định lượng Vitamin C bằng phương pháp sử dụng Iot [9]. - Xác định hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết Hoàng chi và dịch chiết Flavonoid b ằng phương pháp đục lỗ. - Xác định sinh khối vsv kiểm định sau khi cho dịch chiết Hoàng chi và dịch chi ết Flavonoid bằng phương pháp so màu. 3. Kết quả và thảo luận 3.1. Định tính và định lượng Flavonoid có trong nấm Hoàng chi K ết quả định tính và định lượng Flavonoid tổng số của dịch chiết từ nấm Hoàng chi được trình bày ở bảng 1. B ng 1. K t qu nh tính và nh l ng Flavonoid t ng s c a d ch chi t t n m Hoàng chi Thu ốc thử Mẫu NaOH H 2 SO 4 FeCl 3 Shinoda Ho ạt chất có trong n ấm Hoàng chi Flavonoid tổng số c ủa dịch chiết Hoàng chi. +++ Màu r ất đậm + Màu nhạt ++ Màu đậm ++ Màu đậm Chalcon, Auron, Catechin, Flavon, Flavonol Hàm lượng Flavonoid tổng số (%) Dịch chiết từ 50 g qu ả thể nấm Hoàng chi khô. 7,38 ± 0,20 Mức độ đậm nhạt của màu phản ứng thể hiện hàm lượng Flavonoid có trong d ịch chiết từ nấm Hoàng chi. Phản ứng định tính cho biết sự có mặt của một số hoạt ch ất có liên quan tới tính kháng khuẩn của nấm Hoàng chi. 27 Tiếp theo, chúng tôi xác định đường khử và vitamin C có trong nấm Hoàng chi. K ết quả được trình bày ở bảng 2. B ng 2. K t qu xác nh ng kh và vitamin C có trong n m Hoàng chi Xác định đường khử V m u (ml) V KMnO4 (ml) dùng để chu ẩn độ Hàm l ượng đường khử (%) 5 2,633 5,33 ± 0,10 Xác định vitamin C V m u (ml) V i t (ml) dùng để chuẩn độ Hàm lượng vitamin C (%) 20 2,033 0,089 ± 0,020 Kết quả xác định được hàm lượng vitamin C có trong nấm Hoàng chi đạt 0,089 ± 0,020 và l ượng đường khử đạt 5,33 ± 0,10%. So sánh với tài liệu [3], lượng đường kh ử có trong nấm Hoàng chi cao hơn nhiều so với nấm Linh chi nuôi trồng đạt 0,009, Linh chi t ự nhiên đạt 0,008, cổ Linh chi (G. applanatum) đạt 1% còn vitamin C của nấm Hoàng chi l ại thấp hơn nhiều so với các đối tượng này. 3.2. Xác định tính kháng khuẩn của dịch chiết Hoàng chi Tính kháng khu ẩn của dịch chiết Hoàng chi được thử với vi sinh vật kiểm định trên môi tr ường thạch thịt pepton, bằng phương pháp đục lỗ. Kết quả xác định được trình bày ở bảng 3. B ng 3. Ho t tính kháng khu n c a d ch chi t Hoàng chi khi chi t b ng các dung môi khác nhau Dung môi Vi sinh vật kiểm định Hi ệu số vòng vô khuẩn (mm)/ vsv ki ểm định Bacillus pumilus 8,0 ± 0,1 Bacillus cereus 12,7 ± 0,2 Bacillus subtilis 12,0 ± 0,1 Staphylcoccus aureus 18,2 ± 0,4 Escherichia coli 21,0 ± 0,3 Salmlnella typhi 16.4 ± 0,4 Dịch chiết Hoàng chi với dung môi là n ước cất Vibrio parahaemaliticus 17,4 ± 0,2 28 Bacillus pumilus 12,7 ± 0,2 Bacillus cereus 15,2 ± 0,3 Bacillus subtilis 9 ± 0,1 Staphylcoccus aureus 14 ± 0,2 Escherichia coli 19 ± 0,3 Salmlnella typhi 13,5 ± 0,3 Dịch chiết Hoàng chi với dung môi là etylic 96 0 Vibrio parahaemaliticus 15,4 ± 0,4 Kết quả xác định cho thấy: Dịch chiết từ nấm Hoàng chi bằng nước hay cồn etylic đều có khả năng ức chế cả vi khuẩn G + và G - song khả năng ức chế mạnh nhất là đối với vi khuẩn E. coli. So sánh với tài liệu [4] thì khả năng kháng khuẩn của dịch chiết t ừ nấm Hoàng chi bằng nước mạnh hơn so với nấm Linh chi khi cho vòng vô khuẩn với E. coli là 19 mm, B. cereus là 14mm còn S. aureus là 13 mm. 3.3. Xác định tính kháng khuẩn của nấm Hoàng chi khi nuôi vi sinh vật (vsv) ki ểm định trong môi trường dịch thể Để tiếp tục khẳng định tính kháng khuẩn của dịch chiết Hoàng chi, chúng tôi ti ếp tục thử với vi sinh vật kiểm định trên môi trường dịch thể thịt pepton, bằng phương pháp so màu. K ết quả xác định được trình bày ở bảng 4 và bảng 5. B ng 4. M t quang h c (OD) c a môi tr ng nuôi vi sinh v t ki m nh sau khi cho d ch chi t Hoàng chi b ng n c OD sau th i gian nuôi c y (gi ) Môi tr ng nuôi vsv S ml d ch chi t HC/50 ml môi tr ng VSV ki m nh 0 gi 24 gi 48 gi 72 gi 96 gi E coli 0,119± 0,007 0,160± 0,009 0,178± 0,009 0,152± 0,008 0,142± 0,008 V. parahaemaliticus 0,095± 0,006 0,136± 0,009 0,162± 0,008 0,171± 0,009 0,148± 0,008 Không có d ch chi t 0 S.aureus 0,129± 0,009 0,201± 0,008 0,231± 0,009 0,242± 0,010 0,281± 0,010 Có d ch chi t 1 E coli 0,138± 0,008 0,123± 0,006 0,119± 0,004 0,127± 0,003 0,149± 0,005 29 V. parahaemaliticus 0,125± 0,005 0,119± 0,007 0,105± 0,003 0,118± 0,001 0,132± 0,009 S. aureus 0,142± 0,008 0,127± 0,006 0,119± 0,004 0,120± 0,005 0,128± 0,004 E coli 0.151± 0,006 0,123± 0,002 0,082± 0,003 0,081± 0,003 0,105± 0,001 V. parahaemaliticus 0,149± 0,007 0,116± 0,005 0,096± 0,003 0,102± 0,002 0,134± 0,004 2 S. aureus 0,162± 0,009 0,123± 0,009 0,107± 0,004 0,119± 0,004 0,139± 0,003 E coli 0,228± 0,005 0,165± 0,008 0,124± 0,020 0,072± 0,001 0,098± 0,009 V. parahaemaliticus 0,150± 0,006 0,112± 0,005 0,089± 0,003 0,068± 0,001 0,102± 0,003 3 S. aureus 0,212 ± 0,007 0,139± 0,005 0,101± 0,004 0,115± 0,003 0,129± 0,008 B ng 5. M t quang h c (OD) c a môi tr ng nuôi vi sinh v t ki m nh sau khi cho d ch chi t Hoàng chi b ng c n OD sau th i gian nuôi c y (gi ) Môi tr ng nuôi vsv S ml d ch chi t HC/50 ml môi tr ng VSV ki m nh 0 gi 24 gi 48 gi 72 gi 96 gi E coli 0,113± 0,004 0,125± 0,008 0,146± 0,006 0,167± 0,009 0,160± 0,007 V. parahaemaliticus 0,125± 0,005 0, 146± 0,004 0,162± 0,008 0,169± 0,009 0,176± 0,009 Không có d ch chi t 0 B. cereus 0,117± 0,007 0,135± 0,004 0,149± 0,006 0,170± 0,007 0,169± 0,008 E. coli 0,123± 0,005 0,102± 0,007 0,099± 0,009 0,088± 0,003 0,102± 0,002 Có d ch chi t 1 V. parahaemaliticus 0,138± 0,008 0,112± 0,003 0,097± 0,002 0,100± 0,005 0,112± 0,002 30 B. cereus 0,135± 0,008 0,110± 0,007 0,102± 0,003 0,089± 0,002 0,109± 0,008 E. coli 0,139± 0,009 0,103± 0,005 0,085± 0,008 0,078± 0,003 0,080± 0,003 V. parahaemaliticus 0,150± 0,006 0,119± 0,005 0,100± 0,005 0,082± 0,004 0,116± 0,007 2 B. cereus 0,178± 0,009 0,105± 0,006 0,119± 0,005 0,085± 0,002 0,105± 0,04 E coli 0,195± 0,008 0,102± 0,007 0,068± 0,005 0,052± 0,001 0,089± 0,001 V. parahaemaliticus 0,242± 0,005 0,123± 0,006 0,095± 0,005 0,076± 0,002 0,090± 0,008 3 B. cereus 0,268± 0,007 0,109± 0,008 0,089± 0,004 0,069± 0,001 0,108± 0,003 Kết quả ở bảng 4 và bảng 5 cho thấy: Dịch chiết Hoàng chi có khả năng tiêu diệt vi sinh v ật gây bệnh khá cao, làm cho mật độ sinh khối của vi sinh vật giảm đi một cách rõ r ệt. Hàm lượng dịch chiết Hoàng chi càng cao thì khả năng tiêu diệt vi khuẩn gây b ệnh càng lớn. Kết quả trên cho thấy dịch chiết Hoàng chi chỉ cho kết quả ở một thời gian nh ất định, nó chỉ có tác dụng kháng khuẩn tốt nhất trong thời gian ngắn từ 24-72 gi ờ sau khi nuôi cấy. Qua 2 bảng trên cho thấy dịch chiết Hoàng chi bằng cồn có tính kháng khu ẩn cao hơn so với dịch chiết Hoàng chi bằng nước. 3.4. Xác định tính kháng khuẩn của dịch chiết flavonoid từ nấm Hoàng chi Ho ạt tính kháng khuẩn của nấm Hoàng chi hay thực vật có liên quan chặt chẽ v ới một số họat chất như: Saponin, Triterpenoid, Flavonoid và chúng được hình thành nh ư là phản ứng tự vệ chống lại sự lây nhiễm của vi khuẩn. Đó là cơ sở để chúng tôi ti ếp tục xác định tính kháng khuẩn của dịch chiết Flavonoid từ nấm Hoàng chi đối với các vi sinh v ật kỉểm định trên môi trường thạch thịt pepton, bằng phương pháp đục lỗ. K ết quả xác định được trình bày ở bảng 6. B ng 6. Ho t tính kháng khu n c a d ch chi t Flavonoid t ng s t n m Hoàng chi Dịch chiết Vi sinh vật kiểm định Hi ệu số vòng vô khuẩn (mm)/ vsv ki ểm định Bacillus pumilus 10,3 ± 0,2 Bacillus cereus 18,4 ± 0,1 Flavonoid trong n ấm Hoàng chi Bacillus subtilis 12,3 ± 0,2 31 Staphylcoccus aureus 14 ± 0,3 Escherichia coli 23,5 ± 0,4 Salmlnella typhi 17.2 ±0,2 Vibrio parahaemaliticus 13,6 ± 0,1 Kết quả trình bày ở bảng 6 cho thấy: Dịch chiết Flavoid của nấm Hoàng chi có kh ả năng kháng khuẩn cao hơn so với dịch chiết Hoàng chi được chiết bằng nước hay c ồn. Hiệu số vòng vô khuẩn đối với cả hai vi khuẩn G+ và G- của dịch chiết Flavoid cao h ơn nhiều so với dịch chiết Hoàng chi bằng nước hay cồn. Cả 3 dịch chiết đều có khả n ăng kháng khuẩn tốt nhất đối với E. coli, một vi khuẩn đường ruột nguy hiểm. Kết quả nghiên c ứu là cơ sở khoa học để xác định nấm Hoàng chi Ganoderma colossum là một loài n ấm quí cần được bảo tồn nguồn gen, nhân giống, nuôi trồng và ứng dụng. 4. Kết luận - M ột số thành phần hóa sinh của nấm Hoàng chi Ganoderma colossum đã xác định được là hàm lượng Flavonoid đạt (7,38 ± 0,20)%, đường khử đạt (5,33 ± 0,10)% và Vitamin C đạt 0,089 ± 0,020. - D ịch chiết từ nấm Hoàng chi Ganoderma colossum bằng nước hay cồn etylic xác định theo phương pháp đục lỗ đều có tác dụng kháng khuẩn đối với cả hai nhóm vi khu ẩn Gram dương và Gram âm nhưng mạnh nhất là đối với vi khuẩn E. coli. - D ịch chiết từ nấm Hoàng chi Ganoderma colossum bằng nước hay cồn etylic xác định theo phương pháp so màu đều có tác dụng ức chế sự sinh trưởng, phát triển của vi sinh v ật kiểm định khi nuôi cấy trên môi trường dịch thể và thể hiện mạnh nhất từ 24 đến 72 giờ sau khi nuôi cấy. - D ịch chiết Flavoid của nấm Hoàng chi Ganoderma colossum có khả năng kháng khu ẩn mạnh hơn so với dịch chiết Hoàng chi bằng nước hay cồn etylic. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Ngô Anh, Nghiên c u h n m Linh chi (Ganodermataceae Donk) Th a Thiên – Hu , K y u H i ngh CNSH toàn qu c, Hà N i, (1999), 1043 – 1049. 2. Ngô Anh, Tr n ình Hùng, M t s loài n m d c li u c nuôi tr ng thành công t i Th a Thiên – Hu , T p chí Nghiên c u & Phát tri n, S KH&CN Th a Thiên – Hu , S 4-5, (2005), 68-70. 3. Nguy n Th Chính, K y u H i ngh CNSH toàn qu c, Hà N i, (1999), 956 – 958. 4. Nguy n Th Chính & cs, Nh ng v n NCCB trong Khoa h c s s ng, Nxb. KH & KT, Hà N i, (2005), 429 – 432. 32 5. Lê Th Thu Hi n, oàn Suy Ngh , Nh ng v n NCCB trong khoa h c s s ng, Nxb. KH&KT, Hà N i, (2007), 280-282. 6. Kleinwatcher P. et al, Colossolactones, new triterpenoid active substance from Vietnamese mushroom Ganoderma colossum, J. Nat. Prod. N.64(2), (2001), 236 -239. 7. Nguy n Qu c Khang, Bá Th Châm, M t vài ho t tính sinh d c h c c a thành ph n polyphenol và flavonoid cây m p ng, T p chí D c h c, S 3, (2002), 13-16. 8. T t L i, Lê Duy Th ng, Tr n V n Luy n, N m Linh chi, nuôi tr ng và s d ng, Nxb. Nông nghi p, Tp. HCM, 1994. 9. Nguy n V n Mùi, Th c hành Hóa sinh h c, Nxb. KH&KT, Hà N i, 2001. 10. Lê Xuân Thám, Nói rõ h n v n m Linh chi vàng – n m Hoàng chi, Báo Khoa h c ph thông, S 31/5, (2005), 1 & 13. STUDY ON SOME BIOCHEMICAL INDEX AND ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF MUSHROOM GANODERMA COLOSSUM Doan Suy Nghi, Nguyen Thi Thu Thuy College of Sciences, Hue University SUMMARY Some biochemical index of mushroom Ganoderma colossum identified: Flavonooid (7,38 ± 0,20)%; reductive sugar content (5,33 ± 0,10)%; VitaminC: 0,089 ± 0,020. Extract from mushroom Ganoderma colossum by water or etylic had antibacterial activity to two groups bacterial G + (B. pumilus, B. cereus, B. subtilis, S. aureus) and bacterial G - (E. coli, S. typhi, V. parahaemaliticus). Flavonoid extract from mushroom Ganoderma colossum had antibacterial activity better than extract from mushroom Ganoderma colossum by water or etylic. . phần sinh hóa của nấm Hoàng chi hiện còn quá ít nhất là về tính kháng khuẩn c ủa nó. Đó là cơ sở để chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh hóa và khả n ăng kháng khuẩn của nấm Hoàng. CHÍ KHOA HỌC, Đại học Huế, Số 55, 2009 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHỈ TIÊU SINH HÓA VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG KHU ẨN CỦA NẤM HOÀNG CHI GANODERMA COLOSSUM oàn Suy Ngh , Nguy n Th Thu Th y Tr ng i h c Khoa. chi t Flavoid của nấm Hoàng chi có kh ả năng kháng khuẩn cao hơn so với dịch chi t Hoàng chi được chi t bằng nước hay c ồn. Hiệu số vòng vô khuẩn đối với cả hai vi khuẩn G+ và G- của dịch chi t