Đang tải... (xem toàn văn)
~ 1 ~ LỜI MỞ ĐẦU Lịch sử đã ghi nhận ba đại dịch cúm vào các năm 1918 (cúm Tây Ban Nha), 1957 (cúm Châu Á) và 1968 (cúm Hồng Kông). So với các vụ dịch cúm mùa hàng năm thường xảy ra vào các tháng mùa đông, đại dịch cúm thường xuất hiện sau vài thập kỷ. Đại dịch cúm Tây Ban Nha 1918 được cho là đã cướp đi trên 40 triệu người trên thế giới trong vòng chưa đầy một năm. Cuối tháng ba và đầu tháng 4 năm 2009, vụ dịch cúm A H1N1 đã được phát hiện đầu tiên ở Mexico và sau đó lan ra một số nước lân cận. Bệnh cảnh lâm sàng nhiều trường hợp nhiễm cúm H1N12009 khác biệt rõ rệt so với các trường hợp nhiễm cúm mùa thông thường hàng năm, trong đó tỉ lệ mắc tập trung vào nhóm người trẻ khỏe mạnh. Ngày 1162009, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) tăng mức cảnh báo đại dịch lên mức độ cao nhất, pha 6, cho thấy mức lan rộng trong cộng đồng ở ít nhất hai đại lục. Các dữ liệu cuối năm 2009đầu 2010 từ nhiều vùng dịch khác nhau cho thấy chủng virút cúm đại dịch H1N12009 lây lan rất nhanh và trở thành chủng chiếm ưu thế tại nhiều nơi trên thế giới. Theo thống kê của WHO đến ngày 1932010 đã có trên 213 quốc gia và vùng lãnh thổ có người bị nhiễm virút cúm đại dịch 2009 và nâng tổng số người tử vong lên trên 16800 người. Cũng tại thời điểm này, Bộ Y tế Việt Nam đã ghi nhận trên 11000 trường hợp bị nhiễm bệnh tại 6064 tỉnh thành Việt Nam, con số tử vong là 58 người. Hiện tại, các kỹ thuật phòng thí nghiệm trong chẩn đoán virút cúm đại dịch AH1N12009 bao gồm các kỹ thuật phân tử, phân lập qua nuôi cấy, định type bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu HI hay miễn dịch huỳnh quang và test nhanh 54. Trong đó test nhanh có thể được sử dụng rộng rãi nhất trong chẩn đoán virút cúm ở nhiều quốc gia. Tuy nhiên giá thành của các bộ kit thương mại hiện nay là một trong những khó khăn của các nước đang phát triển. Việc sử dụng các test nhanh trong chẩn đoán virút cúm đại dịch AH1N12009 cũng đang gặp nhiều tranh cãi do tính chính xác của nó. Do đó các phương pháp chẩn đoán phân tử hiện được lựa chọn để phát hiện virút cúm đại dịch 2009. Phương pháp phiên mã ngược realtime PCR (rRTPCR) được CDC xây dựng và đã được sử dụng đầu tiên trong chẩn đoán virút cúm đại dịch 2009 54. Phương pháp này có ưu điểm ít tốn thời gian và có độ nhạy cao hơn một số phương pháp truyền thồng. Nhưng đây là phương pháp đòi hỏi sử dụng máy móc chuyên dụng đắt tiền, bộ mồimẫu dò phải được thay đổi phù hợp tình hình dịch tễ và kỹ thuật viên có kinh nghiệm. Do đó phương pháp này khó có thể sử dụng rộng rãi ở tất cả các phòng xét nghiệm, đặc biệt là phòng xét nghiệm ở vùng sâu vùng xa. Chính vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài này nhằm tạo ra bộ kít chẩn đoán đồng thời virút cúm A nói chung và virút cúm H1N1 đại dịch 2009, sử dụng phương pháp phân tử khá đơn giản và yêu cầu thiết bị tương đối rẻ tiền mà các phòng xét nghiệm có thể trang bị được. Việc tạo ra bộ kít này có thể giúp các phòng xét nghiệm trong cả nước, kể cả các phòng xét nghiệm vùng sâu xa phát hiện sớm bệnh nhằm kịp thời định hướng điều trị cũng như giúp ngăn ngừa ổ dịch có thể xảy ra trong khu vực. Mục tiêu đề tài: 1. Nghiên cứu xây dựng qui trình tạo kít chẩn đoán virút cúm đại dịch AH1N12009 bằng kỹ thuật RTPCR. 2. Sản xuất bộ kít chẩn đoán dựa trên qui trình vừa được tạo ra ở trên.
MỤC LỤC Trang Lời mở đầu 1 Chương 1: Tổng quan tài liệu 1.1. Tình hình dịch tễ virút cúm đại dịch A/H1N1-2009 3 1.1.1. Tình hình thế giới 3 1.1.2. Tình hình Việt Nam 6 1.2. Virút cúm đại dịch 7 1.2.1. Virút cúm A 7 1.2.2. Các đại dịch cúm trong quá khứ 9 1.2.3. Virút cúm A đại dịch H1N1/2009 11 1.3. Các phương pháp chẩn đoán cúm 18 1.3.1. Phương pháp huyết thanh học 18 1.3.2. Phương pháp miễn d ịch 19 1.3.2.1. Phương pháp miễn dịch enzyme 19 1.3.2.2. Phương pháp chẩn đoán nhanh 19 1.3.2.3. Phương pháp miễn dịch huỳnh quang 20 1.3.3. Phương pháp nuôi cấy virút 21 1.3.4. Phương pháp phân tử 21 1.4. Các phương pháp chẩn đoán cúm A/H1N1-2009 22 1.4.1. Phương pháp chẩn đoán nhanh kháng nguyên 22 1.4.2. Phương pháp phân tử 23 1.5. Tác nhân ảnh hưởng đến kết quả chẩn đoán virút cúm 23 1.5.1. Loại mẫu bệnh phẩm 24 1.5.2. Chất lượng mẫu 24 1.6. Các đặc tính quyết định việc đánh giá chính xác trong chẩn đoán 24 1.6.1. Các đặc tính hiệu suất 25 1.6.1.1. Độ nhạy và độ đặc hiệu 25 1.6.1.2. Giá trị tiên đoán dương và tiên đoán âm 25 1.6.1.3. Độ lặp lại 25 1.6.1.4. Độ chính xác 26 1.6.2. Các đặc tính sử dụng 26 1.6.3. Chọn lựa phương pháp chuẩn tham khảo 26 Chương 2: Vật liệu và Phương pháp 2.1. Vật liệu 28 2.1.1. Thiết bị - dụng cụ 28 2.1.1.1. Thiết bị 28 2.1.1.2. Dụng cụ 29 2.1.2. Sinh phẩm - hóa chất 29 2.2. Đối tượng nghiên cứu 32 2.3. Phương pháp nghiên cứu 33 2.3.1. Phương pháp thu mẫu bệnh phẩm 33 2.3.1.1. Loại mẫu 33 2.3.1.2. Vận chuyển và trữ mẫu 33 2.3.2. Phương pháp nuôi cấy phân lập virút cúm trên tế bào MDCK 34 2.3.2.1. Chuẩn bị tế bào MDCK trước nuôi cấy 34 2.3.2.2. Nuôi cấy virút 35 2.3.3. Phản ứng ngưng kết hồng cầu 35 2.3.4. Tách chiết RNA virút 36 2.3.5. Phương pháp real-time PCR 37 2.3.5.1. Chuẩn bị hỗn h ợp phản ứng 37 2.3.5.2. Thực hiện phản ứng 37 2.3.6. Phương pháp RT-PCR 38 2.3.7. Phân tích sản phẩm PCR bằng điện di 38 2.3.8. Thiết kế mồi 38 2.3.9. Xây dựng chứng nội 39 2.3.10. Phương pháp biến nạp 39 2.3.10.1. Nối DNA mục tiêu vào vector 39 2.3.10.2. Biến nạp các plasmid vào tế bào E. coli khả nạp TOP10 40 2.3.10.3. Phân tích kết quả biến nạp 41 2.3.10.4. Tách plasmid mục tiêu từ tế bào chọn lọc 41 2.3.10.5. Cắt plasmid mục tiêu bằng enzyme cắt giới hạn 41 2.3.11. Phương pháp sản xuất enzyme 42 2.3.11.1. Điều kiện nuôi cấy và biểu hiện 42 2.3.11.2. Chiết xuất và tinh sạch enzyme 42 2.3.12. Điện di SDS-PAGE 42 2.3.13. Định lượng plasmid DNA 43 2.3.14. Phương pháp giải trình tự 43 2.3.14.1. Tinh sạch sản phẩm DNA cần giải trình tự 44 2.3.14.2. PCR đánh dấu sản phẩm DNA cần giải trình t ự 44 2.3.14.3. Xử lý mẫu DNA và nạp mẫu vào máy giải trình tự 45 2.3.15. Các phương pháp thống kê 46 2.3.15.1. Độ nhạy 46 2.3.15.2. Độ đặc hiệu 46 2.3.15.3. Giá trị tiên đoán dương 46 2.3.15.4. Giá trị tiên đoán âm 47 2.3.15.5. Ước tính cỡ mẫu cho phân tích độ nhạy và độ đặc hiệu 47 Chương 3: Kết quả và bàn luận 3.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình chế tạo kit xét nghiệm 49 3.1.1. Thiết kế mồi 49 3.1.1.1. So sánh trình tự và thiết kế mồi 49 3.1.1.2. Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi được thiết kế 51 3.1.2. Điều chế enzyme Taq polymerase 52 3.1.2.1. Biểu hiện và tinh sạch Taq polymerase 52 3.1.2.2. Hoạt tính Taq polymerase 54 3.1.3. Khảo sát hỗn hợp enzyme phản ứng RT-PCR 55 3.1.4. Chuẩn hóa các điều kiện phản ứng RT-PCR 59 3.1.4.1. Khảo sát điều kiệ n phản ứng RT-PCR đơn 59 3.1.4.2. Khảo sát điều kiện multiplex RT-PCR 67 3.1.5. Xây dựng chứng nội cho phản ứng multiplex RT-PCR 73 3.1.5.1. Quy trình tạo chứng nội 73 3.1.5.2. Khảo sát nồng độ chứng nội tối thiểu cho phản ứng RT-PCR 76 3.1.5.3 Khảo sát nồng độ mồi cho phản ứng multiplex RT-PCR có chứng nội 77 3.1.6. Khảo sát độ nhạy và độ đặc hiệu 78 3.1.6.1. Khảo sát giới hạn phát hiện củ a phương pháp 78 3.1.6.2. Khảo sát độ nhạy của phương pháp 79 3.1.6.3. Khảo sát độ lặp lại 82 3.1.7. Tạo chứng dương 82 3.2. Xây dựng quy trình sử dụng kit xét nghiệm cúm H1N1/09 84 3.2.1. Khảo sát điều kiện bảo quản 84 3.2.2. Quy trình xét nghiệm bằng RT-PCR 85 3.2.3. Tiêu chuẩn cơ sở 87 3.3. Kết quả kiểm định bộ kit thành phẩm pFLU 88 3.3.1. Kết quả kiểm định cơ sở tại Viện Pasteur TP.HCM 89 3.3.2. Kết quả kiểm định tại Viện kiểm định Quốc gia vắc xin và Sinh phẩm y tế (NICVB) 91 3.3.3. Kết quả tri ển khai thực tế tại TTYTDP các tỉnh phía Nam 92 Chương 4: Kết luận và đề nghị 4.1. Kết luận 99 4.2. Đề nghị 101 Tài liệu tham khảo 102 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT aa : Amino acid (axít amin) ATCC : The American Type Culture Collection (Ngân hàng giống tế bào tại Hoa Kỳ) BHI : Brain-Heart Infusion (Môi trường nước thịt dạng lỏng) BHIA : Brain-Heart Infusion Agar (Môi trường nước thịt dạng thạch) bp : Base pair (Cặp base) BSA : Bovine serum albumin (Albumin huyết thanh bò) CDC : Center of Disease Prevention and Control (Trung tâm ngăn ngừa và kiểm soát dịch bệnh Hoa kỳ) CPE : Cytopathic effect (Hiện tượng hủy hoại tế bào) cDNA : Complementary DNA (DNA bổ sung) ddH 2 O : Deionized distilled water (Nước cất khử ion) ddNTP : Dideoxy nucleoside triphosphates DDT : Dichlorodiphenyltrichloroethane DEPC : Diethyl pyrocarbonate dNTP : Deoxynucleotide Triphosphate DNA : Deoxyribonucleic acid DNase : Deoxyribonuclease dsDNA : Double-stranded DNA (DNA mạch đôi) E.coli : Vi khuẩn Escherichia coli EDTA : Ethylene-Di-amine-Tetra-acetic acid EIA : Enzyme immuno assay ER : Endoplasmic reticulum (Lưới nội chất) FAO : Food and Agriculture Organization (Tổ chức Lương – Nông Thế giới) FBS : Fetal bovine serum (Huyết thanh bào thai bê) FN : False negative (Âm tính giả) FP : False positive (Dương tính giá) HA : Haemagglutinin HAU : Hemagglutination unit (Đơn vị ngưng kết hồng cầu) HBSS : Hank's Buffered Salt Solution HPAI : Highly pathogenic avian influenza Cúm gia cầm độc lực cao IC : Internal control (Chứng nội) INF : Interferon IPTG : Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside kb : Kilobasepairs (~1000bp) LB : Luria Bertani medium (Môi trường LB) LPAI : Low pathogenic avian influenza (Cúm gia cầm độc lực thấp) MDA5 : Melanoma differentiation antigen 5 MDCK : Madin-Darby Canine Kidney cell (Tế bào thận chó Madin-Darby) MEM : Mminimum essential medium (Môi trường thiết yếu tối thiểu) mM : Milimolar mRNA : Messenger RNA (RNA thông tin) mRT-PCR : Multiplex reverse transcription - polymerase chain reaction NA : Neuraminidase NASBA : Nucleic acid sequence-based amplification NCBI : National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Quốc gia về thông tin công nghệ sinh học của Hoa kỳ) NEP : Nuclear export protein (Protein xuất nhân) ng : Nanogram nm : Nanometer NLS : Nuclear located signal (Tín hiệu hướng nhân) NP : Nucleoprotein NPV : Negative predictive value (Giá trị tiên đoán âm) NT : Nghiệm thức OD : Optical density (Mật độ quang) OIE : World organisation for animal health (Tổ chức Thú y Thế giới) PCR : Polymerase chain reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi) PFU : Plaque forming unit (Đơn vị hình thành vệt tan) PPV : Positive predictive value (Giá trị tiên đoán dương) RBC : Red blood cell (Tế bào hồng cầu) Real-time PCR : Real – time polymerase chain reaction rRT-PCR : Real – time reverse – transcription polymerase chain Reaction RIDT : Rapid influenza diagnostic test RIG-I : Rectinoic acid inducible gene - I RNA : Ribonucleic acid RNP : Ribonucleoprotein rpm : Round per minute (Vòng/phút) RT-PCR : Reverse transcription - polymerase chain reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi kết hợp phiên mã ngược) SDS : Sodium dodecyl sulfate S.O.C : Super optinal broth with catabolic repressor (Môi trường giàu dinh dưỡng) ssDNA : Single-stranded DNA (DNA mạch đơ n) Ta : Annealing temperature (Nhiệt độ bắt cặp) TCID 50 : 50% tissue culture infectious dose (Liều xâm nhiễm 50% tế bào nuôi cấy) TEMED : Tetramethylethylenediamine Tm : Melting temperature (Nhiệt độ tan chảy) TN : True negative (Âm tính thực) TP : True positive (Dương tính thực) UV : Ultraviolet (Tia cực tím) vRNA : Viral RNA (RNA của virút) vRNP : Viral ribonucleoprotein (Ribonucleoprotein của virút) WHO : World Health Organization (Tổ chức Y tế Thế giới) μg : Microgram μl : Microliter μM : Micromolar [...]... nhà khoa học đã xác định virút cúm A đại dịch H1N1/ 2009 là kết quả tái tổ hợp c a bốn dòng virút (quadruple reassortants): virút cúm heo thường (classical swine), virút cúm gia cầm Bắc Mỹ (North American avian), virút cúm người H3N2 và virút cúm heo dòng Á – Âu (Eurasian avian-like swine) Cụ thể, vào cuối thập niên 1990, sự tái tổ hợp c a ba dòng virút: human H3N2, North American avian và classical swine... ng a ổ dịch có thể xảy ra trong khu vực Mục tiêu đề tài: 1 Nghiên cứu xây dựng qui trình tạo kít chẩn đoán virút cúm đại dịch A/ H1N1- 2009 bằng kỹ thuật RT-PCR 2 Sản xuất bộ kít chẩn đoán d a trên qui trình v a được tạo ra ở trên ~2~ Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình dịch tễ virút cúm đại dịch A/ H1N1- 2009 1.1.1 Tình hình thế giới Đại dịch cúm do virút cúm A/ H1N1 2009 là đại dịch đầu tiên c a. .. rộng rãi nhất trong chẩn đoán virút cúm ở nhiều quốc gia Tuy nhiên giá thành c a các bộ kit thương mại hiện nay là một trong những khó khăn c a các nước đang phát ~1~ triển Việc sử dụng các test nhanh trong chẩn đoán virút cúm đại dịch A/ H1N1- 2009 cũng đang gặp nhiều tranh cãi do tính chính xác c a nó Do đó các phương pháp chẩn đoán phân tử hiện được l a chọn để phát hiện virút cúm đại dịch 2009 Phương... swine hình thành dòng virút cúm heo H1N2 (triple reassortant H1N2) và virút cúm H3N2, đồng thời cùng lưu hành trong quần thể heo ở Bắc Mỹ Sau đó, dòng virút cúm heo H1N2 triple này lại tái tổ hợp với virút cúm heo dòng Á – Âu tạo ra dòng virút đại dịch H1N1- 2009 ngày nay [34] Virút cúm A đại dịch H1N1- 2009 sở hữu gene PB2 và PA từ dòng virút cúm gia cầm Bắc Mỹ, gene PB1 từ dòng cúm người H3N2, gene... axít amin mang tính bazơ được xem như là những “yếu tố cơ bản” (universal determinants) xác định về độc tính virút cúm [34] ~ 16 ~ Khi phân tích trình tự ở quy mô lớn (large-scale), các nhà khoa học thấy bốn axít amin tại ph a đầu Carboxy (C-terminal) c a NS1 hình thành PDZ ligand domain motif Việc chuyển các PDZ ligand domain c a chủng H5N1 độc lực cao hoặc c a chủng H1N1 đại dịch 1918 vào một chủng virút. .. và gia cầm mã h a một protein thứ hai là PB1-F2 Độ dài protein PB1-F2 c a các chủng virút cúm heo khác nhau và tùy thuộc vào nguồn gốc c a chúng Virút cúm heo truyền thống (classical swine) có đoạn PB1-F2 dài khoảng 8-11 axít amin, trong khi cúm heo có nguồn gốc từ gia cầm dòng Á-Âu (Eurasian avian-like swine virus) sở hữu đầy đủ chiều dài đoạn PB1-F2 khoảng 87-89 axít amin Virút cúm đại dịch H1N1/ 2009... ng a sự lan tràn dịch bệnh trong cộng đồng Ngoài ra, trong các đợt bùng phát dịch cúm, có thể dùng test kit chẩn đoán nhanh để sàng lọc bệnh nhân Một số kít chẩn đoán nhanh: Quick Vue Influenza Test, Quick Vue Influenza A+ B Test (Quidel), 3MTM Rapid Detection Flu A+ B Test ( 3M), Directigen EZ Flu A+ B (Becton-Dickinson), BinaxNOW Influenza A& B (Inverness), OSOM®Influenza A& B (Genzyme), SAS FluAlert (SA... thứ ba với tỉ lệ tử vong tương tự (2,5%) đã lan nhanh trên toàn thế giới năm 1919 Tuy virút cúm Tây Ban Nha” đã không được phân lập trong suốt hai năm gây đại dịch 1918-1919, nhưng trình tự bộ gene c a virút này đã được giải mã và các nhà khoa học cũng phát hiện virút H1N1 này sở hữu một số axít amin trên nhiều protein giống với virút cúm người Virút cúm Tây Ban Nha không có nhiều axít amin mang tính... cảnh báo đại dịch cúm A/ H1N1 ở mức 4 Đây là mức chỉ sự lan truyền từ người sang người c a chủng virút cúm động vật hay chủng virút cúm tái tổ hợp WHO tiếp tục tăng mức độ báo động đại dịch cúm A/ H1N1 lên mức 5 vào ngày 29/4, mức báo động cho thấy mức độ ảnh hưởng và lan rộng c a virút cúm từ hai quốc gia trở lên trong cùng một vùng đ a lý Hình 1.1 Bản đồ phân bố số ca mắc và tử vong do cúm đại dịch 2009... amin mang tính bazơ tại vị trí phân cắt trên protein HA (multibasic HA cleavage site) – một trong số các tiêu chuẩn cho tính độc lực cao c a cúm gia cầm [34] Bằng kỹ thuật di truyền ngược các nhà khoa học đã tái tạo ra virút cúm Tây Ban Nha” hoàn chỉnh cùng với những nghiên cứu trên chuột (mice) [22] và động vật linh trưởng (primates) [24] cho thấy chủng virút cúm này có khả năng gây ra những đáp ứng . Kilobasepairs (~1000bp) LB : Luria Bertani medium (Môi trường LB) LPAI : Low pathogenic avian influenza (Cúm gia cầm độc lực thấp) MDA5 : Melanoma differentiation antigen 5 MDCK : Madin-Darby. transcription - polymerase chain reaction NA : Neuraminidase NASBA : Nucleic acid sequence-based amplification NCBI : National Center for Biotechnology Information (Trung tâm Quốc gia. Ethylene-Di-amine-Tetra-acetic acid EIA : Enzyme immuno assay ER : Endoplasmic reticulum (Lưới nội chất) FAO : Food and Agriculture Organization (Tổ chức Lương – Nông Thế giới) FBS : Fetal bovine