Đang tải... (xem toàn văn)
MỞ ĐẦUNhững nghiên cứu mở rộng về tế bào gốc người đã trở thành một lĩnh vực ngày càng nhận được sự quan tâm trong suốt một thập kỷ qua. Việc sử dụng tế bào gốc người đã cung cấp một công cụ hiệu quả và đa dạng các phương pháp điều trị một số bệnh trong y học. Một nỗ lực là việc tìm kiếm tế bào gốc đa tiềm năng trong các mô trưởng thành và tránh vấn đề về đạo đức cũng như là vấn đề tạo khối u khi sử dụng tế bào gốc phôi người. Một loại tế bào gốc đa tiềm năng là tế bào gốc trung mô đã trở thành ứng viên cho một số ứng dụng trong liệu pháp thay thế và sửa chữa tế bào cũng như công nghệ mô trong y học tái tạo nhờ vào tiềm năng biệt hóa đa dạng của nó. Tế bào gốc trung mô (Mesenchymal stem cells – MSCs) là tế bào có khả năng tăng sinh và biệt hóa thành nhiều dòng tế bào trung mô khác nhau bao gồm tế bào mỡ, xương, sụn và gân. Hơn thế, các nhà khoa học còn tìm ra được điều kiện cảm ứng đặc hiệu để biệt hóa MSCs thành các dòng tế bào không phải trung mô như tế bào gan, thận, cơ tim, thần kinh. MSCs có thể được phân lập và nhân lên trong điều kiện ex vivo mà không làm thay đổi đáng kể về kiểu hình và đặc tính của chúng.Trước đây, tủy xương là nguồn chính để phân lập MSCs cho nghiên cứu trong phòng thí nghiệm cũng như lâm sàng. Tuy nhiên, phân lập MSCs từ tủy xương gặp một số hạn chế nhất định. Do đó, các nhà khoa học đã và đang tiến hành tìm kiếm các nguồn phân lập MSCs thay thế. Ngoài tủy xương, MSCs có thể được phân lập từ các nguồn như: một số cơ quan và máu của bào thai trước sinh, dịch ối và dây rốn. Trong đó, dây rốn là nguồn phân lập MSCs có tiềm năng nhất vì đã khắc phục được các hạn chế gặp phải khi phân lập MSCs từ tủy xương. Hơn thế, dây rốn là nguồn cung cấp MSCs rất dồi dào và luôn sẵn có vì chúng là rác thải sinh học sau khi em bé ra đời.MSCs có thể được phân lập từ các nguồn khác nhau trong dây rốn, đó là máu, Wharton’s jelly (lớp mô đệm của dây rốn), màng lót và lớp nội mô tĩnh mạch dây rốn. Trong số đó, phân lập MSCs từ tĩnh mạch dây rốn là hướng đi mới nhất và đang được nghiên cứu rộng rãi. MSC được phân lập từ các nguồn khác nhau không đại diện cho một quần thể tế bào đồng nhất. Hiện nay, vẫn chưa có cách nào đơn giản để xác định MSC bằng một dấu hiêu đơn nhất. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Đánh giá sự thuần nhất của quần thể tế bào gốc trung mô được phân lập từ lớp lót trong tĩnh mạch dây rốn trẻ sơ sinh trong nuôi cấy in vitro“ nhằm đánh giá sự biểu hiện các marker bề mặt của MSC trong từng giai đoạn nuôi cấy từ đó chủ động nguồn tế bào gốc trung mô phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo.
LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc đến cố GS.TS Nguyễn Mộng Hùng, ngun Trưởng phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật – Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống Thày người đặt móng cho phát triển phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật để ngày hôm học tập nghiên cứu khoa học cách tốt Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Lai Thành ThS Đặng Văn Đức, người thầy tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm làm việc từ bước vao nghiên cứu khoa học Trong q trình làm việc, thầy ln theo sát, hướng dẫn tận tình đưa lời nhận xét, góp ý q báu để tơi thực tốt nghiên cứu Tơi xin chân thành cám ơn tập thể cán khoa D2, bệnh viện Phụ Sản Hà Nội Viện Huyết học Truyền máu Trung ương tạo điều kiện giúp đỡ để tơi có điều kiện tốt trình thực nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới thầy cô giáo công tác môn Tế bào – Mô phôi Lý sinh thày cô Khoa Sinh học truyền đạt cho kiến thức sở để tơi thực khóa luận tốt nghiệp vận dụng cơng việc sau Ngồi ra, tơi cịn phải gửi lời cảm ơn đến anh, chị, bạn em sinh viên học tập cơng tác phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật – người nhiệt tình giúp đỡ, hỗ trợ công việc học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè người thân quan tâm, động viên tinh thần suốt trình học tập thực khóa luận tốt nghiệp Cuối cùng, nghiên cứu thực dựa kinh phí đề tài nhánh cấp nhà nước: “Nghiên cứu phân lập, nhân nuôi tế bào gốc MSC mạch máu dây rốn trẻ sơ sinh tế bào gốc phôi chuột Theo dõi tế bào gốc thể nhận điều trị bệnh suy tủy sau chiếu xạ liều cận chết động vật thí nghiệm”, mã số KC.04.01/06–10 TS Nguyễn Lai Thành làm chủ nhiệm đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn Bộ Khoa học Công nghệ Ban Chủ nhiệm đề tài KC–04.04/06–10 Hà Nội, tháng năm 2011 Nguyễn Hồng Trường Khóa luận tốt nghiệp 2011 Danh mục viết tắt DANH MỤC VIẾT TẮT Từ viết tắt BMP CD Viết đầy đủ Bone morphogenetic protein Cluster of differentiation CFU–F Fibroblastic colony forming unit DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium EDTA Ethylenediaminetetraacetic Acid FBS Fetal bovine serum MAPC Multipotent adult progenitor cell MHC Major histocompatibility complex MPC Mesodermal progenitor cell MSC Mesenchymal stem cell PBS Phosphate buffer saline TGF Transforming growth factor UV–MSC VEGF Nguyễn Hồng Trường Umbilical vein derived mesenchymal stem cell Vascular endothelial growth factor K52A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2011 Mục lục MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ 1.1.1 Định nghĩa tế bào gốc trung mô .3 1.1.2 Lịch sử nghiên cứu tế bào gốc trung mô 1.1.3 Các nguồn thu nhận MSC .5 1.1.4 Các đặc điểm MSC 1.1.4.1 Khả tự đổi 1.1.4.2 Chỉ thị bề mặt MSC 1.1.4.3 Tiềm biệt hóa MSC 1.1.5 Ứng dụng tế bào gốc trung mô 12 1.1.5.1 Các bệnh tim .12 1.1.5.2 Các bệnh xương 12 1.1.5.3 Các bệnh sụn 13 1.1.5.4 Các bệnh gân 13 1.1.5.5 Các bệnh thần kinh .14 1.1.5.6 Điều trị bỏng tái tạo da .14 1.1.6 Nghiên cứu MSC Việt Nam 14 1.2 TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ TĨNH MẠCH DÂY RỐN 15 1.2.1 Cấu trúc dây rốn 15 1.2.2 Tế bào gốc trung mô từ tĩnh mạch dây rốn 16 1.3 FLOW CYTOMETRY VÀ ÚNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH DI TRUYỀN TẾ BÀO 18 1.3.1 Lịch sử nghiên cứu Flow cytometry .18 1.3.2 Hệ thống Flow cytometry nguyên tắc hoạt động .20 CHƯƠNG 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .22 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 22 2.2 NGUYÊN VẬT LIỆU, VẬT TƯ, THIẾT BỊ 22 2.2.1 Dụng cụ vật tư tiêu hao 22 Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2011 Mục lục 2.2.2 Thiết bị nghiên cứu .23 2.2.3 Hóa chất 24 2.2.3.1 Môi trường nuôi cấy tế bào .25 2.2.3.2 Các dung dịch Enzyme 25 2.2.3.3 Các dung dịch khác 25 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.3.1 Quy trình thí nghiệm .26 2.3.2 Thu nhận dây rốn 26 2.3.3 Phân lập MSC từ lớp lót tĩnh mạch dây rốn 26 2.3.4 Phương pháp phủ gelatin lên bề mặt nuôi cấy .29 2.3.5 Phương pháp nuôi cấy chọn lọc MSC 29 2.3.6 Phương pháp cấy chuyển tế bào 30 2.3.7 Phương pháp phân tích tế bào Flow Cytometry 30 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .31 3.1 KẾT QUẢ NUÔI CẤY VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ THUẦN NHẤT CỦA QUẦN THỂ TẾ BÀO NUÔI CẤY NGUYÊN PHÁT .31 3.1.1 Kết phân lập đánh giá độ quần thể tế bào phân lập 31 3.1.2 Kết nuôi cấy chọn lọc quần thể tế bào 34 3.2 KẾT QUẢ NUÔI CẤY VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ THUẦN NHẤT CỦA QUẦN THỂ TẾ BÀO NUÔI CẤY THỨ PHÁT 36 3.2.1 Kết nuôi cấy đánh giá độ quần thể tế bào sau lần cấy chuyển thứ (16 ngày) 36 3.2.2 Kết đánh giá chất lượng quần thể tế bào gốc trung mô sau thời gian nuôi cấy lâu dài in vitro (40 ngày) 38 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 KẾT LUẬN 40 KIẾN NGHỊ 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2011 Danh mục hình minh họa DANH MỤC HÌNH MINH HỌA Hình Khả tự đổi MSC Hình Tiềm biệt hóa MSC 10 Hình Những giải thích cho tính mềm dẻo tế bào gốc .11 Hình Cấu tạo dây rốn .16 Hình Sơ đồ máy Flow cytometry điển hình .21 Hình Dây rốn trẻ sơ sinh thu nhận từ bệnh viện Phụ sản Hà Nội 22 Hình Sơ đồ tóm tắt quy trình thí nghiệm .26 Hình Rửa bề mặt dây rốn dung dịch muối Ringer 27 Hình Bơm Collagenase vào tĩnh mạch dây rốn 28 Hình 10 Ủ dây rốn dung dịch Ringer 370C 28 Hình 11 Mát – xa dây rốn 29 Hình 12 Tế bào ngày ni cấy in vitro sau phân lập 32 Hình 13 Kết phân tích quần thể tế bào phân lập từ lớp lót tĩnh mạch phương pháp dòng chảy tế bào .33 Hình 14 Tế bào sau ngày ni cấy chọn lọc dịng tế bào gốc .35 Hình 15 Tế bào sau 14 ngày ni cấy chọn lọc dịng tế bào gốc 36 Hình 16 Quần lạc tế bào gốc trung mô sau 16 ngày ni cấy 37 Hình 17 Kết phân tích quần thể tế bào sau 16 ngày ni cấy chọn lọc 37 Hình 18 Quần lạc tế bào gốc trung mô sau 40 ngày nuôi cấy 38 Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2011 Danh mục hình minh họa Hình 19 Kết phân tích quần thể tế bào sau 40 ngày nuôi cấy chọn lọc 39 Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2011 Danh mục bảng DANH MỤC BẢNG Bảng Dữ liệu biểu thị bề mặt MSC Bảng Lịch sử phát triển Flow cytometry 18 Bảng Dụng cụ vật tư tiêu hao sử dụng đề tài 22 Bảng Các thiết bị nghiên cứu sử dụng đề tài .23 Bảng Các hóa chất sử dụng đề tài .24 Bảng Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào 25 Bảng Nồng độ dung dịch enzyme .25 Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2011 Mở đầu MỞ ĐẦU Những nghiên cứu mở rộng tế bào gốc người trở thành lĩnh vực ngày nhận quan tâm suốt thập kỷ qua Việc sử dụng tế bào gốc người cung cấp công cụ hiệu đa dạng phương pháp điều trị số bệnh y học Một nỗ lực việc tìm kiếm tế bào gốc đa tiềm mô trưởng thành tránh vấn đề đạo đức vấn đề tạo khối u sử dụng tế bào gốc phôi người Một loại tế bào gốc đa tiềm tế bào gốc trung mô trở thành ứng viên cho số ứng dụng liệu pháp thay sửa chữa tế bào công nghệ mô y học tái tạo nhờ vào tiềm biệt hóa đa dạng Tế bào gốc trung mơ (Mesenchymal stem cells – MSCs) tế bào có khả tăng sinh biệt hóa thành nhiều dịng tế bào trung mô khác bao gồm tế bào mỡ, xương, sụn gân Hơn thế, nhà khoa học cịn tìm điều kiện cảm ứng đặc hiệu để biệt hóa MSCs thành dịng tế bào khơng phải trung mô tế bào gan, thận, tim, thần kinh MSCs phân lập nhân lên điều kiện ex vivo mà không làm thay đổi đáng kể kiểu hình đặc tính chúng Trước đây, tủy xương nguồn để phân lập MSCs cho nghiên cứu phịng thí nghiệm lâm sàng Tuy nhiên, phân lập MSCs từ tủy xương gặp số hạn chế định Do đó, nhà khoa học tiến hành tìm kiếm nguồn phân lập MSCs thay Ngoài tủy xương, MSCs phân lập từ nguồn như: số quan máu bào thai trước sinh, dịch ối dây rốn Trong đó, dây rốn nguồn phân lập MSCs có tiềm khắc phục hạn chế gặp phải phân lập MSCs từ tủy xương Hơn thế, dây rốn nguồn cung cấp MSCs dồi ln sẵn có chúng rác thải sinh học sau em bé đời MSCs phân lập từ nguồn khác dây rốn, máu, Wharton’s jelly (lớp mơ đệm dây rốn), màng lót lớp nội mơ tĩnh mạch dây rốn Trong số đó, phân lập MSCs từ tĩnh mạch dây rốn hướng nghiên cứu rộng rãi MSC phân lập từ nguồn khác không đại diện cho quần thể tế bào đồng Hiện nay, chưa có cách đơn giản để xác định MSC dấu hiêu đơn Trên sở đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu “Đánh giá Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2011 Mở đầu quần thể tế bào gốc trung mô phân lập từ lớp lót tĩnh mạch dây rốn trẻ sơ sinh nuôi cấy in vitro“ nhằm đánh giá biểu marker bề mặt MSC giai đoạn ni cấy từ chủ động nguồn tế bào gốc trung mô phục vụ cho nghiên cứu Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2011 Chương – Tổng quan CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ 1.1.1 Định nghĩa tế bào gốc trung mô Tổng hợp từ kết nghiên cứu trước đó, Soufiane Ghannam đưa ba tiêu chuẩn sau để định nghĩa MSC [27]: • • • Là quần thể tế bào tăng sinh in vitro, bám dính vào bề mặt nhựa, có khả phát triển thành quần lạc dạng nguyên bào sợi Không biểu thị bề mặt CD11b, CD14, CD34, CD45 biểu CD73, CD90, CD105 Có khả biệt hóa thành nhiều loại tế bào trung mơ có nguồn gốc khác gồm xương, mỡ, sụn 1.1.2 Lịch sử nghiên cứu tế bào gốc trung mô “Trung mô” thuật ngữ để mô liên kết thưa phát triển phơi, chủ yếu bắt nguồn từ trung bì, tạo phần lớn tế bào mô liên kết thể trưởng thành Định nghĩa thường mở rộng để bao hàm tế bào mô liên kết mô trưởng thành mô nguyên bào sợi (cơ), xương, sụn, mỡ, dây chằng,… [51] Sự xuất tế bào tiền trung mô ghi nhận từ cuối kỷ 19 với nghiên cứu Goujon năm 1869, ông người mô tả tiềm biệt hóa thành xương cấy ghép lệch vị trí tủy xương thỏ, sau xác nhận thí nghiệm cấy ghép Biakow năm 1870 Năm 1960, Danis chứng minh rõ ràng tồn tế bào tủy xương tạo thành xương khơng phải tế bào cảm ứng, hay hấp dẫn hóa học cho tế bào xương Tiềm tạo xương tủy xương chứng minh thí nghiệm cấy ghép tế bào tủy xương lên vị trí khác thể Phân tích mơ học vị trí cấy ghép cho thấy có hình thành mơ mang chất xương tủy xương, mô hỗ trợ cho q trình tạo máu thể nhận Người ta tiến hành thí nghiệm cấy ghép tương tự sử dụng ống khuếch tán gồm màng bán thấm ngăn vòng nhựa để ngăn cản qua tế bào cho tế bào từ thể nhận qua Những ống có chứa mẫu tủy xương dịch huyền phù tế bào tủy xương cấy ghép Thí nghiệm cho thấy hình thành Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2011 Chương – Kết thảo luận kết không đặc hiệu ủ với kháng thể kháng IgG chuột (kết hiện) Tỷ lệ tế bào dương tính với CD34 cao, chiếm 45,6% Đây marker tế bào gốc dòng máu, nhiên, tế bào nội mô mạch máu dây rốn phân lập biểu marker [6, 31] Điều cho thấy diện tế bào nội mô quần thể tế bào sau phân lập cao Để định lượng xác tỷ lệ quần thể tế bào nội mô ta cần phải sử dụng thêm marker dương tính với chúng Tuy nhiên nghiên cứu tập trung vào loại tế bào có tiềm ứng dụng cao tế bào gốc trung mô Đối với marker dương tính với tế bào gốc trung mơ CD73, CD90 tỷ lệ chiếm (71%) (15,1%) Trong tỷ lệ tế bào dương tính với với CD73 cao CD90 lại thấp Như có quần thể tế bào biểu CD73 không biểu CD90 Chính đặc điểm mà xác định đặc tính dịng tế bào người ta kết hợp nhiểu marker Kết hợp với kết phân tích biểu CD90, chúng tơi khẳng định MSC chiếm tỷ lệ thấp quần thể tế bào giai đoạn hỗn tạp nhiều loại tế bào khác Để nghiên cứu thay đổi tỷ lệ MSC quần thể tiến hành ni cấy chọn lọc tiếp tục phân tích Flow cytometry 3.1.2 Kết nuôi cấy chọn lọc quần thể tế bào Do mơi trường ni cấy khơng có VEGF (là nhân tố sinh trưởng kích thích tăng sinh tế bào nội mô) nên tế bào nội mô đĩa nuôi cấy chết khoảng từ đến 14 ngày Sau khoảng tuần, thấy tế bào gốc trung mô xuất rõ ràng hơn, với số lượng lớn so với lúc ban đầu, số lượng tế bào nội mơ giảm rõ rệt Có thể dễ dàng nhận thấy tế bào thuôn dài, có hình dạng giống ngun bào sợi chiếm phát triển mạnh chiếm ưu Trong quần thể tế bào nội mơ có hình dạng đa giác lại nhỏ giảm dần thành đảo tế bào (Hình 14) Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2011 Chương – Kết thảo luận Hình 14 Tế bào sau ngày ni cấy chọn lọc dòng tế bào gốc Các tế bào gốc trung mơ (có dạng thn dài, hình dạng giống nguyên bào sợi) xuất rõ ràng hơn, với số lượng lớn Trong tế bào nội mơ (có hình dạng đa giác nhỏ) giảm rõ rệt thành đảo tế bào Độ phóng đại 5x10 Sau tuần nuôi cấy, điều kiện nhân tố sinh trưởng VEGF, tế bào nội mơ gần biến hồn tồn, cịn lại tế bào có hình dạng giống ngun bào sợi sống sót, tăng sinh hình thành quần lạc (colony) Lúc này, tế bào gốc trung mơ có tiềm sinh sản lớn, tăng sinh nhanh so với giai đoạn ngày sau phân lập Chúng phát triển tạo thành mảng song song với lớp cuộn xoắn gối lên (Hình 15) Khi tế bào đạt đến độ bao phủ 80%, tiến hành cấy chuyển Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2011 Chương – Kết thảo luận Hình 15 Tế bào sau 14 ngày ni cấy chọn lọc dịng tế bào gốc Tế bào nội mơ gần biến hồn tồn, cịn lại tế bào gốc trung mơ sống sót, tăng sinh hình thành quần lạc Lúc này, tế bào gốc trung mô tăng sinh nhanh, tạo thành mảng song song với lớp cuộn xoắn gối lên Độ phóng đại 5x10 3.2 KẾT QUẢ NI CẤY VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ THUẦN NHẤT CỦA QUẦN THỂ TẾ BÀO NI CẤY THỨ PHÁT 3.2.1 Kết ni cấy đánh giá độ quần thể tế bào sau lần cấy chuyển thứ (16 ngày) Sau lần cấy chuyển thứ (sang tuần thứ ba), tế bào nội mơ biến mất, khó tìm thấy chúng thời gian Như vậy, sau hai tuần nuôi cấy chọn lọc tế bào gốc trung mô có hình dạng giống ngun bào sợi, có tiềm tăng sinh từ quần thể tế bào hỗn hợp ban đầu (Hình 16) Tiếp tục tiến hành đánh giá độ quần thể tế bào sau 16 ngày ni cấy chọn lọc Flow cytometry (Hình 17), thấy giai đoạn tỷ lệ tế bào âm tính với CD34 tăng lên cao (96,7%) Với marker dương tính với tế bào gốc trung mơ CD90 CD73 tỷ lệ tế bào dương tính với marker gần tuyệt đối, 99,5% 95,6% Như nói quần thể tế bào sau 16 ngày nuôi cấy chọn lọc tế bào gốc trung mơ có độ cao Quần thể tế bào giai đoạn sử dụng vào nghiên cứu sau thử nghiệm biệt hóa, cấy ghép nghiên cứu khác Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2011 Chương – Kết thảo luận Hình 16 Quần lạc tế bào gốc trung mô sau 16 ngày nuôi cấy Tế bào nội mô biến mất, khó tìm thấy chúng thời gian Tế bào gốc trung mô chọn lọc từ quần thể tế bào hỗn hợp ban đầu có hình dạng giống ngun bào sợi, có tiềm tăng sinh Độ phóng đại 5x10 Hình 17 Kết phân tích quần thể tế bào sau 16 ngày nuôi cấy chọn lọc Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2011 Chương – Kết thảo luận 3.2.2 Kết đánh giá chất lượng quần thể tế bào gốc trung mô sau thời gian nuôi cấy lâu dài in vitro (40 ngày) Các nghiên cứu tế bào gốc trung mô chứng minh quần thể tế bào gốc trung mô thu nhận từ dây rốn có khẳ trì từ đến 20 lần cấy chuyển với khoảng 20 đến 50 lần nhân đôi quần thể giữ đặc tính đặc trưng dịng tế bào gốc Trong nghiên cứu tiến hành chứng minh quần thể tế bào gốc trung mô phân lập từ lớp lót tĩnh mạch dây rốn có khả trì nhân lên lâu dài phịng thí nghiệm mà giữ đặc điểm hình thái, khả tăng sinh biểu số marker đặc trưng Sau khoảng 40 ngày nuôi cấy với lần cấy chuyển khoảng 20 lần nhân đôi quần thể, nhận thấy tế bào gốc trung mơ trì hình thái đặc trưng khả tăng sinh Bằng chứng chúng có hình thái dài, thn nhọn hai đầu sinh trưởng thành quần lạc đạt mật độ cao Về khả tăng sinh, chúng trì thời gian cấy chuyển 2–3 lần ngày tùy thuộc vào mật độ lần cấy chuyển (Hình 18) Hình 18 Quần lạc tế bào gốc trung mô sau 40 ngày nuôi cấy Sau khoảng 40 ngày nuôi cấy, lần cấy chuyển với khoảng 20 lần nhân đôi quần thể, tế bào gốc trung mơ trì hình thái đặc trưng khả tăng sinh Chúng có hình thái dài, thuôn nhọn hai đầu sinh trưởng thành quần lạc đạt mật độ cao Độ phóng đại 5x10 Như quần thể tế bào gốc trung mơ trì sau 40 ngày ni cấy khơng thay đổi hình thái khả tăng sinh Để chứng minh MSC không thay Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2011 Chương – Kết thảo luận đổi biểu marker đặc trưng sau thời gian nuôi cấy lâu dài in vitro tiếp tục tiến hành đánh giá khả biểu CD90 CD73 Marker CD34 sử dụng nhằm loại bỏ khả cịn sót lại tế bào nội mơ Kết phân tích Flow Cytometry minh họa Hình 19 Tỷ lệ tế bào dương tính với CD34 khơng đáng kể (1,7%) Lượng tế bào dương tính với CD90 chiếm tới 99,5%, nghĩa gần tuyệt đại đa số tế bào dương tính với marker Với marker CD73, kết tương tự CD90 (99,2%) Kết chứng tỏ cao quần thể Như vậy, sau thời gian nuôi cấy lâu dài in vitro tế bào gốc trung mô giữ đặc tính hình thái, khả tăng sinh mạnh biểu marker đặc trưng Cho đến dòng tế bào chúng tơi trì đến 12 lần cấy chuyển với khoảng 36 lần nhân đôi quần thể mà chưa có dấu hiệu thay đổi hình thái khả nhân lên in vitro Hình 19 Kết phân tích quần thể tế bào sau 40 ngày ni cấy chọn lọc Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2011 Kết luận kiến nghị KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN • Đã phân lập ni cấy thành cơng MSC từ lớp lót tĩnh mạch dây rốn trẻ sơ sinh • Thu quần thể MSC có hình thái tương đối đồng sau 2–3 tuần nuôi cấy chọn lọc, quần thể âm tính với marker tế bào dịng máu CD34 dương tính với marker tế bào gốc trung mô CD90 CD73 với tỷ lệ cao • Duy trì quần thể MSC sau thời gian nuôi cấy lâu dài in vitro mà giữ đặc tính MSC KIẾN NGHỊ Từ kết thu được, đưa kiến nghị sau: • Tiếp tục theo dõi trì dịng tế bào gốc trung mơ phân lập qua lần cấy chuyển • Thử nghiệm biệt hóa MSC thành tế bào chun hóa để chứng minh tính đa tiềm chúng • Thử nghiệm chuyển gen trị liệu số bệnh vào MSC tiến hành cấy ghép mơ hình động vật Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2011 Tài liệu tham khảo TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, Trương Định (2009), Công nghệ Tế bào gốc, NXB Giáo dục Việt Nam Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, Trần Lê Bảo Hà (2007), Thu nhận biệt hóa tế bào gốc trung mô từ máu dây rốn người, ĐH Quốc gia TP.HCM, 10(12), trang 05–10 Mai Mạnh Tuấn, Chu Quốc Trường, Trần Thanh Loan, Bùi Thị Nga, Nguyễn Thông, Phan Toàn Thắng (2007), “Kết bước đầu sử dụng tế bào gốc trung mô dây rốn điều trị vết thương”, TC Nghiên cứu y dược học cổ truyền Việt Nam, 18, trang 27–33 Phạm Thúy Trinh, Trương Định, Trương Thị Thu Huyền, Phạm Văn Phúc, Đỗ Minh Trung, Lê Văn Đông (2010), “Nghiên cứu phân lập tế bào gốc trung mô từ màng dây rốn trẻ sơ sinh”, Tạp trí Thơng tin Y dược, trang 1–6 Tài liệu tiếng Anh Barry F.P and Murphy J.M (2004), “Mesenchymal stem cells: clinical applications and biological characterization”, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 36 (4), pp 568–584 Baudin B., Bruneel A., Bosselut N., and Vaubourdolle M (2007), “A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells”, Nat Protocols, (3), pp 481–485 Bianchi G., Banfi A., et al (2003), “Ex vivo enrichment of mesenchymal cell progenitors by fibroblast growth factor 2”, Experimental Cell Research, 287 (1), pp 98–105 Bigos M., Baumgarth N., and Jager G.C (1999), “Nine color eleven parameter immunophenotyping using three laser Flow cytometry”, Cytometry, 36, pp 36– 45 Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2011 Tài liệu tham khảo Bobis S., Jarocha D., and Majka M (2006), “Mesenchymal stem cells: characteristics and clinical applications.” Folia Histochem Cytobio, 44 (4), pp 215–230 10 Brunsting A and Mullaney P.F (1994), “Differential light scattering from mammalian cells”, Biophys J, 14, pp 439–453 11 Campagnoli C., Roberts I.A.G., Kumar S., Bennett P.R., Bellantuono I., and Fisk N.M (2001), “Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first–trimester fetal blood, liver, and bone marrow”, Blood, 98 (8), pp 2396–2402 12 Caplan A.I (2007), “Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine”, Journal of Cellular Physiology, 213 (2), pp 341–347 13 Chopp M and Li Y (2002), “Treatment of neural injury with marrow stromal cells”, The Lancet Neurology, (2), pp 92–100 14 Colter D.C., Sekiya I., and Prockop D.J (2001), “Identification of a subpopulation of rapidly self–renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells”, Proceedings of the National Academy of Sciences, 98 (14), pp 7841–7845 15 Conget P.A and Minguell J.J (1999), “Phenotypical and functional properties of human bone marrow mesenchymal progenitor cells”, Journal of Cellular Physiology, 181 (1), pp 67–73 16 Coulter W.H (1956), “High speed automatic blood cell counter and analyzer”, Proc Natl Electronics Conf, 12, pp 1034–1040 17 Covas D., Siufi J., Silva A., and Orellana M (2003), “Isolation and culture of umbilical vein mesenchymal stem cells.” Braz J Med Biol Res, 36 (9), pp 1179– 1183 18 Crosland–Taylor P.J (1953), “A device for counting small particles suspended in a fluid through a tube”, Nature, 171, pp 37–38 Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2011 19 Tài liệu tham khảo Dennis J., Carbillet J., Caplan A., and Charbord P (2002), “The STRO–1+ marrow cell population is multipotential”, Cells Tissues Organs, 170 (2–3), pp 73–82 20 Eric E Jaffe R.L.N., G.Becker C., and Minick C.R (1973), “Culture of human endothelial cells derived from umbilical vein”, Journal of clinical investigation, 52, pp 235–242 21 Erices A., Conget P., and Minguell J.J (2000), “Mesenchymal progenitor cells in human umbilical cord blood”, British Journal of Haematology, 109 (1), pp 235–242 22 Fibbe W.E and Noort W.A (2003), “Mesenchymal Stem Cells and Hematopoietic Stem Cell Transplantation”, Annals of the New York Academy of Sciences, 996 (1), pp 235–244 23 Fisher J.P., Sémont A., et al (2007), “Mesenchymal Stem Cells Increase Self– Renewal of Small Intestinal Epithelium and Accelerate Structural Recovery after Radiation Injury”, in Tissue Engineering, Springer US, pp 19–30 24 Friedenstein A.J., Piatetzky–Shapiro I.I., and Petrakova K.V (1966), “Osteogenesis in transplants of bone marrow cells”, Journal of Embryology and Experimental Morphology, 16 (3), pp 381–390 25 Fulwyler M.J (1965), “Electronic separation of biological cells by volume”, Science, 150, pp 910–912 26 Gelse K., Von Der Mark K., Aigner T., Park J., and Schneider H (2003), “Articular cartilage repair by gene therapy using growth factor–producing mesenchymal cells”, Arthritis & Rheumatism, 48 (2), pp 430–441 27 Ghannam S., Bouffi C., Djouad F., Jorgensen C., and Noël D (2010), “Immunosuppression by mesenchymal stem cells: mechanisms and clinical applications.” Stem Cell Res Ther, (1), pp 28 In 'T Anker P., Noort W., et al (2003), “Mesenchymal stem cells in human second–trimester bone marrow, liver, lung, and spleen exhibit a similar Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2011 Tài liệu tham khảo immunophenotype but a heterogeneous multilineage differentiation potential”, Haematologica, 88 (8), pp 845–851 29 In 'T Anker P.S., Scherjon S.A., et al (2004), “Isolation of Mesenchymal Stem Cells of Fetal or Maternal Origin from Human Placenta”, STEM CELLS, 22 (7), pp 1338–1345 30 Jiang Y., Jahagirdar B.N., et al (2002), “Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow”, Nature, 418 (6893), pp 41–49 31 Kadam S., Tiwari S., and Bhonde R (2009), “Simultaneous isolation of vascular endothelial cells and mesenchymal stem cells from the human umbilical cord”, In Vitro Cellular & Developmental Biology – Animal, 45 (1), pp 23–27– 27 32 Kadivar M., Khatami S., Mortazavi Y., Shokrgozar M.A., Taghikhani M., and Soleimani M (2006), “In vitro cardiomyogenic potential of human umbilical vein–derived mesenchymal stem cells”, Biochemical and Biophysical Research Communications, 340 (2), pp 639–647 33 Kamentsky L.A., Melamed M.R., and Derman H (1965), “Spectrophotometer: new instrument for ultrarapid cell analysis”, Science, 150, pp 630–631 34 Katz A.J., Tholpady A., Tholpady S.S., Shang H., and Ogle R.C (2005), “Cell Surface and Transcriptional Characterization of Human Adipose–Derived Adherent Stromal (hADAS) Cells”, STEM CELLS, 23 (3), pp 412–423 35 Kestendjieva S., Kyurkchiev D., et al (2008), “Characterization of mesenchymal stem cells isolated from the human umbilical cord”, Cell Biol Int., 32 (7), pp 724–732 36 Kim J., Kang J., et al (2009), “Biological characterization of long–term cultured human mesenchymal stem cells”, Archives of Pharmacal Research, 32 (1), pp 117–126–126 Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2011 37 Tài liệu tham khảo Levičar N., Habib N.A., Gordon M.Y., and Dimarakis I (2008), Stem cell repair and regeneration, The Hammersmith, ed 3, Vol 3, Imperial College Press pp.733–744 38 Majors A.K., Boehm C.A., Nitto H., Midura R.J., and Muschler G.F (1997), “Characterization of human bone marrow stromal cells with respect to osteoblastic differentiation”, Journal of Orthopaedic Research, 15 (4), pp 546– 557 39 Minguell J., Conget P., and Erices A (2000), “Biology and clinical utilization of mesenchymal progenitor cells”, Braz J Med Biol Res, 33 (8), pp 881–887 40 Nathan S., De S.D., Thambyah A., Fen C., Goh J., and Lee E.H (2003), “Cell– Based Therapy in the Repair of Osteochondral Defects: A Novel Use for Adipose Tissue”, Tissue Engineering, (4), pp 733–744 41 Payushina O., Domaratskaya E., and Starostin V (2006), “Mesenchymal stem cells: Sources, phenotype, and differentiation potential”, Biology Bulletin, 33 (1), pp 2–18–18 42 Pittenger M.F., Mackay A.M., et al (1999), “Multilineage Potential of Adult Human Mesenchymal Stem Cells”, Science, 284 (5411), pp 143–147 43 Pivoriunas A., Bernotiene E., Unguryte A., Valiuniene S., Drasutiene G., and Venalis A (2006), “Isolation and differentiation of mesenchymal–like cells from human umbilical cord vein endothelium and subendothelium”, BIOLOGLIA, 2, pp 99–103 44 Pomerance J (2002), Journal of Perinatology, Vol 22 pp.504–505 45 R Lanza R.L and Vacanti J (2007), Principles of tissue engineering, 3th edition, Academic press 46 Raff M (2003), “ADULT STEM CELL PLASTICITY: Fact or Artifact?” Annual Review of Cell and Developmental Biology, 19 (1), pp 1–22 Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2011 47 Tài liệu tham khảo Rebelatto C.K., Aguiar A.M., et al (2008), “Dissimilar Differentiation of Mesenchymal Stem Cells from Bone Marrow, Umbilical Cord Blood, and Adipose Tissue”, Experimental Biology and Medicine, 233 (7), pp 901–913 48 Reyes M., Lund T., Lenvik T., Aguiar D., Koodie L., and Verfaillie C.M (2001), “Purification and ex vivo expansion of postnatal human marrow mesodermal progenitor cells”, Blood, 98 (9), pp 2615–2625 49 Rhodes N., Srivastava J., Smith R., and Longinotti C (2004), “Heterogeneity in proliferative potential of ovine mesenchymal stem cell colonies”, Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 15 (4), pp 397–402–402 50 Romanov Y.A., Svintsitskaya V.A., and Smirnov V.N (2003), “Searching for Alternative Sources of Postnatal Human Mesenchymal Stem Cells: Candidate MSC–Like Cells from Umbilical Cord”, STEM CELLS, 21 (1), pp 105–110 51 Roufosse C.A., Direkze N.C., Otto W.R., and Wright N.A (2004), “Circulating mesenchymal stem cells”, The International Journal of Biochemistry & Cell Biology, 36 (4), pp 585–597 52 Sarugaser R., Hanoun L., Keating A., Stanford W.L., and Davies J.E (2009), “Human Mesenchymal Stem Cells Self–Renew and Differentiate According to a Deterministic Hierarchy”, PLoS ONE, (8), pp e6498 53 Song L and Tuan R.S (2004), “Transdifferentiation potential of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow”, The FASEB Journal 54 Thompson W (1967), “On a self–acting apparatus for multiplying and maintaining electric charges with applications to illustrate the voltaic theory”, Proc R Soc Lond, 16, pp 67–72 55 Toai T., Thao H., et al (2009), “In vitro culture and differentiation of osteoblasts from human umbilical cord blood”, Cell and Tissue Banking, 11 (3), pp 269–280–280 Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2011 56 Tài liệu tham khảo Tomita S., Li R.–K., et al (1999), “Autologous Transplantation of Bone Marrow Cells Improves Damaged Heart Function”, Circulation, 100 (90002), pp II–247–256 57 Tropel P., Noël D., Platet N., Legrand P., Benabid A.–L., and Berger F (2004), “Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from adult mouse bone marrow”, Experimental Cell Research, 295 (2), pp 395–406 58 Troyer D.L and Weiss M.L (2008), “Concise Review: Wharton's Jelly–Derived Cells Are a Primitive Stromal Cell Population”, STEM CELLS, 26 (3), pp 591– 599 59 Tsuchiya H., Kitoh H., Sugiura F., and Ishiguro N (2003), “Chondrogenesis enhanced by overexpression of sox9 gene in mouse bone marrow–derived mesenchymal stem cells”, Biochemical and Biophysical Research Communications, 301 (2), pp 338–343 60 Undale A.H., Westendorf J.J., Yaszemski M.J., and Khosla S (2009), “Mesenchymal Stem Cells for Bone Repair and Metabolic Bone Diseases”, Mayo Clinic Proceedings, 84 (10), pp 893–902 61 Van Beuningen H.M., Glansbeek H.L., Van Der Kraan P.M., and Van Den Berg W.B (1998), “Differential effects of local application of BMP–2 or TGF– [beta]1 on both articular cartilage composition and osteophyte formation”, Osteoarthritis and Cartilage, (5), pp 306–317 62 Verfaillie C.M (2002), “Adult stem cells: assessing the case for pluripotency”, Trends in Cell Biology, 12 (11), pp 502–508 63 Wagers A.J and Weissman I.L (2004), “Plasticity of Adult Stem Cells”, Cell, 116 (5), pp 639–648 64 Wagner W., Wein F., et al (2005), “Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood”, Experimental hematology, 33 (11), pp 1402–1416 Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2011 65 Tài liệu tham khảo Wakitani S., Goto T., et al (1994), “Mesenchymal cell–based repair of large, full–thickness defects of articular cartilage.” J Bone Joint Surg Am, 76 (4), pp 579–592 66 Wang J.–S., Shum–Tim D., Galipeau J., Chedrawy E., Eliopoulos N., and Chiu R.C.J (2000), “Marrow stromal cells for cellular cardiomyoplasty: Feasibility and potential clinical advantages”, The Journal of thoracic and cardiovascular surgery, 120 (5), pp 999–1006 67 Watson J.V (1999), “The early fluidic and optical physics of cytometry.” Cytometry, 38, pp 2–14 Nguyễn Hồng Trường K52A Sinh học ... tỉ lệ quần thể tế bào giai đoạn sau phân lập 3.1 KẾT QUẢ NUÔI CẤY VÀ ĐÁNH GIÁ ĐỘ THUẦN NHẤT CỦA QUẦN THỂ TẾ BÀO NUÔI CẤY NGUYÊN PHÁT 3.1.1 Kết phân lập đánh giá độ quần thể tế bào phân lập Sau... Sinh học Khóa luận tốt nghiệp 2011 Mở đầu quần thể tế bào gốc trung mơ phân lập từ lớp lót tĩnh mạch dây rốn trẻ sơ sinh nuôi cấy in vitro? ?? nhằm đánh giá biểu marker bề mặt MSC giai đoạn ni cấy. .. 1.2 TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ TĨNH MẠCH DÂY RỐN 15 1.2.1 Cấu trúc dây rốn 15 1.2.2 Tế bào gốc trung mô từ tĩnh mạch dây rốn 16 1.3 FLOW CYTOMETRY VÀ ÚNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH DI TRUYỀN TẾ