Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *** Nguyễn Thanh Ngọc NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG HỆ VI KHUẨN VÀ KHAI THÁC CÁC TRÌNH TỰ DNA MÃ HÓA ENZYM THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE TỪ DỮ LIỆU METAGENOME HỆ VI KHUẨN RUỘT MỐI BẬC THẤP COPTOTERMES GESTROI LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT *** Nguyễn Thanh Ngọc NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA DẠNG HỆ VI KHUẨN VÀ KHAI THÁC CÁC TRÌNH TỰ DNA MÃ HÓA ENZYM THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE TỪ DỮ LIỆU METAGENOME HỆ VI KHUẨN RUỘT MỐI BẬC THẤP COPTOTERMES GESTROI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS. TS. Trương Nam Hải HÀ NỘI – 2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS. TS. Trương Nam Hải - Trưởng phòng Kỹ thuật Di truyền,Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học, đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt thời gian qua. Trong quá trình thực hiện đề tài, tôi đã nhận được sự chỉ bảo chuyên môn nhiệt tình của TS. Đỗ Thị Huyền, sự hỗ trợ chuyên môn quý giá của NCS. Nguyễn Thị Thảo, ThS. Lê Quỳnh Giang và TS. Nguyễn Cường cũng như sự động viên tinh thần của tập thể cán bộ nghiên cứu tại phòng Kỹ thuật Di truyền, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Nhân dịp hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình tới sự giúp đỡ quý báu đó. Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến những người thân trong gia đình và bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm việc vừa qua. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 01 tháng 10 năm 2013 Nguyễn Thanh Ngọc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và không trùng lặp với các đề tài khác. Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ trong việc thực hiện đề tài đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đã được ghi rõ nguồn gốc. Ký tên Nguyễn Thanh Ngọc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC CÁC HÌNH v MỞ ĐẦU 1 Chƣơng 1 – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1. Tổng quan về mối – “cỗ máy” sản xuất enzym thủy phân lignocellulose hiệu quả 3 1.1.1. Nguồn gốc và phân loại mối 3 1.1.2. Cấu tạo ruột mối và hệ vi sinh vật trong ruột mối 4 1.2. Lignocellulose – sinh khối phế phụ phẩm nông lâm nghiệp và hệ enzym thủy phân lignocellulose 12 1.2.1. Cấu trúc lignocellulose 12 1.2.2. Enzym thủy phân lignocellulose 15 1.3. Metagenomics – công cụ hữu hiệu để nghiên cứu đa dạng sinh vật khu hệ mini sinh thái và khai thác gen 20 1.3.1. Khái quát về phương pháp metagenomics 20 1.3.2. Các cách tiếp cận trong nghiên cứu metagenomics 21 1.3.3. Ứng dụng metagenomics trong nghiên cứu đa dạng sinh học và khai thác gen 23 Chƣơng 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25 2.1. Vật liệu và hóa chất nghiên cứu 25 2.1.1. Vật liệu nghiên cứu 25 2.1.2. Hóa chất 25 2.2. Phương pháp nghiên cứu 26 2.2.1. Phương pháp thu nhận ruột mối 26 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 2.2.3. Phương pháp tách DNA metagenome hệ vi khuẩn ruột mối 26 2.2.3. Tinh sạch DNA metagenome bằng kỹ thuật troughing 28 2.2.4. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 28 2.2.5. Phân tích và khai thác dữ liệu DNA metagenome bằng các công cụ tin sinh 29 Chƣơng 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1. Tách chiết DNA metagenome hệ vi khuẩn cộng sinh trong ruột C. gestroi . 31 3.1.1. Thu nhận mẫu ruột mối C. gestroi 31 3.1.2. Tách chiết và tinh sạch DNA metagenome hệ vi khuẩn ruột mối 32 3.2. Phân tích dữ liệu DNA metagenome hệ vi khuẩn ruột mối C. gestroi 36 3.3. Đa dạng hệ vi khuẩn cộng sinh trong ruột mối C. gestroi 41 3.4. Khai thác các trình tự DNA mã hóa enzym thủy phân lignocellulose từ dữ liệu metagenome của hệ vi khuẩn ruột mối C. gestroi 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO 54 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 64 PHỤ LỤC 65 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Bp Cặp bazơ DNA Axít deoxyribonucleic GHF Họ Glycosyl hydrolase ORF Khung đọc mở PBS Đệm phosphate buffered saline rRNA Axít ribonucleic ribosome Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1: Chất lượng trình tự DNA metagenome hệ vi khuẩn ruột mối 36 Bảng 3.2: Kết quả lắp ráp tạo contig theo các thông số k-mer khác nhau 37 Bảng 3.3: Số liệu các trình tự đọc được dùng để lắp ráp contig khi sử dụng các tham số k-mer khác nhau 38 Bảng 3.4: Kết quả so sánh trình tự DNA metagenome hệ vi khuẩn ruột mối C. gestroi với các ngân hàng dữ liệu genome 39 Bảng 3.5: Bảng chú giải gen từ dữ liệu metagenome hệ vi khuẩn ruột mối C. gestroi . 40 Bảng 3.6: Đa dạng loài các vi sinh vật (đã được định tên) cộng sinh trong C. gestroi . 41 Bảng 3.7: Đa dạng loài một số ngành vi khuẩn sống cộng sinh trong ruột mối C. gestroi 45 Bảng 3.8: Số liệu về các ORF mã hóa enzym thủy phân lignocellulose có nguồn gốc từ vi khuẩn cộng sinh trong ruột mối C. gestroi 49 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Sơ đồ phân loại mối. 3 Hình 1.2: Cấu tạo ruột mối 4 Hình 1.3: Sơ đồ cấu trúc bậc hai của thành tế bào thực vật 12 Hình 1.4: Cấu trúc vi sợi và sợi cellulose và vị trí của chúng trong thành tế bào thực vật 13 Hình 1.5: Các đơn vị cấu trúc của chuỗi carbohydrate (cellulose, hemicellulose) và lignin 14 Hình 1.6: Quy trình sản xuất cồn sinh học từ nguyên vật liệu lignocellulose. 15 Hình 1.7: Một số enzym hemicellulase tham gia vào quá trình phân hủy hemicellulose 17 Hình 1.8: Các họ enzym cellulose tham gia vào quá trình thủy phân sợi cellulose 20 Hình 3.1: Mối thợ C. gestroi trong dịch PBS lạnh và thao tác mổ mối….……………31 Hình 3.2: Ruột mối C. gestroi sau tách được giữ trong dịch PBS 31 Hình 3.3: Ảnh điện di DNA metagenome hệ vi sinh vật ruột mối 33 Hình 3.4: Ảnh điện di DNA metagenome hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối sau tinh sạch bằng phương pháp troughing 34 Hình 3.5: Ảnh điện di lượng DNA metagenome thu được sau tinh sạch bằng phương pháp troughing và bằng kít 35 Hình 3.6: Ảnh điện di kiểm tra độ ổn định của DNA metagenome được tinh sạch bằng kít và phương pháp troughing 35 Hình 3.7: Ảnh điện di mẫu DNA metagenome hệ vi khuẩn ruột mối gửi đi giải trình tự 35 Hình 3.8: Quy trình xử lý dữ liệu giải trình tự metagenome hệ vi khuẩn ruột mối 36 Hình 3.9: Cách sắp xếp lại các đoạn trình tự ngắn để tạo thành các contig 37 Hình 3.10: Đồ thị phân bố kích thước và số lượng các contig thu được 38 Hình 3.11: Đa dạng vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối C. gestroi 41 Hình 3.12: Đa dạng các ngành vi khuẩn sống cộng sinh trong ruột mối C. gestroi 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Hình 3.13: Các ORF mã hóa enzym lignocellulase của hệ vi khuẩn cộng sinh trong ruột mối C. gestroi 46 Hình 3.14: Kết quả tìm kiếm các trình tự tương đồng với các cellulase được mã hóa bởi các ORF hoàn thiện 51 Hình 3.15: Kết quả tìm kiếm các trình tự tương đồng với các hemicellulase được mã hóa bởi các ORF hoàn thiện 51 [...]... metagenome hệ vi khuẩn ruột mối, chúng tôi hi vọng có thể khai thác được các enzym thủy phân lignocellulose của hệ vi khuẩn sống trong ruột mối Vi c thực hiện đề tài Nghiên cứu tính đa dạng hệ vi khuẩn và khai thác các trình tự DNA mã hóa enzym thủy phân lignocellulose từ dữ liệu metagenome hệ vi khuẩn ruột mối tại phòng Kỹ thuật di truyền, Vi n Công nghệ sinh học sẽ mở ra một hướng phân lập gen mới tại Vi t... 3 Nghiên cứu sự đa dạng hệ vi khuẩn cộng sinh trong ruột mối C gestroi 4 Khai thác các trình tự DNA mã hóa enzym tham gia thủy phân lignocellulose từ dữ liệu metagenome của hệ vi khuẩn ruột mối C gestroi Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Chƣơng 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu và hóa chất nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu - Mối thợ Coptotermes được thu từ. .. đa dạng quần xã vi khuẩn cũng như khai thác các gen có nguồn gốc từ vi khuẩn trong ruột mối C gestroi tham gia vào quá trình phân giải lignocellulose có trong nguồn thức ăn từ dữ liệu trình tự metagenome hệ vi sinh vật đó Do đó, nội dung nghiên cứu của đề tài sẽ là: 1 Tách chiết DNA metagenome hệ vi khuẩn cộng sinh trong ruột mối C gestroi 2 Phân tích dữ liệu DNA metagenome hệ vi khuẩn ruột mối C gestroi. .. nhóm nghiên cứu đã khai thác được 118 trình tự mRNA mã hóa cho các enzym thuộc 18 GHF khác nhau Trong đó, 39 trình tự được cho là có nguồn gốc từ vi khuẩn, 3 trình tự từ mối, 72 trình tự từ động vật đơn bào và 4 trình tự từ nấm Như vậy, gen mã hóa enzym này có nguồn gốc từ vi khuẩn chiếm khoảng 33% [90] Tóm lại, hiện nay chưa có nghiên cứu nào đánh giá một cách đầy đủ về hệ vi sinh vật có trong ruột mối. .. nghệ, vi c giải trình tự toàn bộ hệ gen đã trở nên khả thi hơn (tiết kiệm thời gian và kinh phí hơn) Do đó, chúng tôi đã tiến hành khai thác trình tự DNA và phân lập gen dựa trên cơ sở dữ liệu thu được từ vi c giải trình tự trực tiếp DNA metagenome vi khuẩn ruột mối 1.3.2.2 Khai thác và phân lập gen từ dữ liệu metagenome Hiện nay, bằng thiết bị giải trình tự gen hiện đại như hệ thống giải trình tự. .. corniger và A wheeleri [28] và mối bậc thấp, như R Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ speratus [33], R flavipes [19] và C formosanus [35, 53] Các trình tự DNA mã hóa cho hệ enzym thủy phân lignocellulose cũng đã được khai thác và phân tích từ metagenome hệ vi sinh vật ruột mối N ephratae [88], N corniger và A wheeleri [28] và R speratus [78] Tuy nhiên, hiện vẫn chưa có nghiên cứu nào... tiêu hóa của mối thợ, cellulose được chuyển hóa thành các chất dinh dưỡng nhờ hệ enzym của ruột mối và hệ vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối, động vật nguyên sinh, nấm, vi khuẩn và cổ khuẩn Dựa trên sự có mặt hay vắng mặt của động vật nguyên sinh trong ruột mối mà mối được chia làm hai nhóm mối bậc thấp và mối bậc cao [89] Khoảng 106 đến 108 tế bào nhân sơ tồn tại trong mỗi ruột mối Vi khuẩn và cổ khuẩn. .. vi sinh vật trong ruột mối có sự đa dạng rất cao Nhiều nghiên cứu về hệ vi khuẩn trong ruột mối được thực hiện thông qua các phương pháp truyền thống dựa trên vi c nuôi cấy và phân lập vi sinh vật ở trong phòng thí nghiệm Các vi khuẩn kỵ khí, đặc biệt là Staphylococcus và Bacillus, là những vi khuẩn có mặt nhiều nhất trong cả ruột mối bậc thấp và bậc cao [41] Serratia marcescenes, Enterobacter Số hóa. .. lignocellulose từ thực vật nhờ sự hỗ trợ tích cực của nhóm vi sinh vật cộng sinh trong ruột mối Nhóm vi sinh vật này có khả năng tiết ra các enzym thủy phân lignocellulose hiệu quả Do đó, hệ vi sinh vật ruột mối được coi là nguồn dự trữ phong phú và đa dạng các enzym tham gia vào phân hủy lignocellulose Ứng dụng phương pháp metagenomics theo hướng phân tích dữ liệu thu được từ vi c giải toàn bộ trình tự metagenome. .. cũng như nghiên cứu sự đa dạng và các đặc tính sinh lý và di truyền của các vi sinh vật trong môi trường tự nhiên Ngày nay với sự ra đời và phát triển của các máy giải trình tự thế hệ mới, vi c giải trình tự toàn bộ metagenome hệ vi sinh vật có trong mẫu thu thập đang dần trở nên chiếm ưu thế trong nghiên cứu phân tích metagenomics Phươn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ể phân tích . tài Nghiên cứu tính đa dạng hệ vi khuẩn và khai thác các trình tự DNA mã hóa enzym thủy phân lignocellulose từ dữ liệu metagenome hệ vi khuẩn ruột mối tại phòng Kỹ thuật di truyền, Vi n Công. KHUẨN VÀ KHAI THÁC CÁC TRÌNH TỰ DNA MÃ HÓA ENZYM THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE TỪ DỮ LIỆU METAGENOME HỆ VI KHUẨN RUỘT MỐI BẬC THẤP COPTOTERMES GESTROI Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số:. trong ruột mối C. gestroi 41 3.4. Khai thác các trình tự DNA mã hóa enzym thủy phân lignocellulose từ dữ liệu metagenome của hệ vi khuẩn ruột mối C. gestroi 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 53 TÀI LIỆU