TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN NGÀNH: BỆNH HỌC THUỶ SẢN ĐỀ CƯƠNG THỰC TẬP TỐT NGHIỆP Tên Đề tài: Nghiên cứu tác nhân gây bệnh vi khuẩn cá Hồi vân (Oncorhynchus mykiss) giai đoạn cá giống nuôi Thác Bạc-Lào Cai Người thực : Trần Thị Ngân Lớp : 47BH-ĐHNT Người hướng dẫn: ThS Trương Thị Mỹ Hạnh Bắc Ninh, tháng 2/2009 I Đặt vấn đề: Đa dạng hóa đối tượng ni ni trồng thuỷ sản lồi có giá trị kinh tế cao chủ trương ngành thuỷ sản Bên cạnh nâng cao chất lượng di truyền loại cá truyền thống, gia hố lồi địa có giá trị kinh tế, phát triển cơng nghệ ni việc nhập nội số đối tượng thuỷ sản ni có giá trị kinh tế ngành thuỷ sản ưu tiên năm gần Đối với nuôi trồng thuỷ sản nước ngọt, Cá Hồi vân (Oncorhynchus mykiss) đối tượng ni có giá trị kinh tế nuôi nhiều nước xứ lạnh giới Công nghệ sản xuất giống nhân tạo nuôi thương phẩm cá hồi vân nghiên cứu hoàn thiện áp dụng Phần Lan, Đan Mạch, NaUy, Mỹ nhiều nước ôn đới khác từ nhiều thập kỷ qua.Trong năm gần nhiều nước Châu Á Ấn Độ,Nêpan, Đài Loan, Trung quốc …đã phát triển nghề nuôi cá hồi vân.Sản phẩm chế biến từ cá hồi vân cá hun khói ưa chuộng giới coi la mặt hàng thực phẩm cao cấp.(Nguyễn Công Dân,2005 ) Ở Việt Nam, tỉnh miền núi phía Bắc số tỉnh Tây Nguyên có tiềm mặt nước để phát triển nghề nuôi cá Hồi vân.Theo báo cáo tiến độ dự án “nhập công nghệ sản xuất giống nhân tạo cá hồi vân” chất lượng nước Thác Bạc – SaPa (nhiệt độ, oxy hoà tan, PH,…) hoàn tồn phù hợp cho ương ni cá hồi vân Qua cho thấy việc áp dụng nguồn nước tự nhiên để phát triển đối tượng cá nước lạnh có giá trị việc làm cần thiết mang lại hiệu kinh tế cao Để phát triển tốt nghề nuôi cá Hồi vân bên cạnh quản lý tốt kỹ thuật cần quản lý tốt môi trường phịng ngừa dịch bệnh Trong cơng nghệ sản xuất giống cá hồi vân, giai đoạn ưong cá bột,cá hương,và cá giống quan trọng định tới suất sản lượng giống Có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới giai đoạn ương ni dịch bệnh yếu tố quan trọng Những nghiên cứu sâu bệnh (ký sinh trùng, nấm, vi khuẩn…) cá hồi vân Việt Nam cần thiết.Vì cần thiết phải tiến hành đề tài : “Nghiên cứu tác nhân gây bệnh vi khuẩn cá Hồi vân (Oncorhynchus mykiss) giai đoạn cá giống nuôi Thác Bạc-Lào Cai ” Mục tiêu nghiên cứu: - Xác định tác nhân gây bệnh vi khuẩn gây cá Hồi vân giai đoạn cá giống nuôi Thác Bạc - Lào Cai Nội dung nghiên cứu: - Thu mẫu, nuôi cấy, phân lập vi khuẩn cá Hồi vân giống - Gây nhiễm nhân tạo loài vi khuẩn phân lập lên cá khỏe -Thử kháng sinh đồ, xác định tính diệt khuẩn thuốc với vi khuẩn thu cá giống Hồi vân II Phương pháp nghiên cứu: II.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu Địa điểm: - Trung tâm Nghiên cứu Quan trắc cảnh báo mơi trường phịng ngừa dịch bệnh thuỷ sản khu vực miền Bắc (CEDMA) - Viện Nghiên cứu Nuôi trồng thuỷ sản - Đình Bảng- Từ SơnBắc Ninh - Trung tâm nghiên cứu cá nước lạnh Thác Bạc - Lào Cai Thời gian: Từ 9/ - 30/5/2009 II.2 Vật liệu phương pháp nghiên cứu: Vật liệu nghiên cứu chính: - Dụng cụ giải phẫu: Dao, kéo, đèn cồn… - Hoá chất: Cồn, thuốc thử, thuốc nhuộm… - Môi trường nuôi cấy bản, môi trường chọn lọc RS - Que cấy trịn - Các loại kháng sinh - Bộ thc kiểm tra API 20E - Bể kính II.3 Phương pháp nghiên cứu: Theo phương pháp Millar Frerich (1993) Tóm tắt bước nghiên cứu theo sơ đồ sau:: Mẫu cá bệnh Thu mẫu bệnh phẩm (gan,thận, lách…) Chọn khuẩn lạc Nuôi cấy tăng sinh Nhuộm gram Thử phản ứng sinh hoá Định danh vi khuẩn Cảm nhiễm vào cá khỏe Thử kháng sinh đồ Kết luận tác nhân gây bệnh Thu mẫu cá -Dự kiến số mẫu : 45 (mẫu thu đợt ) -Mẫu thu cá thể có dấu hiệu bị bệnh Mẫu thu trường Thu mẫu bệnh phẩm: - Quan sát dấu hiệu bên ghi chép tượng bất bình thường mẫu cá thu - Tất thao tác trình làm vô trùng - Giải phẫu mẫu dụng cụ vô trùng để lộ nội quan Quan sát, ghi chép biến đổi khác thường quan gan, thận, lách - Dùng cồn sát trùng diểm cần thu mẫu gan, thận Dùng que cấy lấy mẫu bệnh phẩm, vạch lên môi trường nuôi cấy (TSA, RS) số đường ziczac đựơc vùng 1.Hơ nóng que cấy để nguội, từ đường số vạch số đường liên tiếp vùng 2.Tiếp tục vùng - Nuôi cấy mẫu vi khuẩn thu nhiệt độ 15-200 C 24h Chọn khuẩn lạc - Sau 24 kiểm tra hình thái khuẩn lạc, bề mặt, rìa , màu sắc khuẩn lạc - Chọn khuẩn lạc, nuôi cấy tăng sinh môi trường TSA nhiệt độ 15-200C 24 Nhuộm gram: Dùng que cấy vô trùng lấy vi khuẩn từ vi khuẩn nuôi tăng sinh Dùng que cấy phết, dàn lớp mỏng lam đế khô tự nhiên hơ cao lửa đèn cồn Tiến hành nhuộm gram theo trình tự: + Dung dịch Cystal : 30giây – 60giây, rửa nước nhẹ, vẩy khô + Dung dịch lugol : 30giây – 60giây, rửa nước nhẹ, vẩy khô + Cồn Acetone : 30giây – 60giây, rửa nước nhẹ, vẩy khô + Safranin : 30giây – 60giây, rửa nước nhẹ, để khô + Quan sát kính hiển vi vật kính dầu Thử phản ứng sinh hoá ONPG ADH LDC OCD CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA OF-F Qui trình thử kít API 20E Chuẩn bị kit OF-O - Chuẩn bị hộp ủ đổ 5ml nước cất (hoặc nước khử khống) vào chỗ lõm để tạo ẩm Hình: Hộp ủ kít API20E  Chuẩn bị mẫu - Kít thử API 20E không dùng trực tiếp mẫu bệnh phẩm - Thu mẫu bệnh phẩm, cấy lên môi trường mơi trường chọn lọc Sau tiến hành chọn khuẩn lạc, cấy chuyển vào môi trường tăng sinh ống thạch nghiêng Nuôi cấy sau 24 - 48 giờ, lấy vi khuẩn môi trường tăng sinh để pha loãng vi khuẩn thành dịch huyền phù  Thử phản ứng sinh hoá - Dùng pipet lấy dịch huyền phù vi khuẩn cho đầy vào ống - Đổ lớp dầu vào ống ADH, LDC, ODC, H2S, URE để tạo thành yếm khí - Thử thêm ống O/F  Ủ kit - Ủ mẫu phản ứng nhiệt độ 15-200C thời gian 24 48h  Đọc kết - Đọc kết theo bảng đọc dùng thuốc thử hiển thị kết quả: + Thử TDA: cho giọt thuốc thử TDA chuyển màu nâu đỏ dương tính + Thử IND: cho giọt thuốc thử JAMES phát triển màu hồng ống thử dương tính + Thử VP: cho giọt thuốc thử VP giọt thuốc thử VP 2, đợi 10 phút chuyển màu hồng đỏ dương tính Nếu chuyển màu hồng nhẹ sau 10 phút âm tính + Thử NO2: cho giọt NIT giọt NIT vào ống GLU Đợi sau - phút chuyển màu đỏ dương tính + Đối với môi trường OF: Dùng que cấy hơ nóng để nguội, lấy vi khuẩn chọc thẳng vào ống nghiệm chứa môi trường OF, nuôi tủ ấm 24 đọc kết  Phân loại Dựa vào cẩm nang phân loại vi khuẩn Buller (2005) Frerichs (1984) Cảm nhiễm vi khuẩn lên cá khỏe - Cá kiểm tra vi khuẩn, nấm, ký sinh trùng có kết âm tính trước tiến hành thí nghiệm - Mỗi bể thí nghiệm 10 con, cá khoẻ mạnh, kích cỡ đồng đều, cá ni trước làm thí nghiệm tuần - Mỗi loài vi khuẩn tiến hành tiêm lặp lại bể - Tiêm trực tiếp vào xoang bụng cá, với lượng 0,1ml hỗn dịch vi khuẩn/cá thể cá, mật độ vi khuẩn 106 – 107 cfu/ml - Lô đối chứng tiêm nước muối sinh lý 0,85% - Sau cảm nhiễm vi khuẩn, lơ thí nghiệm lô đối chứng theo dõi, ghi chép biểu bất thường Thử kháng sinh đồ: - Xác định số lượng vi khuẩn để tiến hành thử kháng sinh đồ: theo phương pháp đếm trực tiếp (Kock,1987) - Trang dịch huyền phù vi khuẩn bề mặt môi trường đựng đĩa hộp lồng - Đặt khoanh giấy kháng sinh lên bề mặt môi trường cho không đĩa/ hộp lồng - Đặt vào tủ ấm 15-200C 24h - Đo vòng kháng khuẩn loại kháng sinh II.4 Phân tích số liệu: Số liệu phân tích phần mềm Excel III Dự kiến kết đạt được:  Xác định tác nhân gây bệnh vi khuẩn cá giống Hồi vân thu Thác Bạc-Lào Cai  Với lồi vi khuẩn thu lựa chọn đến loại thuốc có hiệu diệt khuẩn IV Kế hoạch thực hiện: Tháng Nội dung Viết đề cương Thu mẫu, xử lý mẫu Phân loại, định danh vi khuẩn Cảm nhiễm vào cá khoẻ Thu số liệu, xử lý số liệu Viết báo cáo Bảo vệ báo cáo ... mykiss) giai đoạn cá giống nuôi Thác Bạc-Lào Cai ” Mục tiêu nghiên cứu: - Xác định tác nhân gây bệnh vi khuẩn gây cá Hồi vân giai đoạn cá giống nuôi Thác Bạc - Lào Cai Nội dung nghiên cứu: - Thu... Những nghiên cứu sâu bệnh (ký sinh trùng, nấm, vi khuẩn? ??) cá hồi vân Vi? ??t Nam cần thiết.Vì cần thiết phải tiến hành đề tài : ? ?Nghiên cứu tác nhân gây bệnh vi khuẩn cá Hồi vân (Oncorhynchus mykiss). .. mẫu, nuôi cấy, phân lập vi khuẩn cá Hồi vân giống - Gây nhiễm nhân tạo loài vi khuẩn phân lập lên cá khỏe -Thử kháng sinh đồ, xác định tính diệt khuẩn thuốc với vi khuẩn thu cá giống Hồi vân II