Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ THU HIỀN NGHIÊN CỨU TÁCH DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT CỦA TIÊN MAO TRÙNG (TRYPANOSOMA EVANSI) LƢU HÀNH Ở VIỆT NAM TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ THÚ Y Chuyên ngành: Thú y Mã số: 60.64.01.01 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: 1. GS.TS Nguyễn Thị Kim Lan 2. TS Phạm Thị Tâm Thái Nguyên, năm 2013 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii Công trình đƣợc hoàn thành tại: KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC - VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI Ngƣời hƣớng dẫn khoa học : 1. GS.TS Nguyễn Thị Kim Lan 2. TS Phạm Thị Tâm Phản biện 1: PGS.TS Đặng Xuân Bình Phản biện 2: TS. Phan Hồng Phúc Luận văn sẽ đƣợc bảo vệ trƣớc Hội đồng chấm luận văn họp tại: Vào hồi giờ ngày tháng năm 2013 Có thể tìm hiểu luận văn tại trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên Và thƣ viện Trƣờng/Khoa:……………………………. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu này là của chúng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này mà tôi sử dụng chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nghiên cứu nào khác. Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thu Hiền Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv LỜI CẢM ƠN Trong thời gian thực hiện đề tài, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận đƣợc rất nhiều sự giúp đỡ, hƣớng dẫn tận tình của các thầy giáo, cô giáo, các tập thể, cá nhân, bạn bè đồng nghiệp trong và ngoài trƣờng. Nhân dịp hoàn thành luận văn Thạc sĩ khoa học nông nghiệp chuyên ngành Thú y tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến GS.TS. Nguyễn Thị Kim Lan. Trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên và TS. Phạm Thị Tâm, khoa Công nghệ sinh học, Viện Đại học Mở Hà Nội, đã trực tiếp hƣớng dẫn, tận tình chỉ bảo, tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Tôi xin trân trọng cảm ơn: - Các thầy cô giáo trong Khoa Chăn nuôi Thú y, Trƣờng Đại học Nông lâm Thái Nguyên đã giúp tôi hoàn thành khóa học và nâng cao chất lƣợng luận văn. - Phòng quản lý đào tạo sau đại học đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trƣờng. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến những ngƣời thân, gia đình đã động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Xin trân trọng cảm ơn! Thái Nguyên, tháng 08 năm 2013 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Thu Hiền Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v Mục lục Trang MỞ ĐẦU 1 1. Tính cấp thiết của đề tài 1 2. Mục tiêu của đề tài 2 3. Điểm mới của đề tài 2 4. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 1.1. TIÊN MAO TRÙNG VÀ BỆNH TIÊN MAO TRÙNG Ở GIA SÚC 4 1.1.1. Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng 4 1.1.2. Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng 8 1.1.3. Đặc điểm bệnh lý và lâm sàng của bệnh 10 1.1.4. Chẩn đoán bệnh tiên mao trùng 13 1.1.5. Phƣơng pháp phát hiện ADN của tiên mao trùng bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) 19 1.1.6. Phòng trị bệnh tiên mao trùng cho trâu, bò, ngựa 19 1.2. VECTOR TÁCH DÒNG 22 1.2.1. Khái niệm 22 1.2.2. Các loại vector tách dòng 23 1.2.3. Plasmid pCR 2.1 24 1.3. VECTOR BIỂU HIỆN 27 1.3.1. Khái niệm 27 1.3.2. Các hệ thống biểu hiện gen 27 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1. VẬT LIỆU 30 2.1.1. Sinh phẩm trong nghiên cứu 30 2.1.2. Hóa chất và môi trƣờng 30 2.1.3. Thiết bị 33 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vi 2.1.4. Cặp mồi dùng trong nghiên cứu. 34 2.2. ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 34 2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 34 2.3.1. Nghiên cứu các điều kiện tách dòng gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi 34 2.3.2. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của Trypanosoma evansi 34 2.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.4.1. Sơ đồ nghiên cứu 35 2.4.2. Tách chiết ADN tổng số 35 2.4.3 Kiểm tra ADN hệ gen bằng máy đo quang phổ. 36 2.4.4 Khuếch đại đoạn gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 bằng phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction). 37 2.4.5 Phƣơng pháp điện di trên gel agarose 38 2.4.6 Tạo dòng gene mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 39 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47 3.1. Tách dòng và xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 47 3.2 Biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên RoTAT 1.2 57 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 64 1. Kết luận 64 2. Đề nghị 65 TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ vii CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU ADN Acid deoxyribonucleic CATT Card Agglutination Test for Trypanosomiasis cDNA DNA bổ xung (complementary DNA) dNTP Deoxynucleotid triphotphat ddNTP Dideoxynucletid triphotphat EDTA Ethylen Diamin Tetra Acetic IFAT Indirect Fluorescent Antibody Test IPTG Isopropyl β – D – thiogalactoside MCS Multi clonding site PBS Phosphat Buffered Saline RNA Ribonucleic acid SDS Sodium Dodecyl Sulfat SDS – PAGE Sodium Dodecyl Sulfat Poly Acrylamide TEA Tris – axit acetic - EDTA VAT Variant Antigen Tupe VSG Variant Surface Glucoprotein Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ viii DANH MỤC BẢNG BIỂU Trang Bảng 3.1. Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn RoTAT 1.2 52 Bảng 3.2. Thành phần và điều kiện phản ứng giải trình tự gen 54 Bảng 3.3. Tổng hợp mức độ tƣơng đồng của gen RoTAT 1.2 của các chủng T.evansi phân lập với các trình tự của NCBI 56 Bảng 3.4. Thành phần và điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR chứa gen RoTAT 1.2/ pET32a (+) bằng enzyme Bam HI 59 Bảng 3.5. Thành phần và điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR chứa gen RoTAT 1.2/ pET32a (+) bằng enzyme Xho I 59 Bảng 3.6. Thành phần và điều kiện phản ứng nối gen 59 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ix DANH MỤC HÌNH VẼ Trang Hình 1.1. Vector tách dòng pCR 2.1 25 Hình 1.2. Sơ đồ thiết kế vector tái tổ hợp pJET1.2-RoTAT 1.2 26 Hình 3.1. Hình ảnh ký sinh trùng trong máu chuột bạch 47 Hình 3.2. Kết quả tách chiết ADN tổng số 48 Hình 3.3. Kết quả sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5% 49 Hình 3.4. Kết quả biến nạp gen RoTAT 1.2 vào vi khuẩn E.coli DH10b 51 Hình 3.5. Kết quả tách chiết ADN plasmid 51 Hình 3.6. Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp bằng phản ứng PCR với cặp mồi F1.2 /R1.2 53 Hình 3.7. So sánh trình tự gen RoTAT 1.2 của chủng T.evansi HB với trình tự GeneBank 54 Hình 3.8 So sánh trình tự gen RoTAT 1.2 của chủng T.evansi LS với trình tự GeneBank 55 Hình 3.9. So sánh trình tự gen RoTAT 1.2 của chủng T.evansi TN với trình tự GeneBank 55 Hình 3.11. Hình ảnh điện di gen RoTAT 1.2 cắt bằng các anzyme giới hạn Bam HI và Xho I 58 Hình 3.12. Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzyme Bam HI và Xho I 60 Hình 3.13 Sơ đồ cấu trúc của vector pET 32a(+) 61 Hình 3.14 Kết quả điện di protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 trên gel SDS-PAGE 62 Hình 3.15 Kết quả Western blot giữa protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 với kháng thể kháng 6xHis 63 Hình 3.16 Kết quả Western blot giữa protein tái tổ hợp RoTAT 1.2 với kháng thể kháng T.evansi 63 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1 MỞ ĐẦU 1. Tính cấp thiết của đề tài Bệnh do Trypanosoma (Trypanosomiasis) là bệnh truyền lây giữa ngƣời và gia súc do ký sinh trùng đơn bào (Protozoa) lớp trùng roi (Flagellata) gây ra. Có nhiều loài thuộc giống Trypanosoma, nhƣ: Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma evansi, Trypanosoma congolense, Trypanosoma gambiense, Trypanosoma vavax, Trypanosoma siminae… Bệnh tiên mao trùng do Trypanosoma evansi thấy ở những loài động vật, trong đó trâu, bò là các động vật khá mẫn cảm với động vật đơn bào này. Trâu, bò mắc bệnh thể cấp tính thƣờng sốt cao 41 – 41,7 0 C với các triệu chứng thần kinh nhƣ ngã quỵ, kêu rống, đi vòng tròn, thuỷ thũng ở hầu, ức, nách, chân, háng. Trƣờng hợp bệnh nặng, con vật đột ngột sốt cao, bụng chƣớng to rồi lăn ra chết. Trâu, bò mắc bệnh ở thể cấp tính có thể chết sau 7 – 15 ngày. Ở thể mãn tính, triệu chứng lâm sàng nhẹ hơn và bệnh kéo dài 1 – 2 tháng, con vật ngày càng gầy, da khô mốc, niêm mạc mắt tụ máu màu đỏ tía, đôi khi có chấm máu, chảy nƣớc mắt và mắt có nhiều dử đặc nhƣ keo, niêm mạc mắt vàng nhạt hay sẫm. Sức khoẻ trâu, bò suy yếu dần, kém ăn, kém nhai lại, đi phân táo có lẫn máu hoặc đi tháo phân lỏng, mùi thối khắm, có khi con vật ỉa ra cả màng ruột, nát từng đoạn. Theo số liệu của Phạm Sỹ Lăng (1982), Phan Địch Lân và cs (2004), Phan Văn Chinh (2006), bệnh tiên mao trùng xuất hiện ở nhiều vùng trên cả nƣớc, với tỷ lệ mắc khá cao: trên trâu là 13 – 30%, trên bò là 7 – 14%, trong đó tỷ lệ gia súc chết/gia súc mắc lên tới 6,3 – 20%. Cũng theo báo cáo của các tác giả trên, tỷ lệ mắc Trypanosoma evansi ở gia súc vùng núi và trung du cao hơn các vùng đồng bằng và ven biển. Trong khi đó, ở nƣớc ta, chăn nuôi gia súc nhai lại để cung cấp sức kéo, thịt, sữa lại tập trung chủ yếu ở các tỉnh miền núi và trung du là các vùng có điều kiện tự nhiên thích hợp cho sự phát triển chăn nuôi gia súc nhai lại, nhƣng cơ sở hạ tầng phục vụ công tác chẩn đoán và điều trị tại địa phƣơng còn yếu kém; dẫn tới hệ quả là bệnh tiên mao trùng trở nên phổ biến hơn, nghiêm trọng hơn và gây thiệt hại lớn hơn. [...]... mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng (Trypanosoma evansi) lưu hành ở Việt Nam 2 Mục tiêu của đề tài - Xác định đƣợc gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng - Tạo đƣợc dòng tế bào vi khuẩn biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng 3 Điểm mới của đề tài - Đề tài xác định đƣợc gen mã hóa kháng nguyên Ro-TAT 1.2 của tiên mao trùng phân lập ở Việt Nam tạo cơ sở cho việc... hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 và biểu hiện đƣợc gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 của tiên mao trùng Trypanosoma evansi phân lập ở Việt Nam 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Sản phẩm của đề tài là cơ sở cho nghiên cứu sản xuất kháng nguyên tái tổ hợp, phục vụ chế tạo Kit chẩn đoán có khả năng phát hiện đặc hiệu bệnh tiên mao trùng gia súc ở Việt Nam do tính tƣơng đồng kháng nguyên Số hóa bởi Trung tâm... nghiên cứu của Dia và cs (1997), Verloo và cs (1998 - 2000), kháng nguyên Ro-TAT 1.2 có mặt ở hầu hết các VAT (Variable Antigen Type) của Trypanosoma evansi Kháng nguyên này có thể chế tạo đƣợc bằng công nghệ gen cho khả năng phát hiện đặc hiệu kháng thể kháng tiên mao trùng đạt 98% (Verloo và cs, 2000) Trong khuôn khổ của đề tài này, chúng tôi tiến hành: Nghiên cứu tách dòng và biểu hiện gen mã hóa. .. mới về sự xuất hiện kháng nguyên biến đổi của tiên mao trùng và cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi Nhờ kháng thể đặc hiệu đƣợc đánh dấu mà Vickerman và Luckins (1969) đã phát hiện ra sự biến đổi của lớp kháng nguyên bề mặt Cross (1975) đã mô tả lớp áo bề mặt của tiên mao trùng có thành phần là glycoprotein bao phủ toàn bộ bề mặt tế bào bằng một lớp phân tử giống nhau (mỗi tiên mao trùng có 107... ở xung quanh và một cặp ở trung tâm, xếp song song dọc chiều dài roi (Hoare, 1972 [21]; Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [3]) 1.1.1.3 Cấu trúc kháng nguyên của tiên mao trùng Trypanosoma evansi Kháng nguyên của T evansi gồm hai loại: kháng nguyên ổn định (kháng nguyên không biến đổi) và kháng nguyên biến đổi * Kháng nguyên ổn định (kháng nguyên không biến đổi) Phần lớn các thành phần kháng nguyên tiên mao trùng. .. trúc kháng nguyên - Kháng nguyên Ro-TAT 1.2 đƣợc chế tạo bằng công nghệ gen ở Việt Nam sẽ phục vụ việc sản xuất Kit chẩn đoán có khả năng phát hiện đặc hiệu với bệnh tiên mao trùng ở Việt Nam do tính tƣơng đồng kháng nguyên Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 3 4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 4.1 Ý nghĩa khoa học Đề tài thực hiện tách dòng, xác định trình tự gen mã hóa kháng. .. tính kháng nguyên bề mặt (epitop surface) Còn kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng lại có nhiều điểm thụ thể (receptor) tƣơng ứng, đặc hiệu với các điểm quyết định của kháng nguyên Do đó, khi kháng nguyên tiên mao trùng gặp kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng, sẽ có hiện tƣợng một phân tử kháng thể đặc hiệu liên kết với nhiều phân tử kháng nguyên và ngƣợc lại Kết quả là các hạt latex cùng với kháng. .. Vickernlan (1981), hiện tƣợng biến đổi kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng còn thấy ở gia súc đã bị tiêm thuốc làm suy giảm miễn dịch Những quan điểm này là hoàn toàn mới để lý luận về sự xuất hiện kháng nguyên biến đổi của tiên mao trùng Nhƣ vậy, quan điểm về sự biến đổi kháng nguyên lớp vỏ của tiên mao trùng cho đến nay vẫn chƣa thống nhất * Cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi Khi kháng thể đặc... http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 16 Nguyên lý của phƣơng pháp LATEX: khi kháng nguyên bề mặt T evansi gắn lên các hạt latex kết hợp với kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng ở trên bản nhựa, thì sẽ xảy ra phản ứng ngƣng kết giữa kháng nguyên với kháng thể Hiện tƣợng ngƣng kết có thể quan sát đƣợc bằng mắt thƣờng, và đƣợc giải thích là do kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng đƣợc gắn lên các hạt latex là loại kháng nguyên hữu... cung cấp cho kháng nguyên bề mặt này Nhiều tác giả nghiên cứu về miễn dịch học cho rằng, tiên mao trùng biến đổi kháng nguyên bề mặt để né tránh đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của vật chủ Tuy nhiên, Van Meirvenne (1975) cho biết, sự biến đổi kháng nguyên bề mặt của ký sinh trùng đã có ngay ở pha đầu tiên của quá trình nhiễm (trƣớc khi xuất hiện đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ) Theo Hajduc và Vickernlan . hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng (Trypanosoma evansi) lưu hành ở Việt Nam . 2. Mục tiêu của đề tài - Xác định đƣợc gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng -. hiện tách dòng, xác định trình tự gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 và biểu hiện đƣợc gen mã hóa kháng nguyên bề mặt RoTAT 1.2 của tiên mao trùng Trypanosoma evansi phân lập ở Việt Nam. . Tạo đƣợc dòng tế bào vi khuẩn biểu hiện gen mã hóa kháng nguyên bề mặt của tiên mao trùng 3. Điểm mới của đề tài - Đề tài xác định đƣợc gen mã hóa kháng nguyên Ro-TAT 1.2 của tiên mao trùng