4 B Y T TRNG I HC Y H NI o0o BO CO KT QU NGHIấN CU TI CP B nghiên cứu nuôi cấy tế bào rìa giác mạc và ứng dụng trong điều trị một số tổn thơng giác mạc Ch nhim ti: PGS.TS. Nguyn Th Bỡnh C quan ch trỡ ti: Trng i hc Y H ni 8020 H Ni - 2009 5 B Y T TRNG I HC Y H NI o0o BO CO KT QU NGHIấN CU TI CP B nghiên cứu nuôi cấy tế bào rìa giác mạc và ứng dụng trong điều trị một số tổn thơng giác mạc Ch nhim ti: PGS. TS. Nguyn Th Bỡnh Th ký ti : TS. Nguyn Khang Sn C quan ch trỡ ti:Trng i hc Y H ni Cp qun lý: B Y t Thi gian thc hin: t thỏng 8 nm 2006 n thỏng 8 nm 2009 Tng kinh phớ thc hin ti: 380 triu ng Trong ú: kinh phớ SNKH 380 triu ng Ngun khỏc: 0 triu ng H Ni - 2009 1 BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ VỀ TÌNH HÌNH THỰC HIỆN VÀ NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP BỘ 1. Tên đề tài: “Nghiên cứu nuôi cấy tế bào rìa giác mạc và ứng dụng trong điều trị một số tổn thương giác mạc”. 2. Chủ nhiệm đề tài : PGS. TS Nguyễn Thị Bình 3. Cơ quan chủ trì đề tài : Trường Đại học Y Hà nội 4. Thời gian thực hiện : 8/2006- 8/2009 5. Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 380 triệu đồng, trong đó kinh phí từ ngân sách là 380 triệu đồng. 6. Tình hình thực hiện đề tài so với đề cương: 6.1.Về mức độ hoàn thành khối lượng công việc: Đề tài đã hoàn thành đầy đủ khối lượng các công việc đã đề ra trong đề cương : Gồm: - Tấm màng ối người đã xử lý: 240 tấm - Tấm biểu mô giác mạc thỏ nuôi cấy : 120 tấm - Tấm biểu mô giác mạc người nuôi cấy:20 tấm - Gây bỏng giác mạc cho thỏ : 32 thỏ - Ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy cho thỏ: 20 mắt - Ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy cho bệnh nhân tình nguyện: 6 mắt - Đã đăng 3 bài báo có nội dung liên quan đến đề tài ở Tạp chí Nghiên cứu Y học: 1. “Đánh giá phương pháp xử lý mẫu mô vùng rìa giác mạc thỏ trong nuôi cấy tạo tấm biểu mô giác mạc”; Tạp chí Nghiên cứu Y học, Supplement, Volume 62, N 0 3- May , 2009. 2. “Nghiên cứu quy trình tạo tấm màng ối làm nền nuôi cấy tế bào gốc vùng rìa giác mạc”; Tạp chí Nghiên cứu Y học, Volume 63,N 0 4- June, 2009. 3. “Nghiên cứu định danh tế bào tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy”; Tạp chí Nghiên cứu Y học, Volume 64, N 0 5- October, 2009. - Đào tạo : + 1 cao học chuyên ngành Mô –Phôi (BS. Phạm Thị Nhung): Tên đề tài: “Đánh giá hiệu quả xử lý mẫu mô vùng rìa sinh thiết trong tạo tấm biểu mô giác mạc thỏ nuôi cấy”. + 1 NCS chuyên ngành Nhãn khoa (ThS. Vũ Thị Tuệ Khanh): Tên đề tài: “Nghiên cứu phương pháp ghép tấm biểu mô giác mạc vùng rìa nuôi cấy điều trị hội chứng suy giảm tế bào nguồn sau bỏng mắt do kiềm”. 2 6.2. Về các yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm KHCN: Đối chiếu với yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm đặt ra trong đề cương, đề tài đã đạt đầy đủ: - Tấm màng ối người đã xử lý: có kích thức 3x3 cm, vô khuẩn, dai và đàn hồi tốt, làm nền nuôi cấy mảnh mô vùng rìa tạo tấm biểu mô thành công, không bị phân hủy khi ghép tấm biể u mô nuôi cấy cho thỏ và bệnh nhân - Tấm biểu mô giác mạc thỏ và người nuôi cấy: có đầy đủ đặc điểm về cấu trúc hình thái và hóa học của biểu mô giác mạc: rộng 4cm 2 , là biểu mô lát tầng không sừng hóa gồm 4-5 hàng tế bào , các tế bào liên kết chặt chẽ với nhau bằng các mộng bào tương và thể liên kết, không có tế bào tiết nhày, bào tương chứa K3 và K12, sống và áp sát vào nhu mô của giác mạc khi ghép cho thỏ và cho người (thỏ: 3 tháng, người: 9 tháng) - Gây bỏng giác mạc cho thỏ: Xây dựng thành công mô hình gây bỏng giác mạc thực nghiệm cho thỏ: phá hủy toàn bộ biểu mô giác mạc và vùng rìa giác mạc, tạo thành sẹo giác mạc. - Ghép thành công tấm biểu mô giác mạc nuôi c ấy cho 20 mắt thỏ : tấm biểu mô dán sát vào nhu mô giác mạc, các tế bào biểu mô có bào tương và nhân bình thường. - Ghép thành công tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy cho 6 mắt bệnh nhân: tấm biểu mô áp tốt, biểu mô bề mặt nhãn cầu nhẵn bóng, nhuộm biểu mô bề mặt nhãn cầu bằng fluorescein không thấy tổn thương, màng xơ mạch không phát triển, hiện tượng viêm trên bề mặt nhãn cầu đã được giải quyết, các triệu chứng chủ quan của người bệnh được cải thiện đáng kể, thị lực sau ph ẫu thuật tăng từ 1 đến 3 dòng so với trước phẫu thuật. - Đội ngũ các nhà khoa học, các bác sĩ, y tá, kỹ thuật viên có kiến thức và tay nghề vững vàng trong nuôi cấy tấm biểu mô giác mạc và phẫu thuật ghép tấm biểu mô nuôi cấy . 6.3. Về tiến độ thực hiện: Đề tài đã thực hiện đúng tiến độ đã đề ra (Mặc dù đề tài được phê duyệt từ ngày 16/8/2006; tuy nhiên ngày 11/10/2006, đề tài mới được phân bổ kinh phí) 7. Về những đóng góp mới của đề tài: 3 Trên cơ sở so sánh với những thông tin đã được công bố trên các ấn phẩm trong và ngoài nước đến thời điểm kết thúc đề tài, đề tài có những điểm mới sau đây: 7.1. Về giải pháp khoa học - công nghệ: Đề tài đã xây dựng mô hình nghiên cứu toàn diện và công phu. Trước tiên, các nghiên cứu được tiến hành trên thực nghiệm. Những kết quả thu được trên thực nghiệm sẽ là định hướng cho nghiên cứu trên bệnh nhân. Thông qua nghiên cứu thực nghiệm, các bác sĩ, y tá kỹ thuật viên rút ra được nhiều kinh nghiệm cũng như rèn luyện được tay nghề trước khi tiến hành thử nghiệm tên bệnh nhân. 7.2. Về phương pháp nghiên cứu: Kết hợp các kỹ thuật thông thường như: nhuộm giemsa, nhuộm H.E với các kỹ thuật hiện đại như: hiển vi điện tử xuyên và quét, nhuộm hóa mô miễn dịch, nhuộm huỳnh quang. 7.3. Những đóng góp mới khác: đây là công trình đầu tiên ở Việt nam đã nuôi cấy và ghép thành công tấm biểu giác mạc nuôi cấy , mở ra một phương pháp hiện đại điều trị cho các b ệnh nhân bị hội chứng suy giảm tế bào nguồn giác mạc. 8. Tình hình sử dụng kinh phí: Giải ngân đầy đủ, đúng tiến độ và đúng các quy định về tài chính hiện hành, có bản xác nhận chi tiêu kèm theo. Hà nội, ngày 15 tháng10 năm 2009 CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI PGS.TS. Nguyễn Thị Bình 6 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3 1.1. Cấu trúc của bề mặt nhãn cầu [2] 3 1.1.1. Giác mạc 3 1.1.3. Kết mạc nhãn cầu 4 1.1.3. Vùng rìa giác mạc và tế bào gốc vùng rìa giác mạc. 5 1.1.4. Các yếu tố liên quan đảm bảo sự toàn vẹn của BMNC [36] 8 1.2. Màng ối và các phương pháp xử lý màng ối làm nền nuôi cấy 10 1.2.1. Màng ối 10 1.2.2. Chuẩn bị màng ối làm nền nuôi cấy. 12 1.3. Nuôi tạo tấm biểu mô giác mạc từ tế bào gốc vùng rìa giác mạc 14 1.3.1. Chuẩn bị mẫu mô vùng rìa để nuôi cấy. 14 1.3.2. Môi trường nuôi cấy 15 1.3.3. Nuôi tạo tấm biểu mô giác mạc từ tế bào gốc VRGM 16 1.3.4. Định danh tế bào của tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy 17 1.4. Điều trị tổn thương bề mặt nhãn cầu bằng phương pháp ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy 17 1.4.1. Hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM [24, 42, 46, 48] 17 1.4.2. Biểu hiệ n lâm sàng của hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM 18 1.4.3. Chẩn đoán xác định hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM 19 1.4.4. Phân loại mức độ tổn thương của hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM [17] 19 1.4.5. Phương pháp điều trị hội chứng suy giảm tế bào gốc VRGM bằng ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy 20 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1. Đố i tượng nghiên cứu 23 2.2 Mô hình nghiên cứu 23 2.3. Phương pháp nghiên cứu 24 2.3.1. Xây dựng qui trình thu nhận, xử lý và bảo quản màng ối người làm nền nuôi cấy. 24 2.3.2.Xây dựng qui trình trích thủ và xử lý mẫu vùng rìa giác mạc. 25 2.3.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy: 27 7 2.3.4. Ghép thực nghiệm trên thỏ 27 2.3.5. Ghép trên bệnh nhân tình nguyện 30 2.4. Kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu 33 2.5. Địa điểm nghiên cứu 34 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 35 3.1.Xây dựng qui trình thu nhận, xử lý và bảo quản màng ối người làm nền nuôi cấy. 35 3.1.1. Lựa chọn màng ối 35 3.1.2. Lựa chọn phương pháp xử lý màng ối: 37 3.2. Lựa chọn phương pháp xử lý mảnh vùng rìa để nuôi cấy 39 3.2.1. M ẫu mô vùng rìa giác mạc thỏ được chuẩn bị cho nuôi cấy 39 3.2.2. Diện tích phát triển của tấm BMVRGM nuôi cấy trên nền màng ối 40 3.2.4. Hình thái của tấm BMGM sau nuôi cấy 42 3.3. Lựa chọn môi trường nuôi cấy: 44 3.4. Lựa chọn phương pháp nuôi cấy 45 3.4.1. Tỷ lệ nuôi tạo thành công tấm biểu mô giác mạc (Bảng 3.3) 45 3.4.2. Chất lượng của tấm biểu mô 45 3.5. Xây dựng qui trình định danh, xác định điều kiện nuôi cấy tế bào gốc BMVR và tạo tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy. Đánh giá chất lượng tế bào của tấm BMVR nuôi cấy 47 3.5.1. Cấu trúc vi thể của tấm biểu mô nuôi cấy 48 3.5.2. Cấu trúc siêu vi của tấm biểu mô nuôi cấy 49 3.5.3. Cấu trúc hoá học của tấm biểu mô nuôi cấy 51 3.6. Mô hình gây bỏng cho thỏ. 52 3.7. Ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy cho thỏ 53 3.8. Nuôi và ghép tấm biểu mô nuôi cấy cho bệnh nhân tình nguyện 56 3.8.1. Đặc đ iểm tình hình bệnh nhân (Bảng 3.4) 56 3.8.2. Đặc điểm tổn thương mắt trước phẫu thuật ghép tấm biểu mô (Bảng 3.5) 56 3.8.3. Thời gian nuôi cấy tấm biểu mô (Bảng 3.6) 57 3.8.4. Kết quả phẫu thuật tại các thời điểm theo dõi (Bảng 3.7) 57 CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN 61 KẾT LUẬN 69 KIẾN NGHỊ VÀ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 8 DANH MỤC HÌNH Hình 1.3. Cấu tạo màng rau thai người 10 Hình 2.1: Mô hình nghiên cứu 23 Hình 2.2: Bánh rau và màng rau 24 Hình 2.3: Mô hình nghiên cứu thực nghiệm 28 Hình 2.4: Phân nhóm thực nghiệm 29 Hình 3.1. Màng ối trên bề mặt bánh rau (H.E x 250) 35 Hình 3.2: Bề mặt màng ối người (giemsa, x 1000): 36 Hình 3.3: Màng ối cắt đứng dọc (HE x 800): 36 Hình 3.4. Màng ối không nạo biểu mô(H.E x 250) 37 Hình 3.5. Màng ối nạo biểu mô bằng cơ học(H.E x 250) 37 Hình 3.7. Tấm biểu mô nuôi trên màng ối còn biểu mô 38 Hình 3.8. Tấm biểu mô nuôi trên màng ối nạo biểu mô bằng cơ học 38 Hình 3.9. Tấm biểu mô nuôi trên màng ối n ạo biểu mô bằng Ammonium 38 Hình 3.10: Mẫu mô vùng rìa không xử lý enzym (HE x250): 39 Hình 3.11: Mẫu mô vùng rìa được xử lí bằng dispase (HEx 250): 39 Hình 3.12:Biểu mô vùng rìa tái tạo sau 7 ngày trích thủ (HE x 250) 40 Hình 3.13: Sự phát triển và lan rộng của tấm BMGM nuôi cấy 41 Hình 3.14: Tấm biểu mô nuôi cấy ngày thứ 4. (KHV soi nổi x 25): 42 Hình 3.15: Bề mặt tấm biểu mô nuôi cấy 10 ngày (Giemsa x 200) 43 Hình 3.16: Tấm biểu mô nuôi cấy 10 ngày 43 Hình 3.17. Tấm biểu mô nuôi cấy 12 ngày, vùng đặt mảnh VRGM(H.E x 250) 43 Hình 3.18: Bề mặt tấm biểu mô nuôi cấy 16 ngày (Giemsa x 200) 44 Hình 3.19: Tấm biểu mô nuôi cấy 14 ngày (Nhuộm huỳ nh quang x 250) 44 Hình 3.20. Nuôi cấy bằng dịch treo 4 ngày( Giemsa x 400) 46 Hình 3.22: Tấm biểu mô nuôi cấy ngày thứ 3 46 Hình 3.21. Tấm biểu mô nuôi cấy bằng dịch treo 18 ngày (H.E x500) 47 Hình 3.23. Tấm biểu mô nuôi cấy bằng mảnh mô vùng rìa 16 ngày (H.E x500) 47 Hình 3.24 : Bề mặt tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày (giemsa x250) 48 Hình 3.25 : Tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày (H.E x500) 49 Hình 3.26. Bề mặt tấm biểu mô nuôi cấy14 ngày (x5000) 49 Hình 3.27. Mặt dưới màng ối (x 10.000) 50 Hình 3.28: Tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày (x4000). 50 Hình 3.29: Tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày (x10.000). 50 Hình 3.30. Tấm biểu mô nuôi cấy 14 ngày (P.A.S x 1000) 51 Hình 3.31: Tấm biểu mô nuôi c ấy 18 ngày (K3x500). 51 Hình 3.32: Tấm biểu mô nuôi cấy 18 ngày (K12x500). 51 Hình 3.33: Mắt thỏ trước bỏng 52 Hình 3.34: Mắt thỏ ngay sau khi gây bỏng 52 Hình 3.35: Mắt thỏ sau bỏng 1 tháng 52 Hình 3.36: Sau bỏng 7 ngày (H.E x 100) 53 Hình 3.37: Sau bỏng 15 ngày (H.E x100) 53 Hình 3.38: Sau bỏng 45 ngày (H.E x 100) 53 Hình 3.39: Mắt thỏ ngay sau ghép 53 Hình 3.40. Mắt thỏ sau ghép 7 ngày 54 Hình 3.41. Giác mạc thỏ sau ghép 7 ngày 54 Hình 3.42: Mắt thỏ sau ghép 15 ngày 54 Hình 3.43: Giác mạc thỏ sau ghép 15ngày 54 9 Hình 3.44. Mắt thỏ sau ghép 1 tháng 55 Hình 3.45: Giác mạc thỏ sau ghép 1 tháng 55 Hình 3.46: Mắt thỏ sau ghép 3 tháng 55 Hình 3.47: Giác mạc thỏ sau ghép 3 tháng 55 Hình 3.48: Mắt của bệnh nhân số 1 sau bỏng 3, 5 tháng 58 Hình 3.49: Mắt của bệnh nhân số 1 sau ghép tấm biểu mô nuôi cấy 1 tuần, 2 tháng 59 Hình 3.50: Mắt của bệnh nhân số 1 sau ghép tấm biểu mô nuôi cấy 6 tháng 59 Hình 3.51: Mắt của bệnh nhân số 1 sau ghép tấm biểu mô nuôi cấy 8 tháng 60 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Diện tích của tấm BMVRGM nuôi cấy theo thời gian 41 Bảng 3.2 : Lựa chọn môi trường nuôi cấy 44 Bảng 3.3: Tỉ lệ nuôi cấy thành công tấm biểu mô giác mạc 45 Bảng 3.4: Đặc điểm tình hình bệnh nhân trước phẫu thuật 56 Bảng 3.5: Đặc điểm tổn thương mắt trước phẫu thuật ghép tấm biểu mô 56 Bảng 3.6: Thời gian nuôi cấy tấm biểu mô 57 Bảng 3.7: Kết quả phẫ u thuật tại các thời điểm theo dõi 57 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Tổn thương giác mạc là một bệnh lý thường gặp trong nhãn khoa. Nguyên nhân gây tổn thương giác mạc rất khác nhau nhưng đều làm mất độ trong của giác mạc và gây giảm thị lực ở nhiều mức độ khác nhau. Trong một số trường hợp, vùng rìa giác mạc - nơi cư trú của tế bào gốc biểu mô giác mạc cũng bị tổn thương, di chứng để lại cho bệnh nhân là hộ i chứng suy giảm tế bào gốc của biểu mô giác mạc. Hậu quả của hội chứng này làm mất độ trong của giác mạc do màng xơ mạch từ phía kết mạc xâm lấn qua vùng rìa lên bề mặt của giác mạc, loét biểu mô giác mạc khó hàn gắn, tróc biểu mô giác mạc tái phát [12, 15, 34, 41, 46]. Để điều trị hội chứng suy giảm tế bào gốc của biểu mô giác mạc, các nhà nhãn khoa đã sử dụng các phương pháp khác nhau: Ghép kế t mạc rìa tự thân, ghép giác - củng mạc rìa từ giác mạc tử thi, ghép màng ối. Kết quả điều trị khá tốt, đặc biệt với những trường hợp tổn thương một mắt. Tuy nhiên với các kỹ thuật này, mảnh mô dùng để ghép lấy từ bên mắt lành hoặc từ mắt tử thi cần có một diện tích khá lớn hoặc cần toàn bộ giác mạc. Trong vài năm gần đây, y – sinh họ c hiện đại đã đạt được những thành tựu lớn trong việc đổi mới mô bằng ghép tế bào gốc. Trong nhãn khoa, công nghệ tạo tấm biểu mô giác mạc từ việc nuôi cấy tế bào gốc vùng rìa giác mạc trên thực nghiệm và trên người đã có những thành công nhất định. Ghép tấm biểu mô giác mạc nuôi cấy mang lại hiệu quả tốt cho việc phục hồi cấu trúc và chức năng của giác mạ c. Xuất phát từ nhu cầu thực tế trong nước, nhiều bệnh nhân bị hội chứng suy giảm tế bào gốc vùng rìa cần được điều trị và với mong muốn đưa ra được một phương pháp hiện đại điều trị hội chứng này, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu nuôi cấy tế bào rìa giác mạc và ứng dụng trong điều trị một số tổn thương giác m ạc”. [...]... nhỡn thy Mảnh mô vùng rìa sau khi đợc lấy khỏi mắt sẽ đợc làm sạch 2 lần với PBS có chứa kháng sinh, kháng nấm (dung dịch để rửa màng ối) v c loại bỏ củng mạc, mống mắt, nội mô giác mạc, màng tiếp hợp và bao tenon Phần mô còn lại đợc x lý nuụi cy.Vic x lý mnh vựng rỡa nuụi cy khỏc nhau trong nghiờn cu ca cỏc tỏc gi Liu S và cộng sự (2006) đã xử lý mảnh bằng dispase II (1,2 UI/ml trong dung dịch muối... (2006) đã xử lý mảnh bằng dispase II (1,2 UI/ml trong dung dịch muối đẳng trơng của Hank không có Mg2+ và Ca2+) ở 37o , 5% CO2 trong 10 phút [28] Nakamura.T và cộng sự (2004) lại xử lý mảnh mô vựng rỡa bằng 0,25% trypsin và 0,02% EDTA trong 5 phút [ 32] Nng ca dispase hoc trypsin cú th khỏc nhau trong cỏc nghiờn cu Mt s tỏc gi ỏp dng nuụi cy bng dch treo TBBMVR: Cỏc t bo biu mụ vựng rỡa c tỏch riờng... cú b xung penicilin, streptomycin v amphotericin B 24 + No b lp biu mụ bng ammonium 10% v c hc: Cỏc tm mng i ra trong DMSO vi cỏc nng khỏc nhau Ra bng PBS Ngõm trong Ammonium 10% No b lp biu mụ v trung mụ Ra li bng PBS - Bo qun mng i ó x lý trong dung dch DMSO 15% nhit -800C (s dng trong 6 thỏng) - Khi s dng, ró ụng nhit phũng, ra li bng PBS - Cng mng i lờn phin hoc lng nuụi cy - Lm tiờu bn... giỏc mc c ra bng PBS cú b sung khỏng sinh, khỏng nm + Ct nh thnh cỏc mnh 1x1mm - Mnh mụ vựng rỡa c x lý theo 3 phng phỏp: 25 +Khụng x lý enzym + trong dung dch trypsin 0,1% + EDTA 0,1% trong t m 370, thi gian: 7 phỳt + trong dung dch dispase II 2,4 UI/ml trong t m 370 Dng tỏc ng ca dispase bng EDTA 0,02% nhit phũng, thi gian 23 phỳt - Nuụi cy cỏc mnh mụ ó c x lý trờn nn mng i ỏnh giỏ s phỏt trin... t bo gc (stem cell factor) Bờn cnh ú FBS cũn lm tng nht trong mụi trng v duy trỡ mt ỏp sut thm thu thớch hp cho cỏc t bo c nuụi cy Tuy nhiờn giỏ thnh ca FBS rt cao BS l loi huyt thanh cng thng c dựng b sung vo mụi trng nuụi cy Vai trũ ca BS cng tng t nh FBS Mt s tỏc gi cho rng hiu qu nuụi cy t bo trong mụi trng DMEM cú b sung BS tng t nh trong mụi trng DMEM cú b sung FBS Ngoi FBS v BS, nuụi cy... Chc nng ca t bo biu mụ BMNC c h tr bi nguyờn bo si nhu mụ v cht c bn S trong sut ca giỏc mc ph thuc vo s sp xp ca cỏc si collagen v s ng nht v kớch thc si cng nh khong cỏch gia cỏc si Trong quỏ trỡnh hn gn biu mụ giỏc mc, cht cn bn ngoi bo cú cha cỏc thnh phn nh Fibronectin, enzym protease, cỏc yu t phỏt trin 9 cú vai trũ quyt nh trong s kt dớnh v di chuyn trờn b mt chõn bỡ giỏc mc ca cỏc t bo biu mụ... sch 2 ln na vi PBS vụ trựng [23] Nhng Sun C C thỡ vi EDTA 0,1% trong 30 phỳt [40] 12 Theo Song E v cng s thỡ loi b t bo biu mụ mng i bng cỏch vi 0,25% trypsin- 0,02% EDTA 37o C trong 2h lm mt s kt dớnh ca t bo; sau ú dựng no biu mụ no nh nhng ri ra sch bng PBS vụ trựng [39] Cng vi nng men ny nhng theo Yiqui Du, Jing Chen thỡ ch trong 30 phỳt Jun Shimazaki v cng s (2002) li loi b biu mụ ca mng... cy bng dch treo: - Git th, ly ton b giỏc mc v VRGM - Ra sch giỏc mc bng PBS - giỏc mc trong dispase II 2,4 UI/ml trong t 370C, 5% CO2, thi gian 1 gi - Dng tỏc ng ca dispase bng EDTA 0,02%, thi gian 2 phỳt - Ra bng PBS - No ly lp biu mụ - Ly tõm ly cỏc t bo biu mụ - To dch treo cú mt t bo 1x105 t bo/ml -Nuụi cy trong lng nuụi cy 2.3.2.2 Th nghim trờn bnh nhõn t nguyn Tin hnh sau khi cú kt qu nh hng... cy mnh mụ hoc dch treo ca biu mụ vựng rỡa giỏc mc trong t 370C, 5% CO2 Thay mụi trng 2 ngy 1 ln Theo dừi s phỏt trin ca cỏc t bo biu mụ giỏc mc bng kớnh hin vi soi ni Khi cỏc t bo ó ph kớn ỏy ca lng nuụi cy, s dng k thut to tng (air lifting) tng s hng cho tm biu mụ nuụi cy trong thi gian 2-4 ngy * Ly tm biu mụ nuụi cy nh danh hoc ghộp li cho th (trong thc nghim) hoc cho bnh nhõn (trờn th nghim lõm... yu t sinh hc s phỏt huy tỏc dng trong quỏ trỡnh hn gn biu mụ b mt nhón cu Mc dự vy nhng mng i bo qun hin nay 13 c s dng ph bin vỡ tớnh tin li, trc khi nuụi cy hay phu thut khụng mt nhiu thi gian chun b [35] Nh vy, vn cha cú s thng nht gia cỏc tỏc gi v vn chun b mng i phc v nuụi cy : nguyờn hay loi b biu mụ 1.3 Nuụi to tm biu mụ giỏc mc t t bo gc vựng rỡa giỏc mc Trong nhng nm gn õy, cụng ngh nuụi . Ch nhim ti: PGS.TS. Nguyn Th Bỡnh C quan ch trỡ ti: Trng i hc Y H ni 8020 H Ni - 2009 5 B Y T TRNG I HC Y H NI o0o BO CO KT QU NGHIấN CU