Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 378 KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ENZYME CELLULASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS INVESTIGATION OF CULTURING AND EXTRACTING CELLULASE OF BACILLUS SUBTILIS SVTH: Trần Thị Ánh Tuyết, Trương Quốc Huy Lớp 05SH, Khoa Hóa, Trường Đại Học Bách khoa GVHD: PGS.T.S Trần Thị Xô, ThS. Ngô Thái Bícch Vân, KS. Phạm Trần Vĩnh Phú Khoa Hóa, Trường Đại Học Bách khoa TÓM TẮT Enzyme cellulase được tổng hợp nhiều ở Bacillus subtilis và có nhiều ứng dụng quan trọng. Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện nuôi cấy Bacillus subtilis và phương pháp tách chiết để thu nhận enzyme cellulase. Kết quả thu được cho thấy ở nhiệt độ 40 o C, pH=7,0 và thời gian nuôi 30h, lượng enzyme cellulase sinh ra là lớn nhất. Phương pháp tách chiết cellulase bằng dung môi aceton cho hiệu quả cao hơn dung môi ethanol. ABSTRACT Cellulase, which produced in a great quantity by Bacillus subtilis, has many important applications. In this project, we investigated cultivation conditions and methods to obtain cellulase from the culture of Bacillus subtilis. The results show that at 40 0 C, pH=7,0 and 30 hour of cultivation, cellulase production is highest. That extracting celluase by using aceton is more effective than using ethanol. 1. Mở đầu Chủng Bacillus subtilis được phát hiện bởi Ferdinand Cohn vào năm 1872.[1] Bacillus subtilis là trực khuẩn, Gram dương, kích thước (3- 5) × 0.6µm, có khả năng sinh bào tử và là loài sinh vật tự dưỡng, hiếu khí hoặc kị khí tùy nghi.[2] Hệ enzyme của Bacillus subtilis rất phong phú và đa dạng gồm protease,[6] amylase,[7] glucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase, pectinase [5]. Bacillus subtilis đã được ứng dụng khá nhiều trong các ngành công nghiệp đặc biệt là công nghiệp sản xuất enzyme như protease, amylase [1] Đã có nhiều công trình nghiên cứu về ứng dụng của Bacillus subtilis trong chế biến thực phẩm, trích ly các chất từ thực vật, từ cây thuốc [3] Cùng với Bacillus subtilis, hệ enzyme cellulase cũng được nghiên cứu từ lâu. [4]Enzyme này là một phức hệ gồm nhiều enzyme tham gia vào quá trình chuyển hóa cellulose[14][15]. Enzyme exoglucanase hay C 1 Enzyme endogluconase hay C x Enzyme  -1,4-glucosidase Cellulase đã được sản xuất với qui mô công nghiệp và ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực chế biến thực phẩm; trong nông nghiệp, cellulase được dùng trong xử lý đất để tăng độ màu mỡ ; trong công nghiệp, cellulase được ứng dụng trong công nghệ sản xuất ethanol [4] Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 379 Với mục tiêu thu nhận cellulase từ chủng Bacillus subtilis, trước tiên chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, thời gian nuôi đến sự sinh cellulase của Bacillus subtilis. Tiếp đến chúng tôi tiến hành đánh giá hiệu quả chiết tách enzyme bằng hai dung môi axeton và ethanol. 2. Đối tƣợng và phƣơng pháp nghiên cứu 2.1. Đối tượng Chủng Bacillus subtilis (V 5 ) được nuôi cấy và bảo quản tại phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học, khoa Hóa, trường Đại học Bách Khoa Đà Nẵng. 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp hoạt hóa chủng Bacillus subtilis Chủng Bacillus subtilis được hoạt hóa trên môi trường với thành phần: NaCl 0,5%, pepton 1 %, Cao nấm 1 %, Cao thịt 0,3 %, Agar 0,7 %, pH = 7.[3] 2.2.2. Phương pháp định tính khả năng sinh enzyme cellulase Chúng tôi sử dụng phương pháp cấy điểm trên môi trường hoạt hóa có bổ sung CMC 1 %, ủ ở nhiệt độ 30 0 C trong 24h. Sau đó nhuộm màu bằng thuốc thử Lugol và đo đường kính vòng thủy phân. 2.2.3. Phương pháp thu nhận dịch chiết enzyme thô Nuôi cấy chủng Bacillus subtilis trong môi trường lỏng với thành phần CMC 1 %, Glucose 0,1 %, Pepton 5 %, Cao nấm 2,5 % ở các thời điểm, nhiệt độ và pH khác nhau. Sau đó ly tâm ở tốc độ 8000 vòng/phút, thu dịch nổi enzyme.[3] 2.2.4. Phương pháp xác định hoạt độ enzyme Phương pháp đục lỗ thạch: Môi trường xác định hoạt tính enzyme cellulase là CMC 1%, Agar 2%. Đường kính thủy phân được xác định tương tự như phần 2.2.3 Phương pháp đường khử Bernfeld : Nguyên tắc phương pháp này dựa vào phản ứng màu của nhóm C=O với 3, 5-dinitrosalicilic acid (DNS), giá trị mật độ quang đo được ở bước sóng 540 nm phản ánh lượng đường được tạo thành từ quá trình phân cắt phân tử cellulose của enzyme cellulase.[8][10][13] Phương pháp chiết tách enzyme Sử dụng hai dung môi hữu cơ : aceton và etanol 90 0 . Tiến hành kết tủa dịch chiết enzyme thô theo tỉ lệ 1 :4 (V dịch chiết :V dung môi), ủ hỗn hợp ở -20 0 C trong 60 phút, ly tâm 13000 vòng/phút, thu cặn. So sánh hiệu quả chiết tách của aceton và etanol 90 0 bằng phương pháp đục lỗ thạch (xem phần 2.2.5) 3. Kết quả 3.1. Kết quả hoạt hóa và định tính khả năng sinh enzyme cellulase của chủng V 5 Để kiểm tra khả năng sống sót của chủng sau quá trình bảo quản ở - 20 0 C, chúng tôi tiến hành hoạt hóa trên môi trường tối thiểu (Hình 1.a), đồng thời xác định khả năng sinh enzyme cellulase (Hình 1.b). Kết quả hoạt hóa cho thấy khuẩn lạc lên rất mạnh, ít ghồ ghề, màu trắng, có hình răng cưa. Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 380 3.2. Kết quả khảo sát sự tăng trưởng và khả năng sinh enzyme cellulase theo thời gian 3.2.1. Kết quả đường cong tăng trưởng Chúng tôi tiến hành nuôi mẫu ở các thời điểm 0h, 4h, 6h, 12h, 18h, 24h, 30h, 32h, 34h và 36h, ở nhiệt độ 30 0 C xác định giá trị mật độ quang ở bước sóng 600nm. Kết quả đường cong tăng trưởng của Bacillus subtilis (V 5 ) ở các thời điểm khác nhau được biểu diễn ở biểu đồ hình 2. Dựa vào đồ thị chúng tôi nhận thấy chủng V 5 bắt đầu tăng trưởng sau 6h nuôi cấy, từ thời điểm 18h - 30h chủng đi vào pha ổn định và thời điểm 32-36h là giai đoạn suy tàn. 3.2.2. Kết quả đường kính thủy phân Đồng thời với việc đo giá trị đo OD 600 , chúng tôi tiến hành thu dịch enzyme thô và khảo sát khả năng sinh cellulase theo thời gian của chủng V 5 . Kết quả phân giải CMC 1 % trên môi trường thạch rắn cho thấy hoạt độ của cellulase tăng tuyến tính theo thời gian và đạt giá trị lớn nhất ở thời điểm 30h. (a) (b) Hình 1. Kết quả hoạt hóa (Hình a) và định tính khả năng sinh enzyme (Hình b) Hình 2. Đồ thị biểu diễn sự tăng trưởng của vi khuẩn Bacillus subtilis theo thời gian Hình 3. Kết quả đường kính thủy phân theo thời gian Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 381 3.2.3. Kết quả xác định nồng độ glucose sinh ra Ngoài phương pháp khuếch tán đĩa, chúng tôi định lượng hoạt độ cellulase bằng phương pháp đường khử a. Kết quả tƣơng quan giữa nồng độ Glucose chuẩn và giá trị OD540nm b. Nồng độ Glucose sinh ra trong phản ứng thủy phân CMC 1% của cellulase Trước tiên chúng tôi tiến hành dựng đồ thị tương quan giữa nồng độ Glucose chuẩn và giá trị OD 540 (Hình 4). Nồng độ Glucose giải phóng theo thời gian được ngoại suy từ đường chuẩn. Kết quả cho thấy tại thời điểm 32h và 34h nồng độ Glucose là lớn nhất. Như vậy, từ kết quả của đường kính thủy phân và nồng độ Glucose giải phóng, chúng tôi nhận thấy hoạt độ của enzyme cellulase mạnh nhất trong pha ổn định của đường cong sinh trưởng. 3.3. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase theo nhiệt độ Chúng tôi tiến hành nuôi mẫu ở nhiệt độ 30 0 C, 40 0 C, 50 0 C và 60 0 C trong thời gian 30h. Sau đó xác định hoạt độ enzyme dựa vào nồng độ Glucose sinh ra trong phản ứng thủy phân CMC 1%. Hình 4. Đồ thị thể hiện tương quan giữa nồng độ glucose chuẩn và giá trị mật độ quang 540nm Hình 5. Đồ thị biểu diễn nồng độ Glucose giải phóng theo thời gian Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 382 Dựa vào đồ thị chúng tôi nhận thấy tại nhiệt độ 500C nồng độ Glucose sinh ra là lớn nhất. Kết quả thu được cho phép kết luận chủng Bacillus subtilis có khả năng chịu nhiệt độ cao. Sau 30 giờ nuôi cấy, 500C là khoảng nhiệt độ tốt nhất cho quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase. 3.4. Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme cellulase theo pH Chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng Bacillus subtilis trong môi trường có tính axit (pH=5 và pH=6), môi trường trung tính (pH=7) và môi trường kiềm (pH=8 và pH=9) ở nhiệt độ 30 0 C, trong thời gian 30h. Sau đó xác định hoạt độ enzyme dựa vào nồng độ Glucose sinh ra trong phản ứng thủy phân CMC 1 %. Kết quả cho thấy trong môi trường trung tính và môi trường có tính kiềm, Bacillus subtilis sinh tổng hợp enzyme cellulase tốt hơn môi trường có tính axit, thể hiện qua nồng độ Glucose được giải phóng (Hình 7). 3.5. Kết quả kết tủa enzyme cellulase từ dịch nuôi lắc Bacillus subtilis ở 30 0 C trong 30 giờ. Chúng tôi tiến hành tủa dịch nuôi cấy lắc Bacillus subtilis để thu nhận enzyme cellulase bằng hai loại dung môi là aceton và etanol 90 0 (xem phần 2.2.6). So sánh hiệu quả chiết tách của 2 dung môi dựa vào đường kính thủy phân CMC 1 % của dịch tủa. Hình 6 . Đồ thị biểu diễn nồng độ Glucose giải phóng theo nhiệt độ Hình 7. Đồ thị biểu diễn nồng độ Glucose theo pH Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 383 Bảng1. Kết quả đường kính vòng thủy phân CMC 1 % của enzyme cellulase trước và sau khi kết tủa bằng aceton và bằng etanol 90 0 Dung môi hữu cơ Kết quả đường kính thủy phân trước tủa (cm) Kết quả đường kính thủy phân sau tủa (cm) Aceton 2,2 2,4 Etanol 90 0 2,2 2,3 Như vậy, phương pháp tủa sử dụng dung môi hữu cơ aceton và etanol 90 0 đều làm tăng hoạt độ của enzyme cellulase. Trong đó, kết tủa enzyme bằng aceton làm tăng 9,1 % và kết tủa bằng etanol 90 0 làm tăng 4,5% hoạt độ enzyme ban đầu. 4. Kết luận Từ những kết quả thu được, chúng tôi kết luận: Khi nuôi cấy ở 30 0 C, sự tăng trưởng của chủng Bacillus subtilis ổn định trong khoảng thời gian 18-30 giờ và sau thời điểm này (từ 32 -34 giờ), lượng enzyme cellulase sinh ra là lớn nhất. Môi trường trung tính (pH=7) là môi trường thích hợp nhất cho quá trình tổng hợp cellulase của chủng Bacillus subtilis khi nuôi cấy ở 30 0 C. Chủng Bacillus subtilis sử dụng trong đề tài này có khả năng chịu nhiệt độ cao, từ 30 0 đến 50 0 C. Phương pháp tủa enzyme cellulase từ dịch nuôi cấy lắc bằng dung môi aceton tỏ ra có hiệu quả hơn dung môi etanol 90 0 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Nguyễn Thị Xuân Hiền, Nghiên cứu khả năng chịu nhiệt của bào tử và enzym protease của Bacillus subtilis, khóa luận tốt nghiệp, Đại học Bách Khoa Đà Nẵng. [2]. Lê Xuân Phương , Vi sinh vật học công nghiệp (2001), NXB Xây dựng Hà Nội. Hình 8. Kết quả đường kính thủy phân của enyme trước và sau khi kết tủa bằng acetone và etanol 90 0 Tuyển tập Báo cáo Hội nghị Sinh viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 384 [3]. Phạm Thi Hồng Thắm, Nghiên cứu phân lập và bước đầu khảo sát một số vi sinh vật phân huỷ cellulose từ vỏ lụa sắn, khóa luận tốt nghiệp, Đại học Bách Khoa Đà Nẵng. [4]. Trần Xuân Ngạch, Công nghệ enzyme, (2005), Đại học Bách Khoa Đà Nẵng. [5]. D.R.Kashyap, S.Chandra, A.Kaul, R.Tewari, “Production, purification and characterization of pectinase from a Bacillus sp. DT7”, World Journal of Microbiology & Biotechnology Vol 16, (2000), tr. 277-282. [6]. Harry P. Rappaport, “A Bacillus Subtilis Proteinase”, The Journal of Biological Chemistry, (1965), Vol. 240, No. 1, [7]. Konsoula Z., Kyriakides M.L, “α-amylase production in aqueous two-phase systems by Bacillus subtilis”, FEBS Journal 272, (2005), tr. 2. [8]. Kwong-Yu Chan, K. S. Au, “Studies on cellulase production by a Bacillus subtilis”. Antonie van Leeuwenhoek 53, (1987), tr 125-136 [9]. Maria Y. Yang và cộng sự, “Cloning of the Neutral Protease Gene of Bacillus subtilis and the use of the Cloned Gene to Create an In Vitro – Derived Deletion Mutation”, Journal of Bacteriology, tr. 15-21. [10]. Po-Jui Chen, Tao-Chun Wei, Yao-Tsung Chang, Lương-Ping lin, “Carboxymethyl xenlulaza”, CBhote.n [11]. J. Perez J. Munoz-Dorado, “Biodegradation and biological treatments of cellulose, hemicellulose and lignin”, Dd Microbio,( 2002) [12]. Zhi W., Song J., Bi J. and Ouyang F., “Partial purification of α-amylase from culture supernatant of Bacillus subtillis in aqueous two-phase systems”, Bioprocess Biosyst Eng.27, (2004), tr. 3-7. [13]. http://www.springerlink.com/content/x111666875j6lhw8/ [14]. http://www.fao.org/docrep/w7241e/w7241e08.htm [15]. http://www.worthington-biochem.com/CEL/default.html . viên Nghiên cứu Khoa học lần thứ 7 Đại học Đà Nẵng năm 2010 378 KHẢO SÁT CÁC ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY VÀ PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT ENZYME CELLULASE TỪ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS INVESTIGATION OF CULTURING. Enzyme cellulase được tổng hợp nhiều ở Bacillus subtilis và có nhiều ứng dụng quan trọng. Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành khảo sát các điều kiện nuôi cấy Bacillus subtilis và phương pháp. phương pháp tách chiết để thu nhận enzyme cellulase. Kết quả thu được cho thấy ở nhiệt độ 40 o C, pH=7,0 và thời gian nuôi 30h, lượng enzyme cellulase sinh ra là lớn nhất. Phương pháp tách chiết