ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÕ THỊ THANH TRANG BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ASPERGILLUS FLAVUS SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN TRÊN NGŨ CỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT QUANG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 4240 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. LÝ THỊ THANH LOAN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2009 i L L Ờ Ờ I I C C Ả Ả M M Ơ Ơ N N Để hoàn thành luận văn này, trước hết tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: TS. LÝ THỊ THANH LOAN Giám Đốc Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa dịch bệnh Thủy sản khu vực Nam Bộ Cô là người đã truyền đạt cho em những kinh nghiệm quý báu, những bài học thật bổ ích giúp em phát triển trong công việc và trong nghiên cứu khoa học, là người luôn động viên và tận tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện để em hoàn thành lu ận văn này. Em xin chúc Cô thật nhiều sức khỏe để tiếp tục niềm đam mê nghiên cứu khoa học của mình và luôn tìm thấy niềm vui trong công việc và cuộc sống. Tiếp đến tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến ban lãnh đạo Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy sản vùng 4 đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành tốt khóa học. Xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô trong khoa sinh học đã tận tình giảng dạy trong suố t thời gian học đại học và cao học tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM. Xin cảm ơn Thạc sĩ Nguyễn Tiến Dũng, anh vừa là một người thầy vừa là một người cấp trên thật đáng quý. Anh đã luôn động viên, định hướng cho những người trẻ như chúng em có thêm nghị lực phấn đấu vươn lên trong học tập cũng như trong công việc. Cảm ơn các Anh, Chị, các bạn và các em đang làm việc tại Phòng Kiểm nghiệm Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy sản vùng 4 đã luôn nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận văn này. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Trung tâm Quốc gia Quan trắc, Cảnh báo Môi trường và Phòng ngừa Dịch bệnh Thủy sản khu vực Nam Bộ, Trung tâm Kỹ thuật 3, Viện Pasteur Tp.HCM, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM đã hỗ trợ và tạo mọi đi ều kiện cho tôi hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này. Xin cảm ơn Anh đã luôn động viên em để em có thể vượt qua những khó khăn trong cuộc sống. Con cũng xin cảm ơn gia đình đã luôn khuyến khích và hỗ trợ để con có được ngày hôm nay. ii MỤC LỤC Lời cảm ơn i Mục lục ii Danh mục chữ viết tắt iv Danh mục Bảng v Danh mục Hình viii MỞ ĐẦU 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5 1.1. Vài nét về đối tượng nghiên cứu 5 1.1.1. Hình thái: 5 1.1.2. Sinh thái 5 1.1.3. Độc tố aflatoxin do Aspergillus flavus sản sinh 8 1.1.4. Biện pháp phòng ngừa đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm: 13 1.2. Tổng quan về Aflatoxin 16 1.2.1. Lịch sử phát hiện aflatoxin [8]: 16 1.2.2. Công thức cấu tạo và một số tính chất lý hoá của Aflatoxin [8] 16 1.2.3. Sự hiện diện và phát triển của Aflatoxin B1 trong tự nhiên: 17 1.2.4. Tác hại của Aflatoxin: 19 1.2.5. Mức cho phép tối đa của các loại độc tố trong thức ăn chăn nuôi [2]: 24 1.3. Phương pháp phát hiện A. flavus 27 1.3.1. Dựa vào đặc điểm hình thái [17], [18]: 27 1.3.2. Dựa trên phương pháp sinh học phân tử [18]: 28 1.4. Đặc tính và ứng dụng Cylodextrin [19] 30 1.4.1. Đặc tính 30 1.4.2. Cấu trúc và tính chất của các cyclodextrin 32 1.4.3. Đặc điểm của phức bao cyclodextrin 33 1.4.4. Ứng dụng của phức bao: 35 1.4.5. Tương tác của cyclodextrin với aflatoxin [12, 15] 35 1.5. Một số khái niệm trong quy trình xác nhận hiệu lực của phương pháp [14].37 1.5.1. Giới hạn phát hiện 37 1.5.2. Độ nhạy, độ đặc hiệu và tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả 37 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 38 2.1. Vật liệu: 38 2.1.1. Chủng chuẩn Aspergillus và mẫu thực phẩm 38 2.1.2. Thiết bị và dụng cụ chính 39 2.1.3. Môi trường và hóa chất 40 2.2. Phương pháp nghiên cứu 40 iii 2.2.1. Phương pháp chuẩn bị phòng ẩm nuôi cấy mốc [13] 40 2.2.2. Phương pháp định danh nấm mốc theo FAO – 1992 [10] 41 2.2.3. Phương pháp gây nhiễm chủng nấm mốc vào mẫu thực phẩm [14] 41 2.2.4. Phương pháp tách chiết mẫu (đĩa thạch) để phân tích HPLC [11] 44 2.2.5. Phương pháp khảo sát sự phát huỳnh quang của các chủng Aspergillus flavus sinh aflatoxin 44 2.2.6. Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện đặc tính sinh aflatoxin dựa trên đặc điểm phát huỳnh quang. 45 2.2.7. Phương pháp xác định giới hạn phát hiện [14] 47 2.2.8. Xác định các thuộc tính của phương pháp [14] 48 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 51 3.1. Kết quả khảo sát đặc tính sinh Aflatoxin (dựa vào đặc điểm phát huỳnh quang trên môi trường thạch) của một số chủng Aspergillus flavus. 51 3.2. Kết quả khảo sát các điều kiện tác động đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus 56 3.2.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus: 57 3.2.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus: 61 3.2.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus: 66 3.2.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus: 70 3.2.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ cyclodextrin đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus: 74 3.2.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của ảnh hưởng của kháng sinh (Chloramphenicol) đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus: 78 3.3. Xây dựng dự thảo phương pháp phát hiện A. flavus sinh độc tố Aflatoxin B1 trong ngũ cốc và thức ăn chăn nuôi dựa trên đặc điểm phát huỳnh quang của Aflatoxin khi kết hợp với cyclodextrin 80 3.4. Xác định giới hạn phát hiện của phương pháp mới xây dựng. 80 3.5. Xác định các thông số phương pháp mới: 85 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN & ĐỀ NGHỊ 90 4.1. Kết luận 90 4.2. Đề nghị: 90 TÀI LIỆU THAM KHẢO 91 PHỤ LỤC 1: MÔI TRƯỜNG 94 PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ KIỂM TRA AFLATOXIN BẰNG HPLC 97 PHỤ LỤC 3: QUY TRÌNH ĐỀ XUẤT 98 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 1. ATCC: American Type Collection Culture: Bộ sưu tập chủng chuẩn của Mỹ. 2. FAO: Food and Agriculture Organization of the United Nations: Tổ chức nông lương thế giới. 3. FDA (Food and Drug Administration, Hoa Kỳ ): Cơ quan quản lý Thực phẩm và Dược phẩm của Mỹ. 4. HPLC: high performance liquid chromatography: phương pháp sắc ký lỏng cao áp 5. ISO: International Organization for Standardization: Tổ chức Quốc tế về tiêu chuẩn hóa. 6. NRRL: bảo tàng chủng chuẩ n của bộ Nông nghiệp Mỹ 7. TCN: Tiêu chuẩn ngành 8. VTCC: Vietnam Type Collection Culture: Bộ sưu tập chủng chuẩn Việt Nam. v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Ảnh hưởng của chủng A. flavus và các điều kiện nuôi cấy để sản sinh ra Aflatoxin 11 Bảng 1.2. Ảnh hưởng của các đường hexose khác nhau lên sản lượng Aflatoxin 12 Bảng 1.3. Qui định hàm lượng tối đa độc tố nấm mốc Aflatoxin B1 và hàm lượng tổng số các Aflatoxin (B1+B2+G1+G2) được tính bằng mg trong 1 kg thức ăn hỗn hợp hoàn chỉnh cho gia súc gia cầm (ppb): 24 Bảng 1.4. Những quy định mức cho phép Aflatoxin trong thức ăn ở Mỹ (FAO, 1995): 25 Bảng 1.5. Những quy định về hàm lượng Aflatoxin B1 tối đa trong thức ăn gia súc, gia cầm ở các nước thuộc EU: 26 Bảng 2.1. Danh mục các chủng A. flavus sử dụng trong nghiên cứu khảo sát chủng có và không có khả năng sinh độc tố Aflatoxin B1 38 Bảng 2.2. Cách sắp xếp tần suất 4 nhóm kết quả: 50 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát đặc tính sinh Aflatoxin dựa vào đặc điểm phát hu ỳnh quang của các chủng A. flavus 54 Bảng 3.2. Kết quả kiểm tra mối tương quan giữa việc sinh Aflatoxin và việc phát huỳnh quang xung quanh khuẩn lạc A. flavus 56 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 02 58 Bảng 3.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến sự phát tri ển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 05 59 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 30 60 vi Bảng 3.6. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 02 63 Bảng 3.7. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 05 64 Bảng 3.8. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của môi trường đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 30 65 Bảng 3.9. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 02 67 Bảng 3.10. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã s ố 05 68 Bảng 3.11. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 30 69 Bảng 3.12. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 02 71 Bảng 3.13. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi tr ường đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 05 72 Bảng 3.14. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH môi trường đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 30 73 Bảng 3.15. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ methyl-β-cyclodextrin đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang củ a các chủng A. flavus có mã số 02 75 Bảng 3.16. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ methyl-β-cyclodextrin đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 05 76 Bảng 3.17. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ methyl-β-cyclodextrin đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus có mã số 30 77 vii Bảng 3.18. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của ảnh hưởng của kháng sinh (Chloramphenicol) đến sự phát triển và khả năng phát huỳnh quang của các chủng A. flavus 79 Bảng 3.19 Khảo sát mật độ gây nhiễm phù hợp trên nền mẫu thức ăn dạng hạt ở 03 chủng A. flavus: 81 Bảng 3.20 Khảo sát mật độ gây nhiễm phù hợp trên nền mẫu thức ăn dạng bộ t ở 03 chủng A. flavus 82 Bảng 3.21. Giới hạn phát hiện A. flavus trên nền mẫu thức ăn dạng hạt 84 Bảng 3.22. Giới hạn phát hiện A. flavus trên nền mẫu thức ăn dạng bột 84 Bảng 3.23. Kết quả khảo sát các thông số của phương pháp khi phân tích mẫu bằng phương pháp mới xây dựng và các phương pháp tham chiếu: 87 Bảng 3.24. Các thuộc tính của phương pháp trên nền mẫu th ức ăn dạng hạt 88 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình thái nấm mốc A. flavus 5 Hình 1.2. Nấm mốc A. flavus trên hạt đậu 7 Hình 1.3. Nấm mốc A. flavus trên lạc 7 Hình 1.4. Công thức cấu tạo hoá học của AFB1, AFB2, AFG1 và AFG2 (Vitoria, 2001) 17 Hình 1.5. (a) A. flavus trên môi trường AFPA, sau 7 ngày nuôi cấy ủ ở 25ºC, với đặc tính chuyển màu ở mặt sau môi trường thành màu cam. 28 (b) A. flavus sinh độc tố Aflatoxin phát triển trên đĩa CCA nhỏ được quan sát dưới đèn UV, sau 7 ngày ủ; đĩa CCA lớn không cấy chủng nấm A. flavus 28 Hình 1.6. Cyclodextrin α, β, γ 31 Hình 1.7. Cấu trúc không gian của phức bao cyclodextrin với phân tử khách thể - 33 Hình 1.8. Mô hình tương tác giữa cyclodextrin và Aflatoxin dạng HINT/GOLD - 36 Hình 1.9. Bản đồ đường mức cực kỵ nước của AFB1, phần kỵ nước màu xanh lá và phần hiếu nước màu xanh da trời 36 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình gây nhiễm bào tử nấm mốc vào mẫu 43 Hình 2.2. Sơ đồ quy trình xác định giới hạn phát hiện của phương pháp 48 Hình 3.1. Khu ẩn lạc A. flavus trên SAB sau 3 ngày 52 Hình 3.2. Hình thái A. flavus (thân nhám) 52 Hình 3.3. Bào tử A. flavus 52 Hình 3.4. Bọng hình chùy đến cầu A. flavus 52 Hình 3.5. Chủng A. oryzae không phát huỳnh quang (trái), nấm A. flavus phát huỳnh quang (phải) trên môi trường SAB 0,3% methyl-β-cyclodextrin trong 3 ngày ở 28 o C 53 ix Hình 3.6. Chủng A. ochraceus không phát huỳnh quang (trái), chủng A. flavus phát huỳnh quang (phải) trên môi trường SAB 0,3% methyl-β-cyclodextrin trong 3 ngày ở 28 o C 53 Hình 3.7. Chủng A. flavus phát huỳnh quang trên cả hai đĩa thạch YES (bên trái không bổ sung và bên phải có bổ sung 0,3% methyl-β-cyclodextrin) trong 3 ngày ở 28 o C 62 Hình 3.8. Chủng A. flavus phát huỳnh quang trên đĩa thạch YES có bổ sung 0,3% methyl-β-cyclodextrin (phải), không phát huỳnh quang trên PDA có bổ sung 0,3% methyl-β-cyclodextrin (trái) trong 3 ngày ở 28 o C 62 [...]... Nội dung nghiên cứu Sàng lọc các chủng A flavus sinh Aflatoxin dựa trên đặc điểm phát huỳnh quang Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát huỳnh quang của các chủng A flavus sinh Aflatoxin Xây dựng dự thảo phương pháp “ Phát hiện Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin trên ngũ cốc bằng phương pháp phát quang Xác nhận hiệu lực sơ cấp của phương pháp * Nơi thực hiện - Trung tâm Chất lượng Nông Lâm Thủy... nghiên cứu: Bước đầu xây dựng phương pháp phát hiện Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin trong ngũ cốc bằng phương pháp phát quang HVTH: VÕ THỊ THANH TRANG LUẬN VĂN THẠC SĨ GVHD: TS LÝ THỊ THANH LOAN 3 MỞ ĐẦU * Mục tiêu của đề tài: Xây dựng quy trình phát hiện nấm mốc Aspergillus flavus có khả năng sinh độc tố Aflatoxin nhằm kiểm soát chất lượng ngũ cốc cũng như cung cấp những dẫn liệu khoa học... những loài có khả năng sinh độc tố với những loài không có khả năng sinh độc tố Với đối tượng đã chọn, chúng tôi đã khảo sát các yếu tố tác động đến việc sinh Aflatoxin để đưa ra các điều kiện tối ưu nhằm xây dựng một phương pháp mới phát hiện nấm mốc Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin được ghi nhận bằng việc phát huỳnh quang xung quanh khuẩn lạc khi quan sát dười đèn UV ở bước sóng 365nm Ngoài... năng có hoặc không có sinh độc tố Aflatoxin để có biện pháp xử lý hiệu quả * Luận điểm mới của đề tài: Ở nước ta hiện nay, trong các quy trình phát hiện nấm mốc A flavus dựa trên đặc điểm hình thái là chủ yếu và do đó chỉ phân biệt được loài mà không phân biệt được khả năng sinh độc tố Aflatoxin của loài đó Vì vậy, điểm mới của đề tài là xây dựng được phương pháp phát hiện nấm mốc A flavus trong đó có... bằng liên kết (1-4) do đó chúng được gọi là -, -, or -cyd] Các phân tử này được dùng để làm tăng khả năng phát huỳnh quang của Aflatoxin Với cơ sở lý thuyết nêu trên và với mục tiêu xây dựng phương pháp phát hiện nấm mốc A flavus sinh độc tố Aflatoxin, được sự đồng ý của Trường Đại học Khoa học Tự nhiên và cán bộ hướng dẫn khoa học, chúng tôi tiến hành đề tài nghiên cứu: Bước đầu xây dựng phương pháp. .. ngũ cốc bị nhiễm nấm mốc Aspergillus flavus có thể nguy hại đến tính mạng Trong khi hầu hết các chủng Aspergillus parasiticus đều sinh độc tố thì ở Aspergillus flavus sự sản sinh độc tố Aflatoxin thay đổi theo từng chủng Mặt khác, nó còn phụ thuộc vào điều kiện xung quanh, sự sản sinh Aflatoxin là kết quả của sự tác động qua lại giữa kiểu gen của chủng đó và điều kiện phát triển của nó [3] Phương pháp. .. các chủng Aspergillus parasiticus đều sinh độc tố thì ở Aspergillus flavus sự sản sinh độc tố Aflatoxin thay đổi theo từng chủng Mặt khác, nó còn phụ thuộc vào điều kiện xung quanh, sự sản sinh Aflatoxin là kết quả của sự tác động qua lại giữa genotype của chủng đó và điều kiện phát triển của nó [3] 1.1.3.1 Các chủng sinh độc tố : Đã có một số lớn quan sát về tính chất ít nhiều sinh độc tố của nhiều... nhất cho sự phát triển của nó, và cũng ở lạc độc tố Aflatoxin hình thành mạnh nhất Người ta ngiên cứu hơn 1.000 mẫu lạc thí nghiệm thì thấy lạc hạt có 3,3% số củ là rất độc - 1kg chứa trên 0,25mg Aflatoxin B1 (độc tố chủ yếu của Aspergillus flavus) và 21,7% số củ độc vừa, 75% số củ không độc Còn trên khô lạc: 42% số mẫu là rất độc, 49,3% độc vừa và chỉ có 8,7% là không độc Như vậy chất độc tích lũy... hai loài hay gặp nhất là Aspergillus và Penicilium [4], [6], [7] 1.1.3 Độc tố aflatoxin do Aspergillus flavus sản sinh Tên Aflatoxin đã được dùng để gọi một hỗn hợp độc tố do Aspergillus flavus sinh ra trước khi bản chất phức tạp của mỗi hợp chất được biết rõ Thực ra, Apergillus flavus chủ yếu sản sinh ra Aflatoxin B1 và các Aflatoxin khác có bản chất hóa học tương tự gọi là Aflatoxin G1, B2, G2 Trong... như vậy, nấm mốc có thể phát triển sinh độc tố được gọi là độc tố nấm (mycotoxin), gây ảnh hưởng đáng kể đến sức khỏe người tiêu dùng, đặc biệt là gây ung thư Trong đó, có thể kể đến Aflatoxin B1 (AFB1) Độc chất Aflatoxin được tạo ra từ các lọai nấm mốc thuộc giống Aspergillus, mọc trên các loài ngũ cốc, trong đó Aflatoxin B1 (AFB1) chủ yếu do loài Aspergillus flavus sinh ra có độc tính rất cao (Nabil . THANH TRANG BƯỚC ĐẦU XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN ASPERGILLUS FLAVUS SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN TRÊN NGŨ CỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÁT QUANG Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số:. tài nghiên cứu: Bước đầu xây dựng phương pháp phát hiện Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin trong ngũ c ốc bằng phương pháp phát quang GVHD: TS. LÝ THỊ THANH LOAN 3 MỞ ĐẦU HVTH: VÕ. thảo phương pháp “ Phát hiện Aspergillus flavus sinh độc tố Aflatoxin trên ngũ cốc bằng phương pháp phát quang . ¾ Xác nhận hiệu lực sơ cấp của phương pháp * Nơi thực hiện - Trung tâm Chất