LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP SVTH: Hoàng Hoài Sơn, 2007 - i - LỜI CẢM ƠN Đầu tiên tôi xin chân thành c ảm ơn thầy PGs. Ts. Lê Xuân Thám (Vi ện hạt nhân Tp. HCM), đã tận tình hướng dẫn, cung cấp t ài liệu, tạo điều kiện giúp đỡ tô i trong thời gian hoàn thành đ ề tài này. Tôi xin chân thành c ảm ơn Khoa Chế Biến trường ĐH Nha Trang đ ã tạo điều kiện tốt cho tôi được thực hiện tốt đề t ài. Xin chân thành c ảm ơn các Thầy cô ở bộ môn Công Nghệ Sinh Học tr ường ĐH Nha Trang đã giúp đỡ tôi thực hiện tốt đề tài. Xin cảm ơn cô Trần Lê Thu Thảo, giám đốc công ty TNHH – TM DoNa, cùng các anh chị trong công ty đã tạo cho tôi cơ sở để nghiên cứu tốt đề tài. Xin cảm ơn anh Phạm Ngọc Dương, Vườn Quốc gia Cát Ti ên đã giúp đỡ tôi trong kỹ thuật thực hành trong thời gian chúng tôi đi khảo sát nấm tại V ườn. Xin chân thành cảm ơn Bố mẹ cùng những người thân đã cho tôi một điều kiện tốt nhất về mặt tinh thần, vật chất, giúp tôi ho àn thành tốt khóa học. Cuối cùng tôi xin cảm ơn tập thể lớp 45CNSH v à các bạn đã giúp đỡ tôi trong thời gian vừa qua. Tp. H ồ Chí Minh, 10/2007. Hoàng Hoài Sơn LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP SVTH: Hoàng Hoài Sơn, 2007 - ii - LỜI NÓI ĐẦU Ở Việt nam, cho đến nay đ ã ghi nhận khoảng 15 lo ài nấm bào ngư (Trịnh Tam Kiệt, 1998; Lê Duy Thắng, 1999): P. abalonus, P. comucopiae, P. cytidiosus, P. djamor, P. eryngii, P. floridanus, P. globulifer, P. limpidus, P. ostreatus, P.pulmonarius, P. sajor -caju, P. salmoneostramineus, P. spicillfer, P. versiformis. Nếu tính cả loài vừa phát hiện: P.blaoensis (Lê Xuân Thám, 1999), đư ợc khảo cứu kỹ trong nghiên cứu này, và một số loài đang xếp trong các chi gần gũi khác thì số loài nấm Bào ngư ở Việt nam có thể v ượt quá 15. Tuy nhi ên số loài có mẫu lưu giữ thực rất ít, không quá 9 loài (ngay phòng thí nghi ệm của Viện Hạt nhân chỉ có nhiều nhất ở Việt nam cũng mới giữ giống nguy ên chủng của 7 loài). Hầu hết các cơ sở khác chỉ có 2 - 3 loài mà thôi. Không th ấy ghi nhận loài nào độc cả, trái lại hầu hết các lo ài Pleurotus được Singer cho là có th ể ăn được, hoặc ăn ngon; thực tế quá nửa số lo ài trên đã được nuôi trồng thành công khá phổ biến ở nước ta. Hiện nay chắc chắn số loài nấm bào ngư phát hiện trong nước ta và các loài nhập nội đã tăng nhiều về số lượng nhưng vẫn chưa có con số thống kê chắc chắn. Việc nghiên cứu về các loài nấm bao ngư chưa nhiều, và chưa được hệ thống hoá một số loài đã được khảo sát về sinh trưởng và phát triển như P. sajor-caju, P. cystidiosus, P. pulmonarius,… của từng nhóm nh à nghiên cứu với nguồn gốc giống khác nhau. Có thể kể ra như sau: Lê Xuân Thám đ ã khảo sát đặc điểm sinh học v à nuôi trồng nấm bào ngư dai P. pulmonarius mọc hoang dại ở Đ à Lạt. Lê Xuân Thám và Tr ần Hữu Độ cũng khảo sát trên nấm bào ngư P. sajor-caju có nguồn gốc từ Nhật Bản… Nhưng hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam, thường vẫn lẫn lộn cho rằng chỉ có một loài nấm dai vòng Letinus sajor-caju là chuẩn danh pháp còn khái ni ệm nấm bào ngư trơn Pleurotus sajor-caju là sự chồng tên… LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP SVTH: Hoàng Hoài Sơn, 2007 - iii - Do đó, trong đề tài “Nghiên cứu nấm Bào ngư trơn hoang d ại Pleurotus sajor- caju và nấm dai vòng Lentinus sajor-caju phát hiện ở Vườn quốc gia Cát Ti ên – hiện tượng đồng danh l oài” này chúng tôi mô t ả chi tiết và xác định sự tồn tại độc lập của chúng như hai lo ại đồng danh đặc sắc. Đồng thời nghi ên cứu tách phân lập giống nguyên chủng và tiến hành nuôi trồng công nghệ, góp phần phát triển nguồn t ài nguyên nấm quí của Việt Nam. LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP SVTH: Hoàng Hoài Sơn, 2007 - iv - Mục Lục Trang LỜI CẢM ƠN LỜI MỞ ĐẦU PHẦN I. TỔNG QUAN T ÀI LIỆU 1 I.1. Giới thiệu nấm Lentinus sajor-caju: 2 I.1.1. Nấm bào ngư trơn Pleurotus sajor-caju 2 I.1.2. Nấm dai vòng Lentinus sajor-caju 3 I.2. Gía trị dược học của nấm b ào ngư: 7 II.2.1. Khả năng chống khối u Sarcoma 180 của polysaccharide li ên kết protein tách từ nấm Pleurotus sajor -caju 8 I.3. Gía trị dinh dưỡng của nấm bào ngư 11 Phần II. VẬT LIỆU V À PHƯƠNG PHÁP 17 II.1. Đối tượng nghiên cứu 18 II.2. Phương pháp nghiên c ứu 20 II.3. Khảo sát sinh trưởng và phát triển hệ sợi nấm trên môi trường thuần khiết 20 II.4. Khảo sát sinh trưởng và phát triển hệ sợi trên môi trương giá th ể 21 II.4.1. Gía thể hạt lúa có bổ sung cám gạo 21 II.4.2. Gía thể mạt cưa 22 Phần III. KẾT QUẢ V À THẢO LUẬN 26 III.1. Kết quả phân tích h ình thái giải phẫu 27 III.2. Kết quả phân lập giống tr ên môi trường thuần khiết 31 III.2.1. Tốc độ lan tơ của nấm Pleurotus sajor-caju 33 III.2.2. Tốc độ lan tơ của nấm Lentinus sajor-caju 34 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP SVTH: Hoàng Hoài Sơn, 2007 - v - III.2.3. So sánh tốc độ phát triển hệ sợi của hai lo ài 36 III.3. Kết quả phân lập giống tr ên môi trường giá thể hạt lúa có bổ sung cám gạo 38 III.3.1. Tốc độ lan tơ của loài Pleurtus sajor-caju 39 III.3.2. Tốc độ lan tơ của loài Lentinus sajor-caju 40 III.3.3. So sánh t ốc độ lan tơ của hai loài trên môi trường hạt 41 III.4. Kết quả nuôi trồng tr ên giá thể mạt cưa cây cao su 42 III.4.1. Tốc độ phát triển hệ sợi của lo ài Pleurotus sajor -caju 42 III.4.2. Tốc độ lan tơ của loài Lentinus sajor-caju 44 III.4.3. So sánh tốc độ lan tơ của hai loài trên giá thể mạt cưa 45 Phần IV. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP SVTH: Hoàng Hoài Sơn, 2007 - 1 - Phần I TỔNG QUAN TÀI LIỆU LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP SVTH: Hoàng Hoài Sơn, 2007 - 2 - I. Giới thiệu nấm Lentinus sajor-caju và Pleurotus sajor-caju Ở nhiều nơi và cả Việt nam, thường vẫn lẫn lộn cho rằng chỉ có một lo ài: nấm dai vòng Lentinus sajor-caju là chuẩn danh pháp, còn khái niệm nấm bào ngư trơn Pleurotus sajor-caju là sự chồng tên, không phải một loài thực. Vấn đề này khá phức tạp kể từ khi Buchanan P.K.(1993), một nh à nấm học có uy tín ở New Zealand cho rằng chỉ nên chấp nhận danh pháp lo ài đầu. Trong khi đó Giáo sư Singer R. – nhà nấm học hàng đầu người Áo đã khẳng định tính hợp luật danh pháp của lo ài sau (1986). Chúng tôi đã phân tích vấn đề này, và cho rằng có thể tồn tại cả hai lo ài và đầy là hiện tượng đồng danh (homonym) đặc biệt (L ê Xuân Thám & Trần Hữu Độ, 1999). V ì lẽ đơn giản là trong các mô tả chuẩn thì loài đầu được xác định là có vòng bao, h ệ sợi lưỡng dạng và loài sau không có vòng, h ệ sợi đơn nhất. Tuy nhiên không có sự nhất quán giữa các tác giả, v à kết quả là sự nhận định phân loại không rõ ràng. . I.1. Nấm bào ngư trơn Pleurotus sajor-caju (Fr.) Sing., Loài có giá trị đặc sắc Pleurotus sajor-caju được tìm thấy và nuôi trồng lần đầu tiên bởi một học giả Ấn Độ tên là Jandaik (1974), dư ới chân núi Himalaya, sau đó lan qua khắp Trung Hoa, Ấn độ, toàn Châu Á, Australia, châu Âu, châu M ỹ,… hiện nay taxon này còn gây tranh cãi v ề nhiêu vị trí hệ thống và giới hạn loài. Cho đến nay chưa có mô tả nguyên mẫu Việt Nam, mặc dù nhiều cơ sở đã nuôi trồng rộng rãi, và nhìn chung còn quan điểm hạn chế chỉ chấp nhận tồn tại nấm dai v òng Lentinus sajor- caju (Fr.) Fr., nghĩa là không chấp nhận hệ thống đ ược coi là chuẩn mực của Singer (1986), trong đó n ấm bào ngư trơn Pleurotus sajor-caju (Fr.) Sing. đã được khẳng định rõ ràng, mà nhiêu tác giả gần đây tán đồng (Bao et al., 2003). Các mô tả mẫu tự nhi ên thu được của chúng tôi tại Cát Ti ên có thể coi như xác nhận quan điểm hệ thống của R. Sing (1986) trong trư ờng hợp loài đặc biệt này (và tách biệt rõ với P.pulmonarius (Fr.) Quél.). Thường mọc rất mạnh sau những c ơn mưa đầu mùa, tập trung thành đám trên thân gốc cây gỗ lá rộng rừng hỗn giao. Trong các nghi ên cứu nuôi trồng đều LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP SVTH: Hoàng Hoài Sơn, 2007 - 3 - không có mô tả về vòng nấm. Các giống chúng tôi nhận từ Đại học Chiba, v à viện công nghệ lên men Osaka, Nh ật Bản, khi nuôi trồng cũng đều không có v òng nấm. I.2. Nấm dai vòng Lentinus sajor-caju (Fr.) Fr., Epicrisis: 393 (1838 ) Đây là một trong những lo ài phổ biến thường gặp nhất trong các v ùng xích đạo nam Phi (ở tây Phi hiếm gặp h ơn), trong các rừng nhiệt đới cổ khắp Đông Nam Á, góc đông bắc Australia. Song đáng ngạc nhi ên là có tới 26 lần chỉnh lý danh pháp : Agaricus sajor-caju Fr., Syst. Mycol. 1: 175 (1821) - Rumpf., Herb. Amboin. 6: 125, pl. 56/1 (1750). Lentinus exilis Klotzsch ex Fr., Syn. Gen. Lent.: 10 (1836). L. dactyliophorus Leùv., Ann. Sci. Nat., Bot. seùr. 3,2: 174 (1844). L. tanghiniae Leùv., loc. cit. seùr. 3,5: 119 (1846). L. stenophyllus H.W. Reichardt, Verh. Zool. -bot. Ges., Wien 16: 375 (1866), non Berk. (1847). L. nicobarensis H.W. Reichardt apud Fenzl, Reise Oesterreich. Freg. Novara, Bot, 1: 143, pl. 23/1 (1870). L. irregularis Currey in Trans. Linn. Soc., Bot. ser. 2,1: 121, pl. 19/14 -15 (1876). L. grandulosus Ces., Atti Acc. Sci. fisich. matem. Napoli 8: 3 (1879), non P. Henn. (1900). L. murrayi Kalchbr. & MacOwan apud Kalchbr., Grevillea 9: 136 (1881). L. woodii Kalchbr., loc. cit. L. tenuis Sacc. & Paoletti, Atti R. Ist. Venet. Sci., Lett. ed Arti ser. 6,6: 392, pl. 5/3 (1888). L. bonii Pat., Bull. Soc. Mycol. Fr. 8: 48 (1892). L. bukobensis P. Henn. in Engl. Bot. Jahrb. 17: 32 (1893). L. annulifer Seynes, Rech. Champ. Con go Fr.: 25 (1897). Panus exilis (Klotzsch ex Fr.) Bres., Bull. Soc. Bot. Belg. 38: 153 (1899). L. inopus ‘Leùv.’, Petrak, Mycoth. Gen. No. 437 (1912). L. macgregorii Graff, Philipp. Journ. Sci., Bot. 9: 241 (1914). L. elmerianus Lloyd, Mycol. Writ. 7: 1106, pl. 187/2021 (1922). L. nigroglabratus Lloyd, loc. cit.: 1198, pl. 244/2448 (1923). Armillaria dactyliophora (Leùv.) Beeli, Bull. Soc. Bot. Belg. 59: 110 (1927). L. sajor-caju var. densifolius Pilaùt, Ann. Mycol. 34: 128 (1936). L. sajor-caju var. sparsifolius Pilaùt, loc. cit. L. sajor-caju var. medius Pilaùt, loc. cit. Panus dactyliophorus (Leùv.) Singer, Sydowia 5: 462 (1951). Pleurotus sajor-caju (Fr.) Singer, Lilloa 22: 27 (19 51). Pleurotus geesteranus Singer, Sydowia 15: 45 (1961). LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP SVTH: Hoàng Hoài Sơn, 2007 - 4 - Ở miền nam nước ta người ta hay gọi loài này là nấm dai, thực ra l à cũng để chỉ chất nấm kiểu bì dai mềm (coriaceous, leathery), bao h àm một số loài khác nữa thuộc chi Lentinus và Pleurotus,… do vậy chúng tôi chọn nấm dai v òng để phân biệt và cũng để nhấn mạnh đặc điểm có v òng nấm rất đặc sắc. Letinus sajor-caju phân bố ở rất nhiều vùng và các nước: Trung Quốc, Hồng Kông, Nepal, Ấn Độ, Sri Lanka, Myanmar, đảo Andaman, Nicobar, bán đảo Malay, Singapore, Thailand, kh ắp Việt Nam (núi Ba V ì từ 1888), Java, Sarawak, Brunei, Camerroons, Sabah, Sulawesi, Philippines, Australia, qu ần đảo Salamon, Bờ Biển Ng à, Nigeria, Cộng hòa Trung Phi, Zaire, Gabon, Burundi, Uganda, Kenya, Tanzania, Zanzibar, Mozambique, Malawi, Angola, Madagascar, qu ần đảo Comoro, Seychelle, Maurtius, Resunion, C ộng hòa Nam Phi, tuy được coi trọng nh ư nguồn thực phẩm song loài nấm dai vòng Lentinus sajor-caju (Fr.) Fr. hầu như chưa có tư liệu nuôi trồng thương mại (mới có ở Ấn Độ, Đài Loan, Việt Nam). Chúng tôi đ ã tách được giống nguyên chủng của Việt Nam, chuẩn bị cho những nghi ên cứu sâu về công nghệ v à sinh học phân tử so sánh. Điều lý thú l à cho đến nay tư liệu về nuôi trồng th ương mại và nghiên cứu sinh học dược học chỉ tập trung cho nấm b ào ngư Pleurotus sajor -caju (Fr.) Sing., ăn rất ngon và rất phổ biến (Zhuang et al., 1993) – loài không có vòng n ấm, mặc dù chưa được đồng thuận coi l à loài độc lập, và những tranh luận về danh pháp v à phạm trù hai loài này v ẫn còn đang tiếp diễn: chúng n ên là hai loài riêng bi ệt hay không? Có lẽ nên nhận định rằng đây l à hai loài đồng danh về tính ngữ lo ài (epithet homonym). Có thể dùng làm thực phẩm khi nấm con non (theo Patouillard, 1889), v à khi thể quả non cấu tạo hệ sợi đơn nhất (monomitic) tồn tại nổi trội, chất nấm mềm, khá giống với L. concavus, L striatulus, dễ gây lầm lẫn với các lo ài nấm bào ngư Pleurotus. Điều này có ý nghĩa rằng quan hệ chủng loại phát sinh của các nhóm Pleurotus, Lentinus, Lentinula, Neol entinus, Panus là rất gần nhau, và kể cả với Polyporus nữa (Hibbett & Vilgalys, 1993, Neda & Nakai, 1995). Tuy nhiên, theo đó chúng ta c ũng LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP SVTH: Hoàng Hoài Sơn, 2007 - 5 - nhận thấy L.sajor-caju có vị trí tách biệt xa h ơn với nhóm các loài Pleurotus, và rất gần gũi với các nhóm lo ài Lentinus và Polyprus . Phyllotopsis nidulans Lentinula edodes 0 0.01 . . . Pleurotus cornucopiae - Pl. tuberregium, Pl. abalonus Neolentinus lepideus Pl. dryinus Pl. ostreatus Neolentinus adhaerens length significantly positive P < 0.01 Panus lecomtei Auricularia polytricha Panus fulvus Panus fulvus var. similis Panus johorensis Polyporus tuberaster Lentinus concinnus Lentinus - Lentinus squarrosulus , L. sajor-caju, Po. arcularius suavissimus Polyporus squamosus Hình 4. Quan h ệ chủng loại phát sinh giữa Lentinus sajor-caju và các nhóm gần gũi (Dẫn liệu 18S rDNA sequence: Neda & Nakai, 1995) . 2007 - iii - Do đó, trong đề tài Nghiên cứu nấm Bào ngư trơn hoang d ại Pleurotus sajor- caju và nấm dai vòng Lentinus sajor- caju phát hiện ở Vườn quốc gia Cát Ti ên – hiện tượng đồng danh l. Lentinus sajor- caju và Pleurotus sajor- caju Ở nhiều nơi và cả Việt nam, thường vẫn lẫn lộn cho rằng chỉ có một lo ài: nấm dai vòng Lentinus sajor- caju là chuẩn danh pháp, còn khái niệm nấm bào ngư trơn Pleurotus. 2,2 7,5 – 8,7 345 – 367 - nt - P. sajor- caju 9,9 – 26,6 50,7 – 54,4 2 – 7,7 10,3 – 17,5 300 – 337 El-Kattan & al(1991) P. florida 8,7 – 37,2 56,6 – 58 1,7 – 5,8 9 – 14,5 265 – 336 - nt - Nấm