TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN *** KIỀU NGỌC BÍCH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU CÁC ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ KHẢ NĂNG SINH CELLULASE CAO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS PHƢƠNG PHÚ CÔNG HÀ NỘI, 2012 LỜI CẢM ƠN Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phương Phú Công định hướng ý tưởng nghiên cứu, tận tình hướng dẫn nghiên cứu, sửa luận văn để em hoàn thành luận văn Em xin chân thành cảm ơn Ths Nguyễn Khắc Thanh - trưởng phòng Vi Sinh Vật trường ĐH Sư Phạm Hà Nội 2, PGS TS Đinh Thị Kim Nhung tập thể cán phòng Vi Sinh Vật trường ĐH Sư Phạm Hà Nội tận tình hướng dẫn thí nghiệm, thường xun bảo kiến thức chun mơn, sửa luận văn tạo điều kiện tốt giúp em học tập rèn luyện suốt trình thực khóa luận tốt nghiệp đại học Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo khoa Sinh trường ĐH Sư Phạm Hà Nội giảng dạy tạo điều kiện chu đáo cho em suốt q trình học tập hồn thành khóa luận Bên cạnh đó, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè người thân động viên giúp đỡ em suốt trình học tập để em có kết ngày hơm Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ q báu ! Hà Nội, tháng 05 năm 2012 Sinh Viên Kiều Ngọc Bích LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết thu khóa luận trung thực, chưa cơng bố cơng trình khoa học Nếu sai tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm Hà Nội, tháng 05 năm 2012 Sinh Viên Kiều Ngọc Bích DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ BẢNG TRONG LUẬN VĂN DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Các dạng Hyphomycetes Hình 1.2 Giá sinh bào tử Coelomycetes Hình 1.3 Cấu tạo Coelomycetes Hình 1.4 Các kiểu phát sinh bào tử trần Hình 1.5 Các kiểu phát triển bào tử trần Hình 1.6 Các dạng phát triển tế bào sinh bào tử trần Hình 1.7 Cuống sinh bào tử trần Hình 1.8 Các dạng cuống sinh bào tử trần đặc biệt Hình 1.9 Một số hình dạng bào tử trần Hình 1.10 Các hình dạng khác bào tử Hình 1.11 Chi Penicillium Link ex Fries Các thành phần chổi (bộ máy mang bào tử trần) Hình 1.12 Cấu tạo quan sinh bào tử trần Aspergillus Hình 1.13 Cấu tạo khuẩn ti quan sinh bào tử trần Penicillium Hình 14 Cấu trúc khơng gian cellulose Hình 1.15 Cấu trúc khơng gian CMC Hình3.1 Hoạt tính cellulase chủng mạnh Hình 3.2 Một số đặc điểm hình thái chủng M 4V Hình 3.3 Một số đặc điểm hình thái chủng M 151 Hình 3.4 Một số đặc điểm hình thái chủng M 251 DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1 Kết đặc điểm chủng nấm mốc phân lập Bảng 3.2 Kết thử hoạt tính 25 chúng nấm mốc phân lập CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT CBH : Cellobiohydrolase CMC : Cacboxyl methyl cellulose CMC –ase : cacboxylmethylcellulase CS : Cộng E1 : Exoglucanase E2 : Endoglucanase UV : Tia cực tím A.glaucus : Aspergillus glaucus A.restricus : Aspergillus restricus A.cervinus : Aspergillus cervinus A.ornatus : Aspergillus ornatus A.nidulans : Aspergillus nidulans A.versicolor : Aspergillus versicolor Austus : Aspergillus ustus A.flavipes : Aspergillus flavipes A.wentii : Aspergillus wentii A.flavus : Aspergillus flavus A.niger : Aspergillus niger A.ocharaceus : Aspergillus ocharaceus A sparsus : Aspergillus sparsus A cremeus : Aspergillus cremeus A candidus : Aspergillus candidus H1 : Hình VSV : Vi sinh vật MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 Lý chọn đề tài Mục đích đề tài Nội dung đề tài Ý nghĩa khoa học đề tài Điểm đề tài .3 NỘI DUNG CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cương nấm mốc 1.1.1 Nấm bất toàn (Deuteromycetes) .4 1.1.1.1 Hyphomycetes 1.1.1.2 Coelomycetes 1.1.1.3 Agonomycetes 1.1.2 Các kiểu phát triển bào tử trần phát sinh bào tử dạng nảy chồi .8 1.1.3 Sự phát triển tế bào sinh bào tử trần 1.1.4 Cuống sinh bào tử trần 1.1.5 Bào tử trần 10 1.2 Chi Aspergillus Micheli ex Fries 11 1.2.1 Tình hình nghiên cứu phân loại Aspergillus giới 11 1.2.2 Đặc điểm sinh học Aspergillus 15 1.3 Sơ lược Penicillium 17 1.4 Cellulose va cellulase 19 1.4.1 Celulose 19 1.4.2 Cellulase .21 1.4.3 Ứng dụng cellulase 1.4.3.1 Ứng dụng enzyme cellulase chế biến thực phẩm 22 1.4.3.2 Trong công nghệ sử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh 23 1.5 Các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose 24 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 26 2.1.1 Mẫu phân lập 26 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất dùng cho nghiên cứu .26 2.2 Môi trường 27 2.3 Phương pháp nghiên cứu .27 2.3.1 Phương pháp phân lập 27 2.3.1.1 Thu thập mẫu 27 2.3.1.2 Chuẩn bị môi trường phân lập bảo quản 27 2.3.1.3 Tiến hành phân lập 28 2.3.2 Phương pháp thử hoạt tính 30 2.3.2.1 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme phương pháp cấy chấm điểm 30 2.3.2.2 Xác định hoạt tính enzyme phương pháp khuếch tán môi trường thạch ( William, 1983) 30 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu định loại (Maren A Klich, 2002) 31 2.3.3.1 Phương pháp cấy chấm điểm chủng nấm mốc lên môi trường Crapek- Dox sở để nghiên cứu đặc điểm vĩ mô 31 2.3.3.2 Phương pháp cấy khối thạch để quan sát đặc điểm vi mô (Robert A Samson and Ellen S Hoekstra, Jens C Frisvad and Filtenborg, 1996) 31 2.3.4 Phương pháp quan sát đặc điểm phân loại 32 2.3.4.1 Quan sát đặc điểm vĩ mô sau mắt thường kính hiển vi soi .32 2.3.4.2 Quan sát đặc điểm vi mô kính hiển vi quang học chụp ảnh qua kính hiển vi ( Axioskop) .33 CHƢƠNG : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 1.1 Kết phân lập 34 1.2 Kết thử hoạt tính 35 1.3 Kết định loại sơ 37 1.3.1 Bản mô tả chủng M4V 37 1.3.2 Bản mô tả chủng M151 40 1.3.3 Bản mô tả chủng M251 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO .47 Từ mục, đất mùn, gỗ mục, rơm rạ mục thu từ huyện Mỹ Đức (Hà Nội), Tam Dương ( Vĩnh Phúc) chia làm mẫu tiến hành phân lập 50 hộp petri, quan sát ngày thu được 25 chủng nấm mốc Đặc điểm 25 chủng nấm mốc nghi bảng 3.1 Kết bảng 3.1 cho thấy: Trong mẫu khác phân bố nấm khác nhau, hai mẫu gỗ mục rơm mục thu nhiều chủng mốc so với mục đất mùn Kết cho thấy chủng nấm mốc Tam Dương ( Vĩnh Phúc), Mỹ Đức (Hà Nội) mà nghiên cứu đa dạng, có tiềm cho nhiều ứng dụng thực tế sản xuất enzym, xử lý nước thải, 3.2 Kết thử hoạt tính Nhằm kiểm tra khả sinh cellulase 25 chủng nấm mốc phân lập được, sử dụng phương phấp chấm điểm mơi trường Crapexdox có 1% CMC, sau ngày đo đường kính phân giải cellulase Kết thử hoạt tính thể bảng 3.2 34 Bảng 3.2 Kết thử hoạt tính 25 chúng nấm mốc phân lập đƣợc Mẫu Lá mục Gỗ mục Hoạt tính STT Chủng cellulase mốc D-d (cm) M1-51 1.7 M1-52 1.0 M1-61 0.6 M1-62 0.5 M1-9 0.6 M1-10 0.7 M2 -1 1.2 M2-3 0.5 M2-4 0.3 10 M2-51 1.9 11 M2 -52 1.2 12 M2-6 1.2 13 M2-7 0.6 14 M2-8 0.7 Mẫu Đất mùn Rơm mục STT Chủng mốc 15 M3-4 16 M3-8 17 M3-10 18 M4-1 19 M4-2 20 M4-3 21 M4 D 22 M4 XT 23 M4-V 24 M4 -7 25 M4- Hoạt tính cellulase D-d (cm) 0.5 0.8 0.5 1.4 0.5 0.4 1.0 0.4 2.0 0.6 0.6 Kết bảng 3.2 cho thấy: khả sinh tổng hợp cellulase chủng nấm mốc mẫu thu thập Tam Dương ( Vĩnh Phúc), Mỹ Đức ( Hà Nội ) đa dạng Trong mẫu rơm mục thu đa dạng chủng mốc Khả sinh tổng hợp cellulase mẫu, chủng khác không nhau, số 25 chủng có tới chủng đường kính phân giải cellulose lớn cm, 16 chủng cịn lại có đường kính phân giải cellulose nhỏ cm Trong có ba chủng có hoạt tính cellulase cao chủng M4-V có đường kính phân giải cm, chủng M2-51 đường kính phân giải 1,9 cm chủng M1-51 có đường kính phân giải 1,7 cm So sánh với nghiên cứu khác nước Lê Thị Hồng Nga (2005), Trịnh Đình Khá (2007) [6] ba chủng mà chúng tơi thu có hoạt tính cellulase cao Do chúng tơi chọn ba chủng để phục vụ cho nghiên cứu 35 M151 M251 M4V Hình 3.1 Hoạt tính cellulase chủng mạnh 3.3 Kết định loại sơ 3.3.1 Bản mô tả chủng M4V Bằng phương pháp nhận diện nấm mốc truyền thống (Maren A Klich, 2002), bước đầu xác định chủng M4V thuộc chi Penicillium có đặc điểm hình thái rât giống với đặc điểm hình thái chi Penicillium khóa phân loại Samson cs (1995) [25] Những đặc điểm hình thái chủng M4V miêu tả cụ thể sau: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Đường kính khuẩn lạc mơi trường Crapek – Dox sở: 35 mm sau ngày nuôi cấy Đặc điểm mặt trước khuẩn lạc: Khuẩn lạc có màu xanh lục giữa, rìa màu xám xanh Khuẩn lạc hình trứng thon dài Đặc điểm mặt sau khuẩn lạc : có màu nâu tối, khơng nhăn 36 Cấu tạo quan sinh sản vơ tính Giá bào tử trần (condiophore, tipe): phát triển hầu hết từ hệ sợi, khơng có nhánh mang 1-2 nhánh Nhánh có nhẵn Bào tử: Khi riêng rẽ, bào tử trần không màu màu nhạt tụ họp thành đám, thường có màu lục, vàng lục, lục xanh, lục xám, xám Các bào tử trần tạo thành chuỗi dài miệng thể bình, xếp thành chuỗi song song hay dạng cột Bơng nấm (conidial head): hình chổi Bọng đỉnh giá (vesicle): hình đế, bàn chang Bào tử trần (conidia): có hình ovan, cầu Các lớp thể bình (seriation): lưỡng tầng Cuống thể bình thành vịng 3-6 đỉnh giá bào tử trần đỉnh nhánh Hình thái khuẩn lạc Bào tử trần (X400) 37 Bào tử trần ( X1000) Bọng đỉnh giá ( X1000) Giá bào tử ( X100) Giá bào tử ( X1000) Bơng nấm ( X100) Bơng nấm ( X400) Hình 3.2 Một số đặc điểm hình thái chủng M 4V 38 3.3.2 Bản mô tả chủng M 151 Bằng phương pháp nhận diện nấm mốc truyền thống (Maren A Klich, 2002), bước đầu xác định chủng M 151 thuộc chi Aspergillus có đặc điểm hình thái giống với đặc điểm hình thái chi Aspergillus khóa phân loại Samson cs (1995) Những đặc điểm hình thái chủng M 151 miêu tả cụ thể sau: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Đường kính khuẩn lạc mơi trường Crapek – Dox sở 40mm sau ngày nuôi cấy Đặc điểm mặt trước khuẩn lạc: bào tử màu vàng hoa cau, vàng tươi, hệ sợi khí sinh tử trắng đến vàng nhạt Đặc điểm mặt sau khuẩn lạc: màu vàng tối, không nhăn Cấu tạo quan sinh sản vơ tính Giá bào tử trần (condiophore, tipe): không phân nhánh, ráp, thành dày, dài 1,5 đến cm Bơng nấm (conidial head): hình bán cầu, gần cầu Bọng đỉnh giá (vesicle): hình bán cầu, hình cầu Bào tử trần (conidia): có hình cầu Khối bào tử trần đỉnh bọng hình cầu, sau hình tia tỏa trịn tách thành cột, đơi có khối bào tử trần nhỏ màu nâu đen Các lớp thể bình (seriation ): đơn tầng bao phủ 70- 90%, Cuống thể bình lớn 39 Mặt trước khuẩn lạc Mặt sau khuẩn lạc Bông nấm ( X100) Bông nấm ( X400 ) Bông nấm ( X1000) Bọng đỉnh giá (X400) 40 ... Do tơi chọn đề tài “ Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu đặc điểm hình thái số chủng nấm mốc có khả sinh cellulase cao? ?? để nghiên cứu Mục đích đề tài 2.1 Phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc có khả tổng... hợp cellulase 2.2 Nghiên cứu số đặc điểm hình thái số chủng nấm mốc phân lập 2.3 Bước đầu phân loại sơ số chủng có hoạt tính cellulase cao Nội dung đề tài Phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc có khả. .. Nâng cao khả nghiên cứu đặc điểm phân loại số chủng nấm mốc có khả sinh cellulase Việt Nam 4.3 Tìm chủng nấm mốc thuộc danh mục an tồn sinh học có khả sinh cellulase cao nhằm ứng dụng có nghiên cứu