Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN VĂN TUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC THÁI NGUYÊN- 2009 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN VĂN TUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60. 42. 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Quyền Đình Thi Thực hiện tại: Viện Công nghệ Sinh học- Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN! Trƣớc hết tôi xin gửi lời cảm Sâu sắc tới TS. Quyền Đình Thi, Trƣởng phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Phó viện trƣởng Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn thí nghiệm, sửa luận văn và tạo mọi điều kiện về hoá chất cũng nhƣ trang thiết bị nghiên cứu để tôi hoàn thành luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học đã giúp đỡ tôi tận tình trong suốt quá trình làm luận văn. Tôi xin chân thành cảm ơn Khoa Sinh học, Khoa Sau đại học, trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên cùng các thầy cô giáo đã nhiệt tình giảng dạy và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khoá học. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Bộ môn Hoá- Sinh học, Ban chủ nhiệm khoa Khoa học Cơ bản, Trƣờng đại học Nông Lâm, Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi đi học. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những ngƣời thân trong gia đình và bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập. Thái Nguyên tháng 9 năm 2009 Học viên Nguyễn Văn Tuân Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CÁC CHỮ VIẾT TẮT APS Ammonium persulphate BSA Bovine serum albumin CMC Carboxyl methyl cellulose cs Cộng sự DNA Deoxyribonucleic acid DEAE Diethylaminoethyl ĐC Đối chứng EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid IU International unit kb Kilo base kDa Kilo Dalton LB Luria and Bertani M Marker Nxb Nhà xuất bản OD Optical density PCR Polymerase chain reaction rRNA Ribosome ribonucleic acid SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis TBE Tris base-Boric acid-EDTA TE Tris-EDTA v/v Volume/volume w/v Weight/volume Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 1.1 KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO-β-1,4-GLUCANASE 3 1.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI ENDO-β-1,4-GLUCANASE 4 1.2.1 Nguồn gốc 4 1.2.2 Phân loại 6 1.3 CẤU TRÚC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE 7 1.3.1 Cấu trúc bậc một 7 1.3.2 Cấu trúc không gian 9 1.3.3 Cấu trúc của trung tâm xúc tác và vùng liên kết cơ chất 9 1.4 CƠ CHẾ XÚC TÁC CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE 11 1.5 ỨNG DỤNG CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE 12 1.5.1 Trong công nghiệp thực phẩm 12 1.5.2 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc 13 1.5.3 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ 15 1.5.4 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy 15 1.5.5 Trong công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa 16 1.5.6 Trong công nghệ xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh 16 1.6 ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE 17 1.7 TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE 20 1.8 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN Ở VIỆT NAM 22 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 25 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 25 2.1.1 Chủng nấm 25 2.1.2 Thiết bị thí nghiệm 25 2.1.3 Hóa chất 26 2.1.4 Môi trƣờng 26 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.1.5 Dung dịch và đệm 27 2.2 PHƢƠNG PHÁP 28 2.2.1 Nuôi cấy vi sinh vật 28 2.2.2 Xác định hoạt tính endoglucanase 28 2.2.3 Khảo sát ảnh hƣởng của một số yếu tố lên khả năng sinh tổng hợp endoglucanase 30 2.2.4 Tinh sạch enzyme 32 2.2.5 Điện di SDS-PAGE 33 2.2.6 Xác định tính chất lý hóa của endoglucanase 34 2.2.7 Xác định hàm lƣợng protein tổng số 35 2.2.8 Các phƣơng pháp sinh học phân tử 36 2.2.9 Xử lý số liệu 41 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42 3.1 TUYỂN CHỌN VÀ PHÂN LOẠI CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE CAO 42 3.1.1 Tuyển chọn 42 3.1.2 Phân loại chủng nấm sợi dựa vào phân đoạn gene 28S rRNA 43 3.2 TỐI ƢU CÁC ĐIỀU KIỆN SINH TỔNG HỢP ENDOGLUCANASE 45 3.2.1 Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian 45 3.2.2 Nhiệt độ nuôi cấy 47 3.2.3 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất cảm ứng 48 3.2.4 Ảnh hƣởng của nguồn carbon và nồng độ nguồn carbon 50 3.2.5 Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen và nồng độ nguồn nitrogen 52 3.2.6 pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu 54 3.3 TINH SẠCH ENDOGLUCANASE 55 3.3.1 Tinh sạch qua cột sắc ký lọc gel sephadex G-100 55 3.3.2 Tinh sạch qua cột sắc ký trao đổi ion DEAE 56 3.4 NHỮNG TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDOGLUCANASE 57 3.4.1 Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất 57 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.4.2 Nhiệt độ phản ứng tối ƣu 58 3.4.3 pH phản ứng tối ƣu 60 3.4.4 Độ bền nhiệt độ 61 3.4.5 Độ bền pH 63 3.4.6 Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ 64 3.4.7 Ảnh hƣởng của ion kim loại 65 3.4.8 Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa 67 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 71 PHỤ LỤC 79 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Các thiết bị chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 25 Bảng 2.2. Danh sách hóa chất chính đƣợc sử dụng trong thí nghiệm 26 Bảng 2.3. Danh sách dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm 27 Bảng 2.4. Thành phần gel điện di biến tính protein 33 Bảng 3.1. Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A. awamori 43 Bảng 3.2. Trình tự nucleotide đoạn gene 28S rRNA chủng A. awamori VTCC-F-099 79 Bảng 3.3. Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian 79 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy 80 Bảng 3.5. Ảnh hƣởng nồng độ cơ chất cảm ứng 80 Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của nguồn carbon 50 Bảng 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ lõi ngô 80 Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của nguồn nitrogen 52 Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của nồng độ ammonium acetate 81 Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy ban đầu 81 Bảng 3.11. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột Sephadex G-100 81 Bảng 3.12. Hoạt tính endoglucanase các phân đoạn qua cột sắc ký DEAE 82 Bảng 3.13. Tóm tắt quá trình tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 57 Bảng 3.14. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính endoglucanase 82 Bảng 3.15. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng đến hoạt tính endoglucanase 82 Bảng 3.16. Ảnh hƣởng của pH hỗn hợp phản ứng đến hoạt tính endoglucanase 83 Bảng 3.17. Độ bền nhiệt độ của endoglucanase 83 Bảng 3.18. Độ bền pH của endoglucanase 84 Bảng 3.19. Độ bền pH theo thời gian của endoglucanase 85 Bảng 3.20. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ đến hoạt tính endoglucanase 86 Bảng 3.21. Ảnh hƣởng của ion kim loại 66 Bảng 3.22. Ảnh hƣởng của một số chất tẩy rửa đến hoạt tính endoglucanase 86 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Sơ đồ thủy phân liên kết -1,4-O-glucoside của cellulase 3 Hình 1.2. Trình tự amino acid tƣơng ứng với cấu trúc bậc 2 của Cel12A từ một số chủng vi sinh vật 8 Hình 1.3. Mô hình cấu trúc không gian (A); Sơ đồ trung tâm xúc tác (B) của Cel12A từ H. grisea 9 Hình 1.4. Cấu trúc vùng CBD của Cel12A từ Humicola grisea 10 Hình 1.5. Cơ chế thủy phân phân tử cellulose (A) và phức hệ cellulose (B) của các enzyme thuộc phức hệ cellulase 11 Hình 2.1. Đƣờng chuẩn nồng độ glucose 30 Hình 2.2. Quy trình tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 . 33 Hình 2.3. Đƣờng chuẩn Bradford dùng BSA làm chuẩn 36 Hình 3.1. Hoạt tính endoglucanase của 26 chủng A. awamori nghiên cứu 42 Hình 3.2. Điện di đồ DNA tổng số (A); Sản phẩm PCR (B): với khuôn DNA tách chiết từ chủng A. awamori VTCC-F-099; Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp bằng XbaI và XhoI (C). 44 Hình 3.3. Cây phân loại chủng A. awamori VTCC-F-099 45 Hình 3.4. Khả năng sinh tổng hợp endoglucanase theo thời gian của chủng A. awamori VTCC-F-099 46 Hình 3.5. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 48 Hình 3.6. Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 49 Hình 3.7. Ảnh hƣởng của nồng độ lõi ngô đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 51 Hình 3.8. Ảnh hƣởng của nồng độ ammonium acetate đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 53 Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.9. Ảnh hƣởng của pH môi trƣờng nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp endoglucanase của chủng A. awamori VTCC-F-099 54 Hình 3.10. Điện di đồ trên gel polyacrylamide sản phẩm tinh sạch endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 qua cột Sephadex G-100 56 Hình 3.11. Điện di đồ sản phẩm tinh sạch endoglucanase trên gel polyacrylamide 57 Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nồng độ cơ chất lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 58 Hình 3.13. Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 60 Hình 3.14. Ảnh hƣởng của pH phản ứng lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 61 Hình 3.15. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên độ bền endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 62 Hình 3.16. Ảnh hƣởng của pH tới độ bền endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 63 Hình 3.17. Ảnh hƣởng của pH tới độ bền endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099 theo thời gian 64 Hình 3.18. Ảnh hƣởng của dung môi hữu cơ lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099. 65 Hình 3.19. Ảnh hƣởng của chất tẩy rửa lên hoạt tính endoglucanase từ chủng A. awamori VTCC-F-099. 68 [...]... enzyme nhƣ endo-β-1,4-glucanase là rất phong phú Xuất phát từ những lý do Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 http://www.lrc-tnu.edu.vn trên và tình hình nghiên cứu tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và đánh giá tính chất lý hóa của endo-β-1,4glucanase” với các mục tiêu: (1) Tuyển chọn... (1) Tuyển chọn các chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase cao và tìm môi trƣờng nuôi cấy thích hợp để tạo endo-β-1,4-glucanase ngoại bào, (2) Tinh sạch đƣợc endo-β-1,4glucanase và đánh giá một số tính chất lý hóa của nó Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 http://www.lrc-tnu.edu.vn 2 CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 KHÁI NIỆM VỀ CELLULASE VÀ ENDO-β-1,4-GLUCANASE. .. cellulose Nghiên cứu của Tăng Thị Chính và cs (1999) cho thấy, nguồn carbon thích hợp cho sinh trƣởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải là glucose và CMC Nguồn carbon thích hợp cho sự sinh trƣởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng xạ khuẩn CD6-9 là tinh bột, chủng CD9-9 là CMC và saccharose, chủng CD5-12 là lactose [5]; các chủng Actinomyces griseus... với các chủng nấm mốc N1 và N2 sinh tổng hợp cellulase tối ƣu ở môi trƣờng có pH ban đầu là 4,5 và 5,5 [8]; các chủng A niger sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất trong khoảng pH môi trƣờng ban đầu từ 6,0-7,0 [19] Ngoài những yếu tố trên, tốc độ sinh trƣởng và khả năng sinh tổng hợp các loại enzyme của các vi sinh vật còn chịu sự tác động của nhiều yếu tố khác nhƣ: thời gian nuôi cấy, tốc độ lắc và sục... môi trƣờng nuôi cấy ban đầu: pH môi trƣờng ban đầu ảnh hƣởng quan trọng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi sinh vật Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà pH môi trƣờng ban đầu thích hợp là acid, trung tính hay kiềm Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase thích hợp với pH môi trƣờng ban đầu là 8,0 [5]; còn chủng xạ khuẩn Actinomyces griseus thích hợp với pH... tốc độ lắc và sục khí, lƣợng giống đƣợc tiếp vào ban đầu 2.7 TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính enzyme đạt mạnh nhất ở nhiệt độ, pH nhất định Độ bền đối với nhiệt độ và pH hay mức độ và tính chất chịu ảnh hƣởng của các chất tẩy rửa, dung môi hữu cơ hay ion kim loại cũng có sự khác nhau Ảnh hƣởng của nhiệt độ: vận tốc phản ứng do enzyme xúc... tốt nhất cho sinh trƣởng và sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi khuẩn nghiên cứu là glucose và CMC; nguồn nitrogen là peptone và cao nấm men Các tác giả cũng đã nghiên cứu động thái của quá trình sinh tổng hợp cellulase và kết quả cho thấy, thời gian tích lũy cao nhất ở 48 giờ lên men [5] Nguyễn Đức Lƣợng và cs (1999) đã tiến hành nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp cellulase của Actinomyces griseus... cellulase của Trichoderma harzianum, từ đó ứng dụng sản xuất thuốc bảo vệ thực vật sinh học [6] 2.6 ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE Trong tự nhiên, đa số các loài vi sinh vật sống hoại sinh, phân giải các nguồn hợp chất hữu cơ có sẵn trong môi trƣờng thành các chất dinh dƣỡng cần thiết cho quá trình sinh trƣởng và phát triển của mình Khả năng Số hóa bới... nghiên cứu của Gao và cs (2008), endoglucanase từ A terreus M11 bị giảm 77% hoạt tính khi ủ với Hg2+ (2 mM), 59% khi ủ với Cu2+ (2 mM) [29] Số hóa bới Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 http://www.lrc-tnu.edu.vn Ngoài ra, các dung môi hữu cơ, các chất tẩy rửa cũng ảnh hƣởng mạnh mẽ đến hoạt tính của enzyme Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng nhƣ bản chất của enzyme mà tính chất và mức... có khả năng sinh trƣởng và phát triển tốt ở nhiệt độ cao trên 50C Khi nghiên cứu các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải cho thấy, các chủng này sinh tổng hợp cellulase mạnh nhất ở điều kiện nhiệt độ 45-55C và có thể chịu đƣợc nhiệt độ 65-80C [5] Nghiên cứu của Nguyễn Lan Hƣơng và cs (2003) cũng cho thấy, các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn ƣa nhiệt sinh tổng hợp cellulase . tài: Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus awamori sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase và đánh giá tính chất lý hóa của endo-β-1,4- glucanase” với các mục tiêu: (1) Tuyển chọn các chủng Aspergillus. NGUYỄN VĂN TUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS AWAMORI SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm. ASPERGILLUS AWAMORI SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ ĐÁNH GIÁ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENDO-β-1,4-GLUCANASE LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC THÁI NGUYÊN- 2009 Số hóa bới