Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM 0o0 LÊ TIẾN NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN (D-LOOP) HỆ GEN TY THỂ CỦA GÀ RI, GÀ ĐÔNG TẢO VÀ GÀ TRE LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM 0o0 LÊ TIẾN NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN (D-LOOP) HỆ GEN TY THỂ CỦA GÀ RI, GÀ ĐÔNG TẢO VÀ GÀ TRE Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nông Văn Hải Thái Nguyên - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc công bố trong bất kỳ một công trình nào. Tác giả luận văn Lê Tiến Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Nông Văn Hải đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Đăng Tôn, KS. Vũ Hải Chi, CN. Địch Thị Kim Hƣơng và tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Đề tài đƣợc hỗ trợ kinh phí từ đề tài nhánh thuộc đề tài "Xác định sự sai khác di truyền của các giống gà nội" do PGS. TS. Lê Thị Thuý, Viện Chăn nuôi, Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn làm chủ nhiệm. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sinh - KTNN và các thầy cô cán bộ khoa Sinh - KTNN đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn. Tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn. Tác giả luận văn Lê Tiến Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU…………………………………………………………… 01 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………… ………. 04 1.1. SƠ LƢỢC VỀ NGUỒN GỐC VÀ VỊ TRÍ PHÂN LOẠI GÀ NHÀ 04 1.2. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU……. 06 1.2.1. Gà Ri………………………………………………………………. 06 1.2.2. Gà Đông Tảo (Ðông Cảo)…………………….……………… … 07 1.2.3. Gà Tre…………………………………………………………… 08 1.3. ĐẶC ĐIỂM HỆ GEN TY THỂ VÀ VAI TRÒ CỦA D-LOOP TRONG ĐỊNH LOẠI GÀ………… …………………………… … 08 1.3.1. Ty thể và đặc điểm cấu trúc, cơ chế di truyền hệ gen ty thể gà… 08 1.3.1.1. Đặc điểm cấu trúc ty thể……………………………… ……… 08 1.3.1.2. Cấu trúc hệ gen ty thể gà………………… …………… 09 1.3.1.3. Cơ chế di truyền của mtDNA………… ………….……….….… 13 1.3.2. Cấu trúc và vai trò của vùng D-loop trong đánh giá đa dạng di truyền ……………………………… …………… 14 1.4. MỘT SỐ THÀNH TỰU VỀ ĐỊNH LOẠI PHÂN TỬ DỰA TRÊN GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG D-LOOP TY THỂ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM…………………… …………………………… ……. 16 1.4.1. Các nghiên cứu trên thế giới………………………………….…. 16 1.4.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam…………………………………… 20 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1. VẬT LIỆU VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 22 2.1.1. Nguyên liệu 22 2.1.2. Thiết bị 22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.1.3. Hoá chất 23 2.1.4. Địa điểm nghiên cứu……………………………………….…… 23 2.2. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…… ………………….…… 24 2.2.1. Điện di trên gel agarose………… ………………………….…… 24 2.2.2. Khuếch đại vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)………………… …… … ………………… … 26 2.2.3. Tinh sạch sản phẩm PCR…… ……….………… ……….… 28 2.2.4. Giải trình tự vùng D-loop…………………………….….………. 29 2.2.5. Phân tích dữ liệu bằng phần mềm chuyên dụng.……….……… 30 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN… ………………….………. 31 3.1. Nhân vùng D-loop bằng kỹ thuật PCR…… …………………… 31 3.2. Xác định và so sánh trình tự nucleotide của các mẫu nghiên cứu với trình tự chuẩn trên GenBank…… …………… …….… 36 3.3. Sự đồng nhất về trình tự nucleotide của 3 giống gà… …….……. 56 3.4. Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các giống gà nghiên cứu … 56 3.5. So sánh mức độ đa dạng di truyền của 3 giống gà nghiên cứu với một số quần thể gà châu Á…………… …………… … 58 3.6. Xây dựng cây phát sinh chủng loại…… ……………… ….……… 60 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62 CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO…… …… …………………… …………… 65 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NHƢ̃ NG CHỮ VIẾ T TẮ T ATP Adenosine triphosphate bp Base pair (cặ p bazơ) CJF Gà rừng Cyelon ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid dNTP Deoxynucleoside triphosphate DNase Deoxyribonuclease đtg Đồng tác giả EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid EtBr Ethidium bromide ETOH Ethanol GJF Gà rừng màu xám GrJF Gà rừng màu xanh mtDNA Hệ gen ty thể Nxb Nhà xuất bản PCR Polymerase Chain Reaction RJF Gà rừng đỏ RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease rpm Vòng/ phút TAE Tris – acetate – EDTA Tm Nhiệt độ biến tính Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 3.1. Thành phần phản ứng khuếch đại DNA………….…… …. 34 Bảng 3.2. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR……………………… 35 Bảng 3.3. Các điểm đa hình trong vùng D-loop của 3 giống gà nghiên cứu 51 Bảng 3.4. Sự phân bố của 71 mẫu gà nghiên cứu theo các kiểu đơn bội…………….…… ………………………………….…… 55 Bảng 3.5. Mối quan hệ di truyền giữa các giống gà nghiên cứu….……. 58 Bảng 3.6. So sánh mức độ đa dạng di truyền của gà Việt Nam với một số quần thể gà châu Á 59 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc của ty thể 09 Hình 1.2. Sơ đồ mtDNA gà………………………………………….…… 12 Hình 3.1. Ảnh điện di sản phẩm PCR của một số mẫu gà nghiên cứu……………….…………………………………………………… 35 Hình 3.2. So sánh trình tự vùng D-loop của 71 mẫu gà nghiên cứu với trình tự mang mã số GenBank AP003580 50 Hình 3.3. Hai đa hình phổ biến nhất của các mẫu nghiên cứu C197T và T426C………………………………………………………………… 52 Hình 3.4. Tỷ lệ % các kiểu thay thế nucleotide của 71 mẫu nghiên cứu……………………….………………………………………… …. 53 Hình 3.5. Tần số phân bố của các kiểu đơn bội vùng D-loop hệ gen ty thể 3 giống gà nghiên cứu……………………….…………… … 56 Hình 3.6. Cây phát sinh chủng loại của 3 giống gà nghiên cứu 60 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1 MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Gà nhà (Gallus gallus domesticus) là giống vật nuôi phổ biến nhất trên thế giới. Theo Tổ chức Lƣơng thực và Nông nghiệp Thế giới (FAO), số lƣợng gà trên toàn cầu năm 2007 ƣớc tính đạt khoảng 17 tỉ con, hơn một nửa trong số đó là ở châu Á. Đây là một trong những nguồn thực phẩm thiết yếu của con ngƣời, đặc biệt là ở những nƣớc đang phát triển, cung cấp gần nhƣ toàn bộ nhu cầu về thịt và trứng cho những vùng nông thôn hẻo lánh và khoảng 20% nhu cầu cho khu vực đô thị [31]. Ngoài mục đích làm thực phẩm, gà nhà còn đƣợc nuôi làm cảnh, chọi gà hay làm thuốc. Không những thế, gà còn là đối tƣợng đƣợc sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu y sinh [29], [59]. Trong ngành nông nghiệp nƣớc ta, chăn nuôi gà chiếm tới 72 - 73% tổng đàn gia cầm hàng năm. Năm 2006, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn đã xây dựng chiến lƣợc phát triển chăn nuôi gia cầm Việt Nam giai đoạn 2006 - 2015. Theo đó, ngành chăn nuôi phải phấn đấu đến năm 2015 tăng tỷ trọng thịt gia cầm lên 32% tổng sản lƣợng thịt các loại, trong đó sản lƣợng thịt gà chiếm 88% tổng đàn gia cầm, đạt 350 triệu con, khối lƣợng thịt 1.992.000 tấn, sản lƣợng trứng 9,236 tỷ quả [3]. Để đạt đƣợc mục tiêu trên thì cần thiết phải cải thiện nguồn con giống, đồng thời phải bảo tồn và phát triển những giống gia cầm quý của địa phƣơng. Ở nƣớc ta có 27 giống gà, trong đó có tới 16 giống gà nội. Các giống gà nội nhƣ gà Ri, gà Đông Tảo, gà H’Mông, gà Tre là các giống có phẩm chất thịt trứng thơm ngon, khả năng chịu đựng kham khổ, khả năng chống chịu bệnh tật cao, là nguồn gen quý và cần đƣợc đầu tƣ chọn tạo để nâng cao năng suất và dùng lai tạo với các giống khác để cải tiến năng suất, tạo con lai năng suất cao cung cấp con giống cho sản xuất [2], [3], [11]. Tuy nhiên, do truyền thống chăn nuôi nhỏ lẻ theo hộ gia đình, các giống gà này thƣờng đƣợc chăn thả tự do cùng với các giống gà nội khác ở các địa [...]... và nghiên cứu mối quan hệ di truyền và tiến hóa của các giống gà, trên cơ sở phân tích trình tự vùng điều khiển (D-loop), chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu đa hình trình tự vùng điều khiển (D-loop) hệ gen ty thể của gà Ri, gà Đông Tảo và gà Tre 2 Mục tiêu nghiên cứu Đề tài đƣợc tiến hành với mục tiêu chính nhƣ sau: Bƣớc đầu đánh giá đa dạng di truyền và mối quan hệ di truyền của 3 giống gà Ri,. .. [57] Hệ gen ty thể có hai vùng chức năng chính Vùng mã hóa chiếm tới 93% hệ gen ty thể, vùng còn lại đƣợc gọi là vùng D-loop (vùng siêu biến hay vùng điều khiển) không đƣợc dịch mã, chứa trình tự khởi đầu cho quá trình tái bản của chuỗi nặng và các trình tự điều khiển quá trình phiên mã của các gen trong vùng mã hóa Vùng D-loop có tốc độ tiến hóa nhanh hơn nhiều so với các vùng khác của hệ gen ty thể, ... với gà rừng G gallus Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng kỹ thuật PCR để nhân vùng điều khiển D-loop của 71 mẫu cá thể gà địa phƣơng Việt Nam thuộc 3 giống gà Ri, Đông Tảo và Tre (các cá thể này không bao gồm 40 cá thể gà Ri và gà Tre đã sử dụng trong nghiên cứu của Nguyễn Đăng Tôn và đtg), sau đó sản phẩm PCR sẽ đƣợc dùng để giải trình tự tự động Các số liệu đa hình thu đƣợc về vùng điều khiển. .. VÙNG D-LOOP TY THỂ TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM 1.4.1 Các nghiên cứu trên thế giới Kể từ năm 1990, khi trình tự toàn bộ hệ gen ty thể gà đƣợc công bố lần đầu tiên, việc nghiên cứu DNA ty thể gà đã và đang đƣợc phát triển tƣơng đối rộng rãi với hàng nghìn trình tự đƣợc đăng ký trên GenBank Trình tự hệ gen ty thể đã đƣợc sử dụng thành công trong việc xác định đa dạng di truyền của các quần thể gà trên thế... http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.4.2 Các nghiên cứu ở Việt Nam Ở Việt Nam, các nghiên cứu về hệ gen ty thể gà nói chung và vùng D-loop nói riêng còn rất ít, phần lớn mang tính cá thể và không đặc trƣng cho quần thể Mục đích chủ yếu của các nghiên cứu này là tìm hiểu đa hình trình tự nucleotide ở một vài cá thể Năm 1997, trình tự 641 nucleotide đầu tiên của vùng D-loop 3 mẫu gà Việt Nam (1 mẫu gà nhà và 2 mẫu gà rừng đỏ phân... quá trình thuần hóa và quan hệ di truyền của các giống gà Ở Việt Nam, việc giải mã hệ gen ty thể nhằm tìm hiểu mối quan hệ di truyền và tiến hóa giữa các giống gà vẫn còn là vấn đề mới Các nghiên cứu về hệ gen ty thể nói chung và vùng D-loop nói riêng còn rất ít, mang tính cá thể và không đặc trƣng cho quần thể Với mục đích góp phần vào việc giải mã hệ gen ty thể của các giống gà địa phƣơng Việt Nam và. .. giống gà Ri, Đông Tảo, Tre trên cơ sở phân tích trình tự vùng D-loop của 71 mẫu cá thể 3 Nội dung nghiên cứu Đề tài bao gồm các nội dung chính nhƣ sau: - Khuếch đại vùng D-loop của 71 mẫu thuộc 3 giống gà Ri, Đông Tảo và Tre - Xác định trình tự vùng D-loop - So sánh trình tự vùng D-loop với trình tự chuẩn đã đƣợc công bố trên GenBank, phát hiện các vị trí đa hình - Phân tích mối quan hệ di truyền giữa... năng biến đổi cao và vùng II là vùng trung tâm ít biến đổi [55] Vùng I nằm ở đầu 5' vùng điều khiển, kích thƣớc khoảng 400 bp, vùng này chứa chuỗi cytosine (C-stretch), đó là một chuỗi trình tự gồm toàn nucleotide cytosine; chuỗi C là đặc điểm đặc trƣng cho đầu 5' của vùng điều khiển hệ gen ty thể của nhiều họ trong lớp Chim Vùng I còn chứa trình tự kết thúc quá trình tái bản hệ gen ty thể (TAS) là hộp... quần thể [30], [34], [36], [49] Kể từ khi trình tự toàn bộ hệ gen ty thể gà đƣợc Desjardins và Morais (1990) công bố lần đầu tiên, việc nghiên cứu DNA ty thể gà đã và đang đƣợc phát triển tƣơng đối rộng rãi với hàng nghìn trình tự đƣợc đăng ký trên GenBank Trình tự hệ gen ty thể đã đƣợc sử dụng thành công trong việc xác định đa dạng di truyền của các quần thể gà trên thế giới [27], [41], [46], [52] Những... nổi bật: gà trống và mái nhỏ hơn gà Ri, con trống nặng 1,2 - 1,3 kg/ con, con mái nặng 0,8 - 0,9 kg/ con [2] Tập tính: hay bay và đậu trên hàng rào Nuôi làm cảnh Mỗi năm đẻ 5 - 7 lứa, mỗi lứa đẻ 8 - 10 quả/ mái [2] 1.3 ĐẶC ĐIỂM HỆ GEN TY THỂ VÀ VAI TRÒ CỦA D-LOOP TRONG ĐỊNH LOẠI GÀ 1.3.1 Ty thể và đặc điểm cấu trúc, cơ chế di truyền hệ gen ty thể gà 1.3.1.1 Đặc điểm cấu trúc ty thể Ty thể (hình 1.1) . giống gà, trên cơ sở phân tích trình tự vùng điều khiển (D-loop), chúng tôi tiến hành đề tài: Nghiên cứu đa hình trình tự vùng điều khiển (D-loop) hệ gen ty thể của gà Ri, gà Đông Tảo và gà Tre LÊ TIẾN NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN (D-LOOP) HỆ GEN TY THỂ CỦA GÀ RI, GÀ ĐÔNG TẢO VÀ GÀ TRE Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ. PHẠM 0o0 LÊ TIẾN NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN (D-LOOP) HỆ GEN TY THỂ CỦA GÀ RI, GÀ ĐÔNG TẢO VÀ GÀ TRE LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC